Name: a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium
Uploaded: 2014-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
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Este estudo foi financiado por doações do Conselho Sueco de Pesquisa (90293501, A0290401, A0290402), Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia ao abrigo do contrato de concessão n ° 602699 (DIREKT), a Fundação NovoNordisk, a Fundação Gurli e Edward Brunnberg, Caule Therapy, Vleugel Fundação e Åke Fundação Wiberg.

NOTA: O sangue foi coletado de indivíduos saudáveis ​​por punção venosa sistema aberto em aprovação junto do Conselho de Revisão de Ética em Uppsala (Alvará nº 2008/264). 1. Semeadura Células <ol><li> Culturas primárias de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) a 37 ° C em 5% de CO 2 em frascos T75 revestidos com gelatina a 1% em PBS pH 7,4. </li><li> Remover o meio de cultura a partir de um frasco T75 contendo HUVEC (ou outro tipo de células endoteliais humanas primárias) e lavar as células com EDTA 2,1 mM em PBS, pH 7,4. Separar as células por adição de 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA e incubando durante 2-3 min em 37 ° C. </li><li> Recolher as células por lavagem do frasco com 9 ml de 10% de FBS em PBS pH 7,4 e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml. Girar as células a 735 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento de células em meio de crescimento celular endotelial microvascular (CE GMMV) e contar as células numa câmara de Burker. Semente 21.000 cells / cm 2 em 1 poços lâminas de cultura de células e incubar a 37 ° C. As HUVEC confluentes depois vai ser 1-2 dias de cultura. Monitorar a morfologia celular e confluência diariamente sob um microscópio de luz. </li></ol> 2. Preparação de Sangue Total <ol><li> Preparar todas as superfícies artificiais que estarão em contacto com o sangue com uma dupla camada de heparina imobilizada (CHS) de acordo com as instruções do fabricante. CHS materiais revestidos protegidos do pó pode ser armazenado a temperatura ambiente até 6 meses, sem perda de função. </li><li> Use punção venosa sistema aberto para extrair o sangue de um dador saudável pouco (&lt;30 min) antes de iniciar o experimento câmara endotelial arterial. Pares de uma agulha hipodérmica (18 G x 50 mm) com a HSC tubo flexível de silicone revestido (diâmetro interno: 2 mm), antes de recolher o sangue cuidadosamente num tubo de 50 ml revestido a CHS. Suplemento de sangue com heparina não fraccionada para alcançar uma concentração final de 0,75 UI / ml. Misture delicadamente o sangue por inverting o tubo 2-3 vezes. </li></ol> 3. Sangue endotelial Câmara Modelo <ol><li> Fabricar câmaras de sangue (Figura 1A; vista superior) em polimetilmetacrilato acrílico (PMMA), que consiste de dois cilindros (oito milímetros de altura e raio 9 mm) que são coladas a uma lâmina de PMMA (25 x 75 mm). Montar as bordas dos cilindros virados para cima com borracha O-rings para vedar a câmara sanguínea contra as lâminas de vidro com as células endoteliais em cultura (Figura 1B). Rodar as câmaras sanguíneas ligados ao slide de cultura com células endoteliais em seguida numa posição vertical (Figura 1C). </li><li> Use uma ponteira CHS revestido de transferir 1,5 ml de sangue para cada CHS revestidos câmara com cuidado para não ativar o sangue. </li><li> Transferir 1 ml de sangue em tubos de microcentrífuga contendo 30 ul de EDTA 0,34 MK 3 para atingir uma concentração final de 10 mM de K 3 EDTA para determinação das concentrações plasmáticas de proteína inicial usandoum ensaio imunoenzimático (ELISA). Misturar cuidadosamente o sangue e manter os tubos em gelo. </li><li> Retirar as paredes de plástico das lâminas de vidro de cultura de células de acordo com as instruções do fabricante e lava-se cuidadosamente as células em PBS pH 7,4. Certifique-se de remover posteriormente o máximo de líquido possível dos slides. Não deixe que as células secar. </li><li> Colocar a lâmina no topo das câmaras sanguíneas, com células de frente para o sangue. Prenda o slide, colocando uma braçadeira ao redor da câmara de células endoteliais do sangue. Use uma lâmina de plástico para suporte adicional para evitar a ruptura da cultura de células de vidro deslizante ao colocar a braçadeira. </li><li> Fixar a câmara de células endoteliais do sangue em uma roda giratória (40 cm de diâmetro) coloque em um banho de água a 37 ° C. Rodar cada câmara na roda a 0,5 xg durante 30 min. </li><li> Após a incubação, desmontar a câmara da célula endotelial arterial. Lavar as lâminas de cultura de células em PBS pH 7,4 e consertar as células em gelo frio 1% de paraformaldeído (PFA) fou 10 min. Transferir 1 ml de sangue de cada câmara para tubos de microcentrífuga contendo 30 ul de EDTA 0,34 MK 3 para atingir uma concentração final de 10 mM de K 3 EDTA e misturar os tubos suavemente. Manter os tubos em gelo. </li><li> Centrifugar os tubos a 4560 xg durante 10 min em 4 ° C. Transfira o plasma sanguíneo para novos tubos de microcentrifuga e armazenamento em -70 ° C até análise posterior. </li></ol> 4. Análise de Sangue endotelial Interações <ol><li> Realize coloração de imunofluorescência com o mouse anti-CD16 humano seguido de cabra secundário anti-rato Alexa 488 e phalloidin-TexasRed. Executar cada etapa de coloração durante 1 hora à temperatura ambiente e lava-se as lâminas em PBS pH 7,4 entre cada passo. Contracoloração os núcleos com DAPI durante 10 min a temperatura ambiente. Analise componentes sanguíneos ligados às células endoteliais por microscopia de fluorescência, em combinação com análise de imagem utilizando software de análise de imagem adequado, tal como CellProfiler. </li><li> Quantify as reacções no compartimento de sangue com trombina-antitrombina (TAT) como ELISA acordo com as instruções do fabricante das amostras de plasma. </li><li> Use ferramentas estatísticas adequadas, por exemplo., Um teste t não pareado, para analisar os dados. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

<html> Várias interacções entre a parede do vaso sanguíneo e são normalmente mantidos num estado de repouso, devido à natureza não-adesiva e anti-trombótica do endotélio. 7 Durante condições patológicas que envolvem inflamação, o endotélio é activado com um consequente aumento na expressão de receptor de adesão e 8 uma capacidade reduzida de inibir a hemostasia. 9 A activação dos sistemas de cascata no sangue por sua vez, amplia a trombogenicidade do endotélio causando ainda mais recrutamento de leucócitos e trombose. 10 Para obter uma melhor compreensão das interacções entre esta delicadas células endoteliais e sangue total, temos desenvolveram um novo método in vitro onde as células endoteliais em cultura são colocadas em contacto com o sangue total. Para o nosso conhecimento, a nossa configuração é o primeiro a mostrar as células endoteliais incubadas com sangue humano inteiro com nenhum ou muito pouco anticoagulante por períodos de tempo mais longos. nt &quot;&gt; A sensibilidade deste sistema é activado por punção venosa sistema aberto em combinação com uma camada protectora de heparina imobilizada em todas as superfícies colocadas em contacto com o sangue. A utilização de um sistema aberto durante a recolha de sangue reduz a activação dos sistemas de cascata durante a punção venosa embora permita o uso de uma quantidade de auto-determinada de anticoagulante. tubos de sangue evacuados comercialmente disponíveis podem, no entanto, ser utilizadas, dependendo dos pontos finais pretendidos do estudo. A concentração final de anticoagulante adicionados a tubos de sistema fechado mais disponíveis comercialmente podem inibir sensível e, caso contrário difícil de estudar, interacções na configuração. 6 Uma superfície protectora heparina elimina adicionalmente a activação de sangue através de contacto de superfície por quaisquer outras do que as células endoteliais superfícies. 5 De fato, a incubação de sangue completo suplementado com uma pequena quantidade de heparina não fraccionada em câmara, sem a protecção de CHS resultou na formação do coágulo. <pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; A bolha de ar no interior da câmara permite que a mistura do sangue durante a incubação com as células endoteliais. A fim de avaliar o efeito do tamanho da bolha de ar, foram usados ​​dois volumes de sangue diferentes. Neste modelo, medimos os níveis de TAT semelhantes independentemente do tamanho da bolha de ar nas câmaras de incubação com HUVEC. TAT foi, no entanto, aumentada com um tamanho de bolha de ar menor nos totalmente CHS tratada câmaras. Isto, em conformidade com o descrito anteriormente as propriedades das células endoteliais 11, indica um efeito regulador sobre o aumento da activação da coagulação fornecida pelas células endoteliais que estão ausentes na câmara de CHS inerte. A bolha de ar no sistema cria um fluxo mediante a rotação da câmara. O tamanho da bolha irá afectar as forças dentro deste sistema rotativo. Isto é mostrado pelos nossos resultados na Figura 2D eram uma bolha menor cria TAT valores mais elevados representam uma diminuição da força sobre o sangue ou seja, o movimento de sangueno interior da câmara é menor e, assim, a activação do sistema de cascata ocorre a uma maior extensão. Deve mencionar-se que neste sistema que estão a criar um fluxo rotativo que irá ser diferente da velocidade através da câmara, com a maior velocidade ao longo das paredes e com o menor no centro. Isso obviamente não é um ambiente ideal no que diz respeito ao fluxo e tensão de cisalhamento para as células endoteliais, mas ainda temos um sistema de produção de resultados estáveis ​​e repetíveis. Mais condições óptimas incluiria fluxo laminar que circula na ausência de turbulência. Esta é, no entanto, não é possível no modelo representado aqui e para o nosso conhecimento de um tal sistema não está disponível até à data. Embora, existem vários sistemas de microfluido comercialmente disponíveis, que não são possíveis de se combinar com o sangue total sem ou com baixos níveis de anticoagulante adicionado ao sistema, assim, deixar de permitir a avaliação sensível adequada das interacções entre todos os componentes presentes no sangue e células endoteliais. Além disso, houve um aumento de 2 vezes no recrutamento de células sanguíneas para TNFa HUVEC activadas em combinação com a formação de TAT duplicou independentemente do volume de sangue. Isto verifica a estabilidade do sistema de modelo e mostra também a possibilidade de usar um endotélio activado em combinação com sangue total. Futuro em diante, a câmara da célula endotelial sangue pode ser usado para investigar o recrutamento de células do sangue para as células endoteliais activadas por uma variedade de marcadores expressos em células em várias condições e fases de activação. Além disso, o modelo pode ser usado em combinação com agentes farmacológicos, a fim de avaliar os efeitos sobre as condições inflamatórias. Em resumo, mostramos o grande benefício da combinação de um modelo de câmara com as células do sangue e vasculares humanos para criar um ser humano completo em sistema in vitro para realizar investigações relevantes da doença vascular.

Métodos de análise de interações vascular de sangue na doença cardiovascular geralmente envolvem experimentos de pesquisa animal. Resultados criados em modelos animais experimentais de pesquisa pode, no entanto, têm pouca ou nenhuma incidência da doença humana 1,2 Como tal., Existe uma necessidade de uma boa e fiável em modelos in vitro para investigar interacções celulares entre o compartimento do sangue e as células endoteliais vasculares em um sistema semelhante à humana. Temos, portanto, estabeleceu um modelo de câmara de células endoteliais do sangue. Este baseia-se num modelo descrito anteriormente utilizados para investigar interacções entre os biomateriais e sangue humano inteiro. 3 Contrariamente a outras configurações onde in vitro geralmente limitado número de componentes purificados, isto é, trombócitos, leucócitos ou células endoteliais estão disponíveis, o presente modelo incorpora todos os componentes presentes em um vaso sanguíneo. A configuração do endotelial sangue cmodelo de câmara ell é projetado para permitir o uso de sangue humano recém-colhida com pouco ou nenhum anticoagulante adicionada. Sangue armazenado durante períodos de tempo mais longos adquirir chamada lesões de armazenamento, onde quebra de eritrócitos podem interferir com delicadas interacções entre o sangue e as células endoteliais 4. Para evitar a formação de coágulos durante o manuseio de sangue total ex vivo requer ou altas doses de anticoagulante ou que todo o material em contato com o sangue tem que ser não-activação. Como superfícies não-activação são raros no ambiente de laboratório, os materiais podem, alternativamente, ser equipado com uma camada protectora de heparina imobilizada. Uma camada protectora de heparina imobilizada (daqui em diante referida como superfície Corline heparina (CHS)) que pode ser aplicado à maioria dos materiais que criam uma superfície de contacto com o sangue, onde pode ocorrer sem causar uma activação da cascata de coagulação. 5 Assim, por fornecer as câmaras com CHS, a ce endotelial sanguell modelo de câmara permite a utilização de concentrações muito baixas de anticoagulante no sangue. Evitando a adição de elevadas concentrações de anticoagulante no modelo de câmara endotelial sangue faz com que seja possível estudar interacções sensíveis no interior de um vaso sanguíneo que de outro modo poderiam ser mascarados 6. O modelo de câmara da célula endotelial arterial consiste de duas câmaras formadas anexando cilindros de plástico (altura: 8 mm; Radio: 9 mm) para uma lâmina de microscópio de plástico. Os bordos virados para cima sobre os cilindros estão equipados com ranhuras que são equipados com anéis de vedação de borracha usados ​​para vedar as câmaras de encontro à corrediça de cultura de células. As câmaras são só parcialmente cheios com o sangue como o ar deixado na câmara mantém o sangue em circulação, quando as câmaras são posteriormente rodado na posição vertical (Figura 1). A fim de avaliar a funcionalidade do modelo, foi realizada experimentos com qualquer uma CHS completamente revestidocâmara ou Umbilical Humano Veia células endoteliais (HUVEC). Dois volumes separados de sangue foram ensaiadas e a formação de trombina antitrombina (TAT), complexos de (um marcador indirecto de coagulação) foi medida com o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). Em seguida, avaliaram o efeito de volumes de sangue e fator de necrose tumoral (TNF) estimulou as células endoteliais sobre o recrutamento de leucócitos por análise de imagem. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" /> Figura 1. Configuração do modelo de câmara de células endoteliais do sangue. (A) Vista superior de desenho esquemático da câmara de sangue feitos em PMMA. (B), as células endoteliais humanas primárias são cultivadas em lâminas de câmaras 1 poços. De sangue total humano fresco é adicionado para duas câmaras numa lâmina de microscópio. As câmaras e todos os materiais utilizados para o manuseamento de sangue são tratadas com um revestimento protector HS. Depois de retirar as paredes do cell corrediça cultura, as células são colocadas de frente para o sangue e o sistema é fechado com grampos. câmaras de célula (C) O endotelial sangue são então incubadas em condições de rotação em 37 ° C. Posteriormