Name: localization, identification, and excision of murine adipose depots
Uploaded: 2014-12-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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The authors have no acknowledgements.

NOTA: Todos os procedimentos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso Animal Institucional (IACUC) da Universidade de Cincinnati, e de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health (NIH Publication Nenhum . 85-23, revista em 1996). 1. Eutanásia e esterilizar o mouse <ol><li> Posicione o mouse em um dropbox contendo uma dose supratheraputic de isoflurano e permitir a inalar para o efeito. Uma vez que o rato é sacrificado, retirar da caixa. </li><li> Cervicalmente deslocar como um segundo meio de eutanásia. </li><li> Esteriliza-se a superfície externa do rato, pela limpeza do animal com etanol a 70%. </li></ol> 2. Identificação e isolamento de três Depots adiposo Diferentes <ol><li> Brown tecido adiposo (BAT) Isolamento: <ol><li> Certifique-se que a pele está molhada do álcool de limpeza para ajudar na corte através da epiderme e da derme Layers. </li><li> Posicione o mouse em decúbito dorsal, com as costas contra a mesa. </li><li> Agarre a pele logo abaixo do diafragma com uma pinça, elevador e inciso com uma tesoura. </li><li> Cortado transversalmente em torno da circunferência do rato para expor o peritoneu. </li><li> Revele a BAT depósito em forma de borboleta por degloving a metade superior do mouse. Segure os apêndices inferiores e abdômen em uma mão e puxar a pele para cima em direção à cabeça. </li><li> Orientar o rato, de modo que fique posicionado em pronação na tabela. Tenha cuidado para não contaminar o depósito exposto com o cabelo. </li><li> Instrumentos cirúrgicos limpos e mudança para um novo par de luvas. </li><li> Localize as escápulas e depósito correspondente. Remova cuidadosamente qualquer adiposo branco superficial sobre a borboleta e depois dissecar a borboleta da gordura marrom interescapular. Tenha cuidado para evitar o músculo intimamente associada com a gordura marrom. NOTA: O uso de um microscópio de dissecação é recomendado para a remoção do white adiposo, bem como na separação do tecido adiposo castanho de as escápulas. </li><li> Remover depósito de gordura e transferir para um tubo de microcentrífuga de 2 ml. </li><li> Se o ARN ou proteína está a ser extraída, congelar o tecido por imersão em azoto líquido e armazenar a -80 ° C. Congelar a amostra ao mesmo tempo para evitar a degradação. Se a cultura, cobrir o tecido em DMEF-12 e definir sobre o gelo até que todas as amostras são coletadas para a cultura (informação suplementar). </li></ol></li><li> Isolamento de tecido adiposo subcutâneo (SQ), um branco tecido adiposo Depot (WAT): <ol><li> Coloque em um novo par de luvas para não contaminar entre depósitos de gordura. </li><li> Revelar o inguinal, depósitos SQ triangulares por De-gloving a metade inferior do mouse. Segure os apêndices superiores e tórax em uma mão e puxar a pele para baixo em direção aos pés com a outra mão. </li><li> Orientar o mouse em decúbito dorsal, tomando cuidado para não contaminar o depósito exposto com o cabelo. </li><li> Limpe surgicainstrumentos L e mudança para um novo par de luvas. </li><li> Dissecar cuidadosamente os triângulos de gordura SQ. Tenha cuidado para não contaminar a amostra com o músculo, vizinha de gordura, glândulas mamárias ou cortando os navios e contaminar a amostra de sangue. NOTA: O uso de um microscópio de dissecção é recomendado se as fronteiras não estão claramente definidos. </li><li> Remover os depósitos de gordura e transferir para tubos de microcentrífuga de 2 ml. </li><li> Se o ARN ou proteína está a ser extraída, congelar o tecido por imersão em azoto líquido e armazenar a -80 ° C. Congelar a amostra ao mesmo tempo para evitar a degradação. </li><li> Para a coloração, corrigir ou incorporar em outubro Se a cultura, cobrir o tecido em DMEF-12 e definir sobre o gelo até que todas as amostras são coletadas para a cultura (informação suplementar). </li></ol></li><li> Isolamento de gonadal Fat um Tissue Visceral adiposo (IVA) e branco tecido adiposo (WAT) Depot: <ol><li> Coloque em um novo par de luvas para não contaminar entre depósitos de gordura. </li><li> Com scissors, cortar transversalmente o peritoneu, directamente abaixo do diafragma. Corte o peritônio do diafragma até meados reto coronally para expor órgãos abdominais. </li><li> Localizar os testículos ou ovários e identificar o tecido adiposo branco em anexo, conhecido como o adiposo epididimal em machos ou fêmeas em adiposo gonadal. </li><li> Instrumentos cirúrgicos limpos e mudar para um novo par de luvas </li><li> Dissecar cuidadosamente ambos os depósitos de gordura do epidídimo dos testículos, epidídimos, e canais deferentes. Ou, se do sexo feminino, dissecar cuidadosamente ambas as pastilhas de gordura gonadal dos ovários. </li><li> Remover depósitos de