Os autores gostariam de agradecer a Michael Solga e ao resto da equipe do Núcleo de Citometria de Fluxo por fornecer treinamento e serviços de citometria de fluxo. Os autores também gostariam de agradecer a Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye e Prasad Srikakulapu por sua assistência com a preparação de lipossomas (SSKD, DKB), colheitas de tecidos (MAM, JCG) e coloração por citometria de fluxo e aquisição de amostras (AU, PS, CM). Este trabalho foi apoiado por AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 e R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 e T32 HL007284 subvenções.

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Os autores não têm nada a revelar.

Aqui descrevemos um protocolo de três partes para (i) preparar lipossomas que são marcados com um corante lipídico fluorescente e carregados com um composto antidiabético, tesaglitazar, (ii) administrar lipossomas a um camundongo via injeção retro-orbital e (iii) coletar, processar e corar tecidos para detectar a captação de lipossomas em nível celular por citometria de fluxo. Este protocolo revisa o preparo de lipossomas de aproximadamente 150 μm e a avaliação da captação no tecido adiposo, no sangue e no baço. A preparação dos lipossomas é escalável, realizada principalmente à temperatura ambiente, e utiliza evaporação em fase reversa para maximizar a carga de fármacos e remoção de solventes orgânicos. Usando este protocolo, até 2 mg/mL de tesaglitazar pode ser alcançado na amostra de lipossomas purificada. Os lipossomas preparados podem ser armazenados em tampão HEPES a 4 °C por mais de um ano. Em nossa experiência, eles demonstraram variação mínima do tamanho médio das partículas. Menos de 10% de perda de conteúdo do fármaco foi demonstrada espectrofotometricamente, após separação por ultrafiltração dos lipossomas do fármaco externo com filtro centrífugo de 10 kDa.
Durante a preparação do lipossoma, existem algumas etapas e fatores críticos a serem considerados. Primeiramente, a ordem das etapas do protocolo é importante e deve ser respeitada. Em segundo lugar, o pH da solução utilizada durante o carregamento do tesaglitazar deve ser mantido em 7,4 para maximizar a solubilidade e o carregamento eficaz. Terceiro, a montagem adequada de equipamentos e filtros garante que a saída de cada etapa seja do tamanho e pureza adequados. Por exemplo, se os filtros de 100 e 200 nm não forem montados corretamente, um lote mais heterogêneo e de tamanho inadequado de lipossomas pode resultar. Quarto, a remoção completa do acetato de Ca-antes do carregamento da droga é necessária para maximizar a transferência de tesaglitazar para os lipossomas. Para testar a remoção completa de Ca-acetato, use sedimentação de alta velocidade para remover os lipossomas e, em seguida, medir os níveis de Ca-acetato na solução não lipossomal. Em quinto lugar, é importante pesar e registrar a massa de todos os materiais adicionados ao preparo dos lipossomas em cada etapa. Isso garante que as concentrações adequadas possam ser calculadas e as proporções necessárias de materiais sejam mantidas. Finalmente, se a técnica não for executada adequadamente, pode haver um nível indesejável de heterogeneidade. É importante verificar minuciosamente este parâmetro usando DLS e outras abordagens, como a microscopia eletrônica. Para melhorar a homogeneidade, considere ajustar o tamanho do filtro selecionado ou empilhar dois filtros.
Além disso, é fundamental que os controles e um painel de anticorpos para citometria de fluxo sejam planejados e otimizados antes da realização completa desse protocolo (Tabela 1, Tabela 3). Os anticorpos devem ser testados para garantir que concentrações adequadas sejam usadas para coloração e que a sobreposição entre os fluoróforos seja mínima. A excitação e emissão do corante usado durante a preparação dos lipossomas também devem ser levadas em consideração no planejamento do painel. Em nossos resultados, utilizamos o DiD, que tem excitação e emissão semelhantes a fluoróforos como Aloficocianina (APC) e AlexaFluor 647. Assim, não selecionamos anticorpos conjugados a esses fluoróforos em nosso painel de anticorpos. Além disso, controles isotípicos não estão incluídos neste protocolo. Isso ocorre porque os anticorpos selecionados para esse protocolo são anticorpos bem validados e disponíveis comercialmente. No entanto, se estiver interessado em usar um anticorpo que não tenha sido otimizado anteriormente, considere testar o anticorpo contra um controle de isótipo nos tecidos de interesse antes de realizar o experimento completo.
Embora este protocolo demonstre como extrair e processar o sangue, baço, tecido adiposo inguinal e tecido adiposo epididimal do camundongo pós-tratamento, esta abordagem geral pode ser aplicada a outros tecidos. Dependendo do tecido de interesse, os protocolos de processamento e digestão podem precisar ser alterados, como é publicado para os seguintes tecidos: pulmão 21, fígado22, cavidade peritoneal 3, medula óssea3,23, cérebro 24.
Uma limitação importante deste método a considerar é que a captação só pode ser avaliada em um momento por animal. Assim, pode ser vantajoso acoplar este protocolo a outras técnicas de imagem não invasivas ou planejar adequadamente para garantir recursos suficientes para a realização da avaliação. O tempo de captação celular e o turnover celular são fatores importantes a serem considerados: os lipossomas circularão por todo o corpo nas primeiras 24 h e, dependendo da vida útil das células que absorvem lipossomas ou como eles respondem à captação, pode ocorrer morte celular ou fagocitose adicional. Nosso estudo anterior demonstrou mudanças nas características populacionais de populações DiD+ em diferentes momentos3. Por essa razão, é importante avaliar a captação em momentos anteriores ou em momentos mais relevantes para a biologia do mecanismo de interesse. Além disso, embora a quantificação da captação celular em todo o tecido possa ser realizada com esse protocolo, a citometria de fluxo não pode revelar a localização tecidual. O acoplamento dessa abordagem com métodos histológicos pode ajudar a resolver essa limitação.
Em geral, esse protocolo complementa a metodologia existente, como a histologia e a imagem de fluorescência de corpo inteiro. Com os avanços contínuos nas ferramentas e métodos de citometria de fluxo, o desenvolvimento de painéis maiores para populações celulares cada vez mais específicas se tornará possível. Sugerimos que este protocolo seja utilizado em adição aos métodos supracitados, pois melhorará a avaliação da captação celular e também proporcionará a oportunidade de validar os resultados observados por citometria de fluxo. Por exemplo, caso se verifique que a maioria das partículas no tecido adiposo foi absorvida por macrófagos por citometria de fluxo. A imunofluorescência de uma alíquota adicional do mesmo tecido adiposo poderia ser salva, fixada, seccionada e corada para marcadores de macrófagos para verificar se o tipo celular realmente absorve lipossomas. Essa abordagem deve adicionar rigor aos ensaios de biodistribuição de nanopartículas realizados: validação de alvos específicos para células, quantificação da captação celular, identificação de captação fora do alvo e, esperançosamente, fornecer informações para gerar hipóteses mecanicistas para os resultados terapêuticos observados. Este protocolo também pode ser adaptado para estudos futuros utilizando diferentes lipossomas, investigando a captação em outros tecidos e testando novos compostos no contexto de obesidade e dismetabolismo ou qualquer outra doença em que a liberação de nanopartículas seja uma opção terapêutica viável.

À medida que cresce o interesse no desenvolvimento de terapias utilizando nanopartículas para liberação de fármacos, os métodos para preparar e avaliar a distribuição e absorção de partículas devem continuar avançando, expandindo-se e sendo acessíveis à comunidade de pesquisa 1,2. Esse protocolo foi desenvolvido para avaliar os tipos celulares exatos que absorveram lipossomas in vivo após um tratamento com lipossomas marcados com DiD carregados com tesaglitazar, um agonista do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma (PPAR)-α/γ 3,4. Nesses estudos, pudemos avaliar quais tipos celulares foram diretamente impactados pelo tratamento com tesaglitazar lipossomal, a eficácia de direcionar metades e gerar hipóteses para explicar os resultados do tratamento observados. Além disso, funções biológicas estabelecidas em uma variedade de tipos celulares sugerem que células fagocíticas como macrófagos, células dendríticas e células de Kupffer hepatoespecíficas absorvem a maioria dos lipossomas 5,6,7. Utilizando este protocolo, demonstramos que fagócitos não clássicos também poderiam absorver lipossomas 3,4.
Este protocolo apresenta um método otimizado para solubilização do tesaglitazar, preparo de lipossomas por evaporação em fase reversa e uso de acetato de cálcio como atrativo para carregamento remoto de fármacos. Os métodos apresentados são acessíveis a muitos laboratórios e carecem de materiais de difícil aquisição e etapas que exigem altas temperaturas. O protocolo produz lipossomas de tamanhos ideais para o aumento da circulação invivo8. Além disso, como resumido por Su et al., até o momento, métodos para avaliar in vivo a distribuição de lipossomas e a captação tecidual têm sido estudados e testados emprofundidade9. Os métodos de tomografia por emissão de pósitrons (PET), ressonância magnética (RM) e tomografia molecular de fluorescência (FMT) são aplicados para quantificar a biodistribuição e captação tecido-específica9,10,11. Embora esses métodos tenham sido otimizados para maximizar a detecção in vivo, eles ainda não têm a capacidade de quantificar a captação de lipossomas in vivo na resolução celular. O protocolo aqui apresentado visa suprir essa necessidade por meio do uso da citometria de fluxo. Finalmente, para esse protocolo, a captação celular foi reduzida a alguns tecidos, incluindo o tecido adiposo. Há uma crescente literatura investigando o potencial do uso de nanopartículas para administrar terapias no contexto de obesidade, dismetabolismo e inflamação 12,13,14,15,16,17. Como tal, sentimos que era importante partilhar um protocolo com métodos eficazes para processar e analisar o tecido adiposo – um dos tecidos que desempenha um papel importante nestas patologias.

<table><tbody><tr><td>1-mL syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10-mL syringe</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse B220 BV421</td><td>Biolegend</td><td>103251</td><td>Clone RA3-6B2</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD115 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1152-82</td><td>Clone AFS98</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody</td><td>eBioscience</td><td>47-0114-82</td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD19 PE CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562291</td><td>Clone 1D3</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3 FITC antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>553061</td><td>Clone 145-2C11</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD31 BV605</td><td>Biolegend</td><td>102427</td><td>Clone 390</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Anti-mouse F4/80 PE Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123114</td><td>Clone BM8</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Gemini Bio-products</td><td>700-107P</td><td></td></tr><tr><td>Desalting spin-column</td><td>ThermoFisher</td><td>89889, 89890</td><td>Zeba spin column</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynamic Light Scattering, Nicomp 370</td><td>Particle Sizing System, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIX &amp;amp; PERM Cell Permeabilization Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GAS004</td><td></td></tr><tr><td>Gauze sponges</td><td>Dermacea</td><td>441211</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>3393-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Liposome extruder</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z373400</td><td>LiposoFast</td></tr><tr><td>Live/Dead Aqua</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic lubricant</td><td>Optixcare</td><td></td><td>20g/70 oz Sterile</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td><td>Alfa Aesar</td><td>433689L</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene vial for mincing</td><td>Wheaton</td><td>986701</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>Buchi</td><td>Re111</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>T/Pump Heat therapy pump and pad</td><td>Gaymer Industries</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesaglitazar</td><td>Tocris</td><td>3965</td><td></td></tr><tr><td>Track-etched polycarbonate membranes</td><td>Thomas Scientific</td><td>1141Z**</td><td>Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes</td></tr><tr><td>ZetaSizer/DLS-ELS system</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation, administration, and assessment of in vivo tissue-specific cellular uptake of fluorescent dye-labeled liposomes

Há um interesse crescente no uso de lipossomas para entregar compostos in vivo, particularmente para abordagens de tratamento direcionadas. Dependendo da formulação do lipossoma, os lipossomas podem ser preferencialmente absorvidos por diferentes tipos de células no corpo. Isso pode influenciar a eficácia da partícula terapêutica, uma vez que a progressão de diferentes doenças é específica do tipo tecidual e celular. Neste protocolo, apresentamos um método para síntese e marcação fluorescente de lipossomas usando DSPC, colesterol e DSPE PEG-2000 e o corante lipídico DiD como marcador fluorescente. Este protocolo também apresenta uma abordagem para a administração de lipossomas in vivo e avaliação da captação célula-específica de lipossomas usando citometria de fluxo. Esta abordagem pode ser usada para determinar os tipos de células que absorvem lipossomas e quantificar a distribuição e proporção de captação de lipossomas entre tipos celulares e tecidos. Embora não mencionados neste protocolo, ensaios adicionais, como imunofluorescência e imagem de fluorescência de célula única em um citômetro, fortalecerão quaisquer achados ou conclusões feitas, pois permitem a avaliação da coloração intracelular. Os protocolos também podem precisar ser adaptados dependendo do(s) tecido(s) de interesse.

Produção de Lipossomas
Os resultados aqui publicados são semelhantes aos de nosso trabalho publicado anteriormente 3,4,20. Utilizando o protocolo aqui apresentado, esperamos produzir lipossomas de aproximadamente 150\u2012160 nm de tamanho. A DLS revela diâmetro médio dos lipossomas de 163,2 nm e potencial zeta de -19,2 mV (Figura 1A). A microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) revela lipossomas circulares (Figura 1B) e o diagrama DLS revela um desvio padrão relativamente pequeno do diâmetro médio (Figura 1C).
A ligação positiva aos lipossomas requer um controle tratado com PBS
Estudos anteriores de nosso grupo empregando esse protocolo investigaram quais subtipos celulares em FVS, baço e sangue adiposos se ligavam a lipossomas após uma semana de administração in vivo 3,4. Usando um camundongo tratado com PBS, as células da cavidade peritoneal e do baço foram coradas com o mesmo painel de anticorpos usado em amostras de camundongos tratados com lipossomas. Os tecidos foram colhidos após uma semana de tratamentos (Figura 2A). As amostras do camundongo tratado com PBS serviram como um FMO DiD com o qual criar portas DiD positivas (Figura 2B,C). Uma porta positiva pode ser criada usando o sinal DiD-positivo, mas amostras sem sinal DiD também devem ser usadas para verificar se a porta positiva não inclui amostras DiD-negativas.
Titulações são necessárias para otimizar sinais de fluorescência
Antes de executar um experimento completo, várias condições, incluindo a concentração de anticorpos fluorescentemente conjugados usados durante a coloração celular e de corante lipídico usado durante a preparação de lipossomas, devem ser otimizadas. Os citômetros de fluxo têm um limite superior de detecção para intensidade de fluorescência, então muito corante incorporado nos lipossomas levará a níveis não quantificáveis de sinal DiD em amostras que passam pelo citômetro. Além disso, muito DiD nos lipossomas pode levar a altos níveis de transferência de corante inespecífico, o que poderia distorcer os resultados de captação celular. A Figura 3 relata os resultados de um experimento em que as concentrações de corante lipídico foram tituladas para identificar a concentração que produziria um sinal ótimo dentro da faixa de detecção do citômetro de fluxo utilizado. Este foi realizado nos tecidos de interesse para o experimento final: sangue (Figura 3A), FVS adiposa inguinal (Figura 3B) e FVS adiposa epididimal (Figura 3C). As concentrações selecionadas para teste foram 10 mg de DiD (Alto, vermelho), 1 mg de DiD (Médio, azul) ou 0,1 mg de DiD (Baixo, cinza) por 1 mL de lipossomas. A maior concentração utilizada nos lipossomas foi muito alta e ultrapassou a faixa quantificável do citômetro nos três tecidos (Figura 3A\u2012C, vermelho). A menor concentração de DiD mostrou algum sinal (Figura 3 A\u2012C, cinza), mas uma população clara além das células tratadas com PBS (Figura 3A\u2012C, preto) não foi observada. Quando quantificada, a média aritmética da IFM DiD para cada tecido e concentração demonstrou uma clara distinção entre os controles PBS e a concentração média de DiD (Figura 3D). Assim, conforme indicado no protocolo, selecionamos a concentração média (Figura 3, azul) para utilizar em nosso preparo lipossomo.
O uso do painel de múltiplos anticorpos permite a identificação da captação de lipossomas por diferentes subgrupos celulares
Utilizando o painel delineado na Tabela 3, as células foram coradas com anticorpos contra marcadores para macrófagos A, células B, células T, células dendríticas, monócitos e células endoteliais (Figura 4). Estratégias de gating ligeiramente diferentes são necessárias para cada tipo de tecido, mas a maioria dos mesmos tipos celulares pode ser identificada em cada um. Algumas exceções incluem células endoteliais, que normalmente não são encontradas no sangue, e monócitos, que normalmente estão em maior frequência no sangue do que outros tecidos. Uma vez identificadas as populações, pode-se quantificar o tamanho total de cada célula e a frequência com que são DiD+. Cálculos adicionais podem ser realizados para caracterizar a população DiD+: qual porcentagem de células DiD+ são macrófagos, células endoteliais, etc. Por favor, note que estas são estratégias de gating exemplo, mas não a única maneira de analisar as amostras. A análise será ditada pelo painel selecionado e citômetro(s) de fluxo disponíveis.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> Figura 1: Exemplo de características dos lipossomas preparados. (A) O tamanho e o potencial zeta foram medidos como descrito acima e foram relatados em forma de tabela. Cada parâmetro é apresentado como média ± desvio padrão. (B) Crio-ME foi utilizada para obtenção de imagens dos lipossomas preparados. A barra de escala branca tem 50 nm de comprimento. (C) A DLS foi utilizada para gerar um histograma do diâmetro dos lipossomas nessa preparação. Esta figura é adaptada de Osinski et al.3. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> Figura 2: Coloração DiD representativa de camundongos tratados com PBS ou Lipossoma. (A) Esquema experimental para PBS e tratamentos com lipossomas. PBS ou lipossomas foram injetados três vezes ao longo de uma semana. Os tecidos foram colhidos no 8º dia de tratamento. (B, C) Fluxogramas representativos revelam coloração DiD positiva em camundongos tratados com lipossomas (C), mas não tratados com PBS (B). FSC, dispersão para a frente. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> Figura 3: Titulação de DiD em lipossomas. Lipossomas foram preparados com três diferentes concentrações de DiD e injetados em camundongos. O cinza indica a baixa concentração em 0,1 mg de DiD por 1 mL de lipossomas, o azul indica a concentração média em 1 mg de DiD/mL de lipossomas e o vermelho indica a alta concentração em 10 mg de DiD/mL de lipossomas. Um camundongo tratado com PBS foi usado como controle negativo (preto). Sangue (A, círculo), adiposo inguinal (B, triango) e adiposo epididimal (C, quadrado) foram colhidos 24 h após a injeção e processados para isolar uma suspensão unicelular. Essas amostras foram executadas em citômetro de fluxo até o nível de DiD detectável. Histogramas tecido-específicos com sobreposições de cada grupo de tratamento são apresentados para demonstrar a intensidade de fluorescência por concentração (A\u2012C). A média aritmética do DiD também foi quantificada para cada tecido e concentração e plotada (D). SSC = dispersão lateral. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> Figura 4: Análise representativa da citometria de fluxo dos subgrupos celulares em FVS adiposa, sangue e baço. (A\u2012C) Representação esquemática da estratégia de gating para identificar subgrupos celulares e células DiD+ em FVA adiposa (A), baço (B) e sangue (C). Abreviações: FSC = forward scatter; DL = vivos/mortos; L-DCs = células dendríticas linfoides; M-DCs = células dendríticas mieloides; SSC = dispersão lateral. Esta figura é adaptada de Osinski et al.3. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Controle</td>
			<td>Propósito</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Camundongo tratado com PBS ou soro fisiológico</td>
			<td>Use as células deste mouse para os seguintes controles de citometria de fluxo:</td>
		</tr><tr><td>1. Células não coradas</td>
		</tr><tr><td>2. Mancha única viva/morta</td>
		</tr><tr><td>3. Células coradas com o painel completo, mas sem fluorescência lipossomal para determinar o sinal positivo do lipossomo durante a análise</td>
		</tr><tr><td>Este/estes ratinhos/ratinhos também serão utilizados para determinar se os lipossomas têm efeitos in vivo, uma vez que terá um controlo não lipossomal na sua experiência.</td>
		</tr><tr><td>Lipossomas descarregados</td>
			<td>Se você estiver carregando um composto em seus lipossomas, uma parte do seu lote de lipossomas deve ser sintetizada sem o composto. Isso explica quaisquer efeitos in vivo dos lipossomas sozinhos.</td>
		</tr><tr><td>DiD sozinho</td>
			<td>Uma vez que o DiD também pode ser absorvido pelas membranas celulares, alocar alguns ratos para receber corante livre em uma quantidade igual à encontrada nos lipossomas ajudará a explicar qualquer coloração de membrana de fundo.</td>
		</tr><tr><td>Controles de fluorescência-menos-um (FMO)</td>
			<td>Estas são células coradas com todos os anticorpos, exceto um, em seu painel. Como #3 na caixa acima, isso ajuda a determinar o verdadeiro sinal positivo para esse anticorpo durante a análise</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Controles a serem usados neste protocolo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Solução</td>
			<td>Componentes</td>
			<td>Volume aproximado necessário por lote/mouse</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Preparação de lipossomas</td>
		</tr><tr><td>Acetato de cálcio</td>
			<td>1 M de acetato de cálcio em H2O</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampão HEPES</td>
			<td>10 mM HEPES em A2O, pH 7,4</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>Tesaglitazar em HEPES</td>
			<td>em 10 mM HEPES</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Colheita, processamento e coloração de tecidos</td>
		</tr><tr><td>Solução tamponada com fosfato (PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO4 em destilado H2O</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr><tr><td>PBS-Heparina</td>
			<td>Heparina 0,1 mM em PBS</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampão HEPES</td>
			<td>20 mM HEPES em PBS</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampão de digestão</td>
			<td>2 mg/mL de colagenase Tipo I em tampão HEPES</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Buffer de lise AKC</td>
			<td>0,158 M NH 3 Cl,10 mM KHCO3, 0,1 mM Na 2 EDTA em ddH 2 O, pH7,2</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr><tr><td>Buffer FACS</td>
			<td>1% BSA, 0,05% NaN3 em PBS</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr><tr><td>Bloco Fc (diluído)</td>
			<td>Bloco Fc 1:50 no buffer FACS</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>Buffer de Fixação</td>
			<td>Paraformaldeído a 2% em PBS</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Soluções a serem preparadas.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Um</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Coloração extracelular (2x mistura de anticorpos)</td>
		</tr><tr><td>Antígeno</td>
			<td>Fluoróforo</td>
			<td>Volume ab por teste de 100 μL</td>
			<td>Volume total necessário:</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>Coluna C x 1,2 x Total # amostras</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>PerCP Cy5,5</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,5 μL/teste) x (1,2) x (# amostras)</td>
		</tr><tr><td>F4/80</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,25 μL/teste) x (1,2) x (# amostras)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0,25 μL/teste) x (1,2) x (# amostras)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>FITC</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1,0 μL/teste) x (1,2) x (# amostras)</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>etc...</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115</td>
			<td>PE</td>
			<td>1,5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Para criar sua mistura de anticorpos, combine os anticorpos calculados na coluna D com o tampão FACS ou o Brilliant Violet Staining Buffer* para um volume final de (50 μL x 1,2 x Total # amostras)</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Coloração viva/morta (1x)</td>
		</tr><tr><td>Vivo/Morto</td>
			<td>Fluoróforo</td>
			<td>Volume L/D por teste de 200 uL</td>
			<td>Volume total necessário:</td>
		</tr><tr><td>Vivo/Morto</td>
			<td>Aqua</td>
			<td>0,67 μL</td>
			<td>Coluna C x 1,2 x Total # amostras</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Coloração Intracelular (1x)</td>
		</tr><tr><td>Antígeno</td>
			<td>Fluoróforo</td>
			<td>Volume Ab por teste de 50 μL</td>
			<td>Volume total necessário:</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>FITC</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Coluna C x 1,2 x Total # amostras</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*Brilliant Violet Staining Buffer deve ser usado se mais de um anticorpo conjugado a um fluoróforo Brilliant Violet estiver sendo usado em seu painel.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 3: Exemplo de painel de anticorpos e cálculos de misturas de coloração a serem utilizadas para coloração de fluxo.

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Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

O objetivo deste protocolo é sintetizar lipossomas fluorescentemente marcados e usar citometria de fluxo para identificar a localização in vivo de lipossomas em nível celular.

Preparação, Administração e Avaliação da Captação Celular Tecido-Específica In Vivo de Lipossomas Marcados com Corante Fluorescente

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

preparation-administration-assessment-vivo-tissue-specific-cellular

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.2K visualizações.  University of Virginia. O objetivo deste protocolo é sintetizar lipossomas fluorescentemente marcados e usar citometria de fluxo para identificar a localização in vivo de lipossomas em nível celular.

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A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past decade. However, only a small number of nanomedicines have been approved for clinical use, whereas the majority of nanomedicines under clinical development have produced disappointing results. One major obstacle to the successful clinical translation of new cancer nanomedicines is the lack of an accurate understanding of their in vivo performance. This article features a rigorous procedure to characterize the in vivo behavior of nanomedicines in tumor-bearing mice at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels via the integration of positron emission tomography-computed tomography (PET-CT), radioactivity quantification methods, flow cytometry, and fluorescence microscopy. Using this approach, researchers can accurately evaluate novel nanoscale formulations in relevant mouse models of cancer. These protocols may have the ability to identify the most promising cancer nanomedicines with high translational potential or to aid in the optimization of cancer nanomedicines for future translation.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

Um método completo para avaliar o<em&gt; In Vivo</em&gt; Performance of Cancer Nanomedicinas

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Pesquisa do câncer

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the efficacy of cell persistence and biodistribution of haMSCs in animal models. We demonstrated a method to label the cell membrane of haMSCs with lipophilic fluorescent dye. Subsequently, intra-articular injection of the labeled cells in rats with surgically induced KOA was monitored dynamically by an in vivo imaging system. We employed the lipophilic carbocyanines DiD (DilC18 (5)), a far-red fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analog, which utilized a red laser to avoid excitation of the natural green autofluorescence from surrounding tissues. Furthermore, the red-shifted emission spectra of DiD allowed deep-tissue imaging in live animals and the labeling procedure caused no cytotoxic effects or functional damage to haMSCs. This approach has been shown to be an efficient tracking method for haMSCs in a rat KOA model. The application of this method could also be used to determine the optimal administration route and dosage of MSCs from other sources in pre-clinical studies.

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

This protocol describes an efficient way to monitor the cell persistence and biodistribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) by far-red fluorescence labeling in a rat knee osteoarthritis (KOA) model via intra-articular (IA) injection.

Na Vivo Rastreamento de adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas em um modelo de osteoartrite do joelho de rato com corante fluorescente membrana lipofílico

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Biologia do Desenvolvimento

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para<em&gt; In Vivo</em&gt; Imageamento óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Bioengenharia

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

In vivo duas cores 2-Photon Imaging de células de repórter geneticamente marcadas na pele

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and elevated IFP are linked to the heterogeneous intra-tumoral distribution of nanotechnology-based drug delivery systems such as liposomes. In the present study, the relationship between tumor microcirculation, elevated IFP, and accumulation of nanoparticles was investigated through in vivo experimentation. This was accomplished by evaluation of the tumor microcirculation using dynamic contrast enhanced computed tomography (DCE-CT) and measurement of tumor IFP using a novel image-guided robotic needle placement system connected to the micro-CT scanner. The intra-tumoral accumulation of liposomes was determined by CT image-based assessment of a nanoparticle liposomal formulation that stably encapsulate the contrast agent iohexol (CT-liposomes). CT imaging allowed for co-localization of the spatial distribution of tumor hemodynamics, IFP and CT-liposome accumulation in an individual subcutaneous xenograft mouse model of breast cancer. Measurements led to the discovery that perfusion and plasma volume fraction are strong mediators of the intra-tumoral distribution of liposomes. Furthermore, the results suggest that IFP plays an indirect role in mediating liposome distribution through modulating blood flow.

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes has been linked to an abnormal tumor microenvironment. Herein methods are presented to measure tumor microcirculation by perfusion imaging and elevated interstitial fluid pressure (IFP) using an image-guided robotic system. Measurements are compared to the intra-tumoral accumulation of liposomes, determined using volumetric micro-CT imaging.

Medidas espaciais de Perfusão, intersticial pressão do produto e lipossomas Acumulação em tumores sólidos

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and ...

Medicina

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes all liposomes of the ensemble to be identical. However, new experimental platforms able to observe liposomes at the single-particle level have made it possible to perform highly sophisticated and quantitative studies on protein-membrane interactions or drug carrier properties on individual liposomes, thus avoiding errors from ensemble averaging. Here we present a protocol for preparing, detecting, and analyzing single liposomes using a fluorescence-based microscopy assay, facilitating such single-particle measurements. The setup allows for imaging individual liposomes in a massive parallel manner and is employed to reveal intra-sample size and compositional inhomogeneities. Additionally, the protocol describes the advantages of studying liposomes at the single liposome level, the limitations of the assay, and the important features to be considered when modifying it to study other research questions.

This protocol describes the fabrication of liposomes and how these can be immobilized on a surface and imaged individually in a massive parallel manner using fluorescence microscopy. This allows for the quantification of the size and compositional inhomogeneity between single liposomes of the population.

Um ensaio de liposcopia única baseado em microscopia quantitativa para detectar a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

Usando em Vitro viver-pilha de imagem para explorar Chemotherapeutics entregues por nanopartículas de lipídios-baseado

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such as the cornea and conjunctiva. While therapeutic effects and pharmacokinetics of the drugs upon subconjunctival injection have been described in some studies, very few assess the ocular distribution of drugs or drug delivery systems (DDS). The latter is critical for the optimization of intraocular DDS design and drug bioavailability to achieve the desired ocular localization and duration of action (e.g., acute versus. prolonged). This study establishes the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to qualitatively study the ocular distribution of fluorescent liposomes in real-time in live mice after sub-conjunctival injection. Being designed for in vivo visual inspection of tissues at the microscopic level, this is also the first full description of the CLM imaging method to study spatio-temporal distribution of injectables in the eye after subconjunctival injection.

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

We present a protocol for the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to non-invasively study the spatio-temporal distribution of liposomes in the eye after subconjunctival injection.

Espólio-Temporal Em Vivo Imagem de Sistemas de Entrega de Drogas Oculares usando Microendoscopia a laser confocal de fibra óptica

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

O uso de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imagem de órgãos inteiros e Histologia Tissue quantitativa para determinar o Bio-distribuição das moléculas fluorescente etiquetado

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Biologia

In Vivo Imaging of Transduction Efficiencies of Cardiac Targeting Peptide

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest in developing these peptides, especially cell-specific ones, as novel vectors for delivering diagnostic and therapeutic materials. Our past work involving phage display identified a novel, nonnaturally occurring, 12 amino acid-long peptide that we named cardiac targeting peptide (CTP) due to its ability to transduce normal heart tissue in vivo with peak uptake seen in as little as 15 min after an intravenous injection. We have undertaken detailed biodistribution studies by injecting CTP labeled with fluorophore cyanine5.5, allowing it to circulate for various periods of time, and euthanizing, fixing, and sectioning multiple organs followed by fluorescent microscopy imaging. In this publication, we describe these processes as well as ex vivo imaging of harvested organs using an in vivo imaging system in detail. We provide detailed methodologies and practices for undertaking transduction as well as biodistribution studies using CTP as an example.

We describe protocols for assessing the degree of transduction by cell-penetrating peptides utilizing ex vivo imaging systems followed by paraffin embedding, sectioning, and confocal fluorescent microscopy using cardiac targeting peptide as an example. In our protocol, a single animal can be used to acquire both types of imaging assessment of the same organs, thereby cutting the number of animals needed for studies by half.

In Vivo Imagem de Eficiências de Transdução de Peptídeo de Direcionamento Cardíaco

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest ...

Preparação, Administração e Avaliação da Captação Celular Tecido-Específica In Vivo de Lipossomas Marcados com Corante Fluorescente

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Um método completo para avaliar o