gordura e transferi-los para 2 tubos ml de microcentrífuga. </li><li> Se o ARN ou proteína está a ser extraída, congelar o tecido por imersão em azoto líquido e armazenar a -80 ° C. Congelar a amostra ao mesmo tempo para evitar a degradação. </li><li> Para a coloração, corrigir ou incorporar em outubro Se a cultura, cobrir o tecido em DMEF-12 e definir sobre o gelo até que todas as amostras são coletadas para a cultura (informação suplementar). </li&gt; </ol></li></ol> 3. Isolamento de tecido adiposo perivascular (PVAT) <ol><li> O isolamento do coração: <ol><li> Coloque o mouse em uma posição supina com apêndices superiores e inferiores estendidos para fora. </li><li> Apêndices seguros usando fita cirúrgica. </li><li> Depois de posicionar o mouse como listado acima, criar tensão, levantando-se no apêndice xifóide com uma pinça. Corte horizontal através do diafragma, expondo a porção inferior da cavidade torácica. </li><li> Apesar de manter a tensão, levantando-a do apêndice xifóide, cortar a caixa torácica superiormente para a cabeça, apenas para o lado do esterno. </li><li> Pegue a caixa torácica apenas inferior à clavícula, e corte ao longo do comprimento inferior da clavícula em direção a axila em ambas as direções. A cavidade torácica e seu conteúdo (coração, pulmões, etc.) agora deve ser claramente visível. </li><li> Limpe a cavidade torácica do sangue alheio e fluido usando ga estérilUze para absorver o fluido. Se coleta órgãos ou vasos não se esqueça de profusa (informação suplementar). </li><li> Uma vez que a área está limpa de fluido, o corte dos vasos e brônquios correspondentes a remoção dos pulmões, o que permite uma melhor exposição do coração. </li></ol></li><li> Localização e Excisão da aorta perivascular tecido adiposo (PVAT): <ol><li> Remova os seguintes órgãos para melhor identificar as partes inferiores da aorta: fígado, estômago, baço, pâncreas, intestinos e cólon. </li><li> Primeiro começa com a identificação do estômago e do esôfago. Cortar o esófago na junção gastro-esofágica para libertar o estômago do corpo. </li><li> Em seguida, identificar os intestinos e do mesentério circundante. Cortar superficialmente através de mesentério, já que fica muito perto da porção renal da aorta, em seguida, &quot;executar o intestino.&quot; </li><li> Cortar o cólon libertar o mais próximo do recto quanto possível. Deste modo, libertando o estômago, intestino e cólon do rato. </li><li> Remover-se o estômago, intestino, cólon, pâncreas e baço, cortando através do mesentério de fixação e navios. O pâncreas e baço deve vir livre com o estômago, intestino e cólon. </li><li> Retire o fígado cortando as veias hepáticas e anexando mesentério, remova todos os lobos. </li><li> Cortar a camada visceral e gordura cercam os rins. Deixar os rins ligados à aorta in vivo para servir como marcadores geográficos para diferentes segmentos da aorta. </li><li> Lavar a área com 1x PBS estéril e remover todo o fluido por absorção com uma gaze estéril. </li><li> Usando micro-tesouras e micro-fórceps, separar a aorta do seu apego à espinha dorsal e ventral a sua fixação para o esôfago. </li><li> Isolar a aorta, seguindo e destacando a aorta do comprimento da aorta descendente a partir da origem no coração até a bifurcação na região ilíaca. </li><li> Identificar e isolar os vasos subclávia. Isolar esses naviosdesde o pescoço até a raiz aórtica para melhor expor a junção da raiz aórtica e no coração. </li><li> Remover o timo, em seguida, cortado a artéria inominada, a artéria carótida comum esquerda, e a artéria subclávia esquerda, permitindo o movimento do coração. </li><li> Com o auxílio de um microscópio de dissecação, visualizar o tecido adiposo (PVAT) camada perivascular ao redor da aorta. </li><li> Tomar muito cuidado para não beliscar ou apertar o PVAT, retire com cuidado o caminho PVAT da aorta com micro-fórceps. Suavemente cortar a ligação do PVAT à aorta com micro-tesouras começando na região torácica logo acima, onde o diafragma está localizado. NOTA: Um microscópio de dissecção é recomendada. </li><li> Repetir este processo de todo o comprimento da aorta, terminando na região da aorta infra-renal, a qual está localizada logo acima da bifurcação ilíaca do vaso aórtico. </li><li> Se arco aórtico PVAT é desejada, usou o mesmo método para remover o PVAT do menor curvature do arco. </li><li> Coloque as amostras PVAT em 2 ml de tubo (s) de microcentrífuga. </li><li> Se o ARN ou proteína está a ser extraída, congelar o tecido por imersão em azoto líquido e armazenar a -80 ° C. Congelar a amostra ao mesmo tempo para evitar a degradação. Se a cultura, cobrir o tecido em DMEF-12 e definir sobre o gelo até que todas as amostras são coletadas para a cultura (informação suplementar). NOTA: depósitos adiposos adicionais a considerar se estiver interessado em uma análise abrangente depósito adiposo incluem: retroperitoneal, mesentérica, omental, pericárdio e poplítea. </li></ol></li></ol>

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	<li>Ogden, C. L., Carroll, M. D., Kit, B. K., Flegal, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+obesity+in+the+United+States,+2009-2010.">Prevalence of obesity in the United States, 2009-2010.</a> NCHS Data Brief. 82, 1-8 (2012).</li><li>Flegal, K. M., Carroll, M. D., Kit, B. K., Ogden, C. 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Stem Cells. 6 (1), 33-42 (2014).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and.">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and.</a> 150 (2), 366-376 (2012).</li><li>Giralt, M., Villarroya, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White,+brown,+beige/brite:+different+adipose+cells+for+different+functions.">White, brown, beige/brite: different adipose cells for different functions.</a> Endocrinology. 154 (9), 2992-3000 (2013).</li><li>Casteilla, L., P&#233;nicaud, L., Cousin, B., Calise, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+an+adipose+tissue+depot+for+sampling:+factors+in+selection+and+depot+specificity.">Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity.</a> Methods Mol. Biol. 456, 23-38 (2008).</li><li>Grant, R., Youm, Y. H., Ravussin, A., Dixit, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+adipose+tissue+leukocytosis+in+obesity.">Quantification of adipose tissue leukocytosis in obesity.</a> Methods Mol. Biol. 1040, 195-209 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests or other conflicts of interest.

A obesidade pode levar a uma grande série de morbidades e o pleno entendimento do papel que desempenha adiposo não é totalmente compreendido; Por conseguinte, continua a pesquisa no campo da adiposo é necessário. Os modelos animais, especificamente modelos murinos são ideais para a pesquisa inicial na progressão de doenças e ensaios de tratamentos farmacêuticos potenciais. Na utilização destes modelos, o isolamento e a excisão precisa de depósitos de tecido adiposo é uma ferramenta extremamente importante ...

Adiposo fez uma aparição notável nos holofotes da mídia, devido ao aumento dramático da obesidade durante as últimas décadas do século 20. Obesidade afeta atualmente mais de um terço dos adultos e 17% das crianças e adolescentes nos Estados Unidos (EUA) 1. Abrangendo todos os grupos étnicos, a pesquisa estatística em torno da epidemia de obesidade tem mostrado que os negros não-hispânicos têm a maior taxa ajustada por idade de obesidade (49,5%) em comparação com os mexicanos-americanos (40,4%), todos os hispânicos (39,1%) e não- hispânicos (34,3%) 2. O efeito econômico da obesidade também é uma preocupação crescente para o sistema de saúde. Em 2012, estima-se que o custo médico anual de cuidados para a obesidade em os EUA em 2005 foi de 190,2 bilhões dólares, quase 21% do orçamento global da despesa médica. Infelizmente, a obesidade infantil foi estimada a ser responsável por US $ 14 bilhões em custos médicos diretos sozinho. Estatisticamente, determinou-se que a média de custo médico deindivíduos com obesidade foi de $ 2741 mais elevado de um ano do que aqueles sem esta morbidade 3-5. A obesidade é um importante fator de risco para uma variedade de condições, tais como: diabetes tipo 2, dislipidemia, doenças cardiovasculares, câncer, distúrbios osteo-musculares e inflamação crônica. A obesidade está profundamente ligada à patogênese da síndrome metabólica e outras doenças crônicas 6-8. Com tais conexões drásticas e negativas entre a obesidade e outras comorbidades, a investigação científica tem concentrado a atenção para entender melhor a atual epidemia e os papéis diversos e central desempenhado pelas adiposo. Historicamente, o tecido adiposo foi considerada irrelevante e foi visto apenas como um tecido de enchimento simples. Atualmente, adiposo foi mostrado para desempenhar vários papéis essenciais em função do corpo em: metabolismo, a regulação hormonal, inflamação, proteção e isolamento 9. O tecido adiposo é composto principalmente deadipócitos, mas também contém pericitos, células endoteliais, macrófagos e monócitos, células estaminais pluripotentes 8. O tecido adiposo é distribuído por todo o corpo em depósitos distintos. Os principais depósitos podem ser encontrados subdermicamente, por via subcutânea, intramuscular, e visceral 10. Depósitos adiposos demonstraram possuir perfis metabólicos específicos de depósito, os quais mostraram uma susceptibilidade específica depósito de obesidade e distúrbios relacionados 8. Tradicionalmente, o tecido adiposo foi classificado em dois tipos principais: o tecido adiposo branco (WAT) e tecido adiposo marrom (BAT); embora a literatura recente indica as presenças de um terceiro grupo batizado brite ou bege adiposo 11. O tecido adiposo foi mostrado para ter cores diferentes, as morfologias, funções metabólicas, características bioquímicas e padrões de expressão genética 10. Os adipócitos em WAT ter um único, grande gota lipídica e quantidades variáveis ​​de mitocôndrias. WATé predominantemente encontrado em localidades subcutâneas e viscerais do corpo. Funções WAT principalmente como um local de armazenamento de energia e proteção de órgãos. Os adipócitos em BAT têm uma morfologia multilocular e mitocôndrias abundantes. MTD está localizada principalmente no pescoço e grandes vasos sanguíneos do tórax, bem como as escápulas 12. MTD principalmente funções em comportamentos de gasto de energia que regulam a termogênese 7. Brite adiposo ou bege foi mostrado para partilhar uma morfologia e expressão análoga à MTD, mas foi encontrado para ser originado a partir de adipócitos brancos 11. O método cirúrgico descrito neste manuscrito fornece aos pesquisadores com a capacidade de analisar os diferentes efeitos que os fatores tais como: ambiente, produtos farmacêuticos, e genética, têm no tecido adiposo; bem como o adiposo papel benéfico ou prejudicial desempenha na doença e na saúde em geral. Além disso, proporcionar uma forma de identificar e isolar diferentes tipos de tecido adiposo parapermitir uma melhor compreensão das relações bioquímicas e diferenças entre depósitos. Isto pode ajudar a determinar a relação entre a localização, a função, e tipos de gordura dentro do corpo. Este método descrito faz isso, fornecendo os meios para visualização bruta, a análise de expressão gênica, análise de expressão de proteínas, exame histológico, e isolamento de linhas de células primárias para estudos in vitro. Atualmente, existem muitos artigos que fornecem insights sobre o comportamento metabólico dos diferentes depósitos adiposos, bem como suas localizações anatômicas; mas não fornecem um método em profundidade sobre como localizar especificamente, identificar e isolar esses depósitos. Este método fornece uma técnica cirúrgica precisa que permite o isolamento de vários depósitos, com uma quantidade mínima de dissecção e a contaminação em comparação com outros métodos concebidos para o isolado de um ou dois depósitos 13-14. O objetivo deste protocolo é o de proporcionarum método de precisão para a identificação e isolamento de diferentes tipos de depósitos de gordura a partir de várias localizações anatómicas.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Med-Vet International</td><td>#RXISO-250</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher</td><td>07-678-001</td><td></td></tr><tr><td>DMEF-12</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-6421</td><td>Warm in waterbath before putting on tissue.</td></tr><tr><td>2 ml Microcentrifuge tubes</td><td>Midsci</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr></tbody></table>

localization, identification, and excision of murine adipose depots

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Identificação e localização de tecido adiposo subcutâneo inguinal, adiposo castanho interescapular, adiposo epididimal visceral (Figura 1), bem como o tecido adiposo arco aórtico perivascular, adiposo da aorta torácica, adiposo supra-renal da aorta e do tecido adiposo da aorta infra-renal (Figura 2) foi alcançada com sucesso usando o método cirúrgico descrito. O exame histológico e diferenciação entre amostras MTD e Wat foram avaliados positivamente com Hematoxilina e Eosin...

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Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots

Devido à conexão drástica e negativa entre a obesidade e outras comorbidades, a investigação sobre o papel adiposo desempenha na doença e na saúde global é garantido. Apresenta-se um protocolo para o isolamento e a excisão de depósitos adiposos que permitam o estudo de tecido adiposo usando in situ e in vitro.

Localização, identificação e excisão de Depots Murino adiposo

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 ...

localization-identification-and-excision-of-murine-adipose-depots

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

40.9K visualizações.  University of Cincinnati College of Medicine.  Devido à conexão drástica e negativa entre a obesidade e outras comorbidades, a investigação sobre o papel adiposo desempenha na doença e na saúde global é garantido. Apresenta-se um protocolo para o isolamento e a excisão de depósitos adiposos que permitam o estudo de tecido adiposo usando in situ e in vitro. 

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Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

A separação imunomagnética Sca1 de gordura Depot-específica<sup&gt; alta</sup&gt; células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Biologia do Desenvolvimento

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome formulation, liposomes may be preferentially taken up by different cell types in the body. This may influence the efficacy of the therapeutic particle as progression of different diseases is tissue- and cell-type-specific. In this protocol, we present one method for synthesizing and fluorescently labeling liposomes using DSPC, cholesterol, and PEG-2000 DSPE and the lipid dye DiD as a fluorescent label. This protocol also presents an approach for delivering liposomes in vivo and assessing cell-specific uptake of liposomes using flow cytometry. This approach can be used to determine the types of cells that take up liposomes and quantify the distribution and proportion of liposome-uptake across cell types and tissues. While not mentioned in this protocol, additional assays such as immunofluorescence and single-cell fluorescence imaging on a cytometer will strengthen any findings or conclusions made as they permit assessment of intracellular staining. Protocols may also need to be adapted depending on the tissue(s) of interest.

The goal of this protocol is to synthesize fluorescently-labeled liposomes and use flow cytometry to identify in vivo localization of liposomes at a cellular level.

Preparação, Administração e Avaliação da Captação Celular Tecido-Específica In Vivo de Lipossomas Marcados com Corante Fluorescente

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

Bioengenharia

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute functionally to the expansion and remodeling of WAT in adulthood. A tremendous barrier to studying the implications of this cellular heterogeneity is the inability to readily isolate functionally distinct cell subpopulations from WAT SVF for in vitro and in vivo analyses. Single-cell sequencing technology has recently identified functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic PDGFR&#946;+ perivascular cell subpopulations in intra-abdominal WAT depots of adult mice. Fibro-inflammatory progenitors (termed, &#8220;FIPs&#8221;) are non-adipogenic collagen producing cells that can exert a pro-inflammatory phenotype. PDGFR&#946;+ adipocyte precursor cells (APCs) are highly adipogenic both in vitro and in vivo upon cell transplantation. Here, we describe multiple methods for the isolation of these stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal WAT depots. FIPs and APCs can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by taking advantage of biotinylated antibody-based immunomagnetic bead technology. Isolated cells can be used for molecular and functional analysis. Studying the functional properties of stromal cell subpopulation in isolation will expand our current knowledge of adipose tissue remodeling under physiological or pathological conditions on the cellular level.

This protocol describes the technical approach to isolate adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal white adipose tissue (WAT) depots by fluorescence-activated cell sorting or immunomagnetic bead separation.

Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

Imunologia e Infecção

Lymphatic and Blood Network Analysis During Obesity

Lymphatic collecting vessels and lymph nodes are inevitably embedded in adipose tissue. The physiological significance of this observation remains still not elucidated. However, obesity is characterized by impaired lymphatic function and increased vessel permeability. Inversely, lymphatic dysfunction induces obesity in mice, suggesting a significant interplay between lymphatic vessels and the adipose tissue. Therefore, understanding factors leading to lymphatic dysfunction might open new therapeutic windows to prevent obesity and associated comorbidities. The first step in this process requires a precise and detailed visualization of the lymphatic network in healthy and inflamed adipose tissue. Here, we describe a rapid, inexpensive, and efficient method that allows to label and analyze lymphatic and blood vessels. This approach takes advantage of the skin-draining brachial lymph node localization within the subcutaneous adipose tissue. The lymphatic arborization of this tissue can be revealed by injecting fluorochrome-conjugated lectins subcutaneously. Moreover, the in vivo labeling approach provides a way to evaluate lymphatic vessel density and functions. Coupled to blood vessel, adipocyte and immune cell staining, the protocol allows for high-resolution mapping of the subcutaneous adipose tissue by 3D imaging.

Obesity is a growing global public health issue. It has been previously associated with lymphatic dysfunction, suggesting a vital crosstalk between the adipose tissue and the lymphatic system. Here, we propose an accessible methodology allowing the distinct labeling of blood and lymphatic vasculatures within the subcutaneous adipose tissue.

Lymphatic collecting vessels and lymph nodes are inevitably embedded in adipose tissue. The physiological significance of this observation remains still ...

Medicina

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, uncoupling of metabolism to generate heat, and secretion of adipokines to regulate whole-body homeostasis and immune responses. Emerging research is identifying important regional differences in the developmental, molecular, and functional profiles of adipocytes located in discrete depots throughout the body. Different properties of the depots are medically relevant since metabolic diseases often demonstrate depot-specific effects. This protocol will provide investigators with a detailed anatomic atlas and dissection guide for the reproducible and accurate identification and excision of diverse mouse adipose tissues. Standardized dissection of discrete adipose depots will allow detailed comparisons of their molecular and metabolic characteristics and contributions to local and systemic pathologic states under various nutritional and environmental conditions.

Adipocytes exist in discrete depots and have diverse roles within their unique microenvironments. As regional differences in adipocyte character and function are uncovered, standardized identification and isolation of depots is crucial for advancement of the field. Herein, we present a detailed protocol for the excision of various mouse adipose depots.

Identificação e dissecção de diversos depósitos de Adipose de camundongo

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...

Biologia

Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone regulation, barrier functions, and angiogenesis. Endothelial cell dysfunction is a hallmark predictor and major driver for the progression of severe cardiovascular diseases, yet the underlying mechanisms remain poorly understood. The ability to isolate and perform analyses on endothelial cells from various vascular beds in their native form will give insight into the processes of cardiovascular disease. This protocol presents the procedure for the dissection of mouse subcutaneous and mesenteric adipose tissues, followed by isolation of their respective arterial vasculature. The isolated arteries are then digested using a specific cocktail of digestive enzymes focused on liberating functionally viable endothelial cells. The digested tissue is assessed by flow cytometry analysis using CD31+/CD45&#8722; cells as markers for positive endothelial cell identification. Cells can be sorted for immediate downstream functional assays or used to generate primary cell lines. The technique of isolating and digesting arteries from different vascular beds will provide options for researchers to evaluate freshly isolated vascular cells&#160;from arteries of interest and allow them to perform a wide range of functional tests on specific cell types.

This protocol details a method for the dissection of mouse adipose depots and the isolation and digestion of respective arteries to liberate and then identify the endothelial cell population. Freshly isolated cells used in downstream applications will advance the understanding of vascular cell biology and the mechanisms of vascular dysfunction.

Isolamento e Identificação de Células Endoteliais Vasculares de Depósitos Adiposos Distintos para Aplicações a Jusante

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

Isolamento Semi-Automatizado de Tecido Adiposo Branco Murino

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

Autor em destaque: Isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal do tecido adiposo branco murino usando um dissociador de tecido  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

Caracterização morfológica e molecular do scBAT em camundongos

Dissection, Histological Processing, and Gene Expression Analysis of Murine Supraclavicular Brown Adipose Tissue

Brown adipose tissue (BAT)-mediated thermogenesis plays an important role in the regulation of metabolism, and its morphology and function can be greatly impacted by environmental stimuli in mice and humans. Currently, murine interscapular BAT (iBAT), which is located between two scapulae in the upper dorsal flank of mice, is the main BAT depot used by research laboratories to study BAT function. Recently, a few previously unknown BAT depots were identified in mice, including one analogous to human supraclavicular brown adipose tissue. Unlike iBAT, murine supraclavicular brown adipose tissue (scBAT) is situated in the intermediate layer of the neck and thus cannot be accessed as readily.
To facilitate the study of newly identified mouse scBAT, presented herein is a protocol detailing the steps to dissect intact scBAT from postnatal and adult mice. Due to scBAT&#39;s small size relative to other adipose depots, procedures have been modified and optimized specifically for processing scBAT. Among these modifications is the use of a dissecting microscope during tissue collection to increase the precision and homogenization of frozen scBAT samples to raise the efficiency of subsequent qPCR analysis. With these optimizations, the identification of, morphological appearance of, and molecular characterization of the scBAT can be determined in mice.

Autor em destaque: Otimizando a extração de tecido adiposo marrom supraclavicular para análise genética

Here, we provide a practical procedure for dissecting and performing histological and gene expression analyses of murine supraclavicular brown adipose tissue.

Dissecção, processamento histológico e análise da expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino

Brown adipose tissue (BAT)-mediated thermogenesis plays an important role in the regulation of metabolism, and its morphology and function can be greatly ...

Localização, identificação e excisão de Depots Murino adiposo

Resumo

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Capítulos neste vídeo

A separação imunomagnética Sca1 de gordura Depot-específica

Preparação, Administração e Avaliação da Captação Celular Tecido-Específica In Vivo de Lipossomas Marcados com Corante Fluorescente

Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos

Lymphatic and Blood Network Analysis During Obesity

Identificação e dissecção de diversos depósitos de Adipose de camundongo

Isolamento e Identificação de Células Endoteliais Vasculares de Depósitos Adiposos Distintos para Aplicações a Jusante

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

Dissecção, processamento histológico e análise da expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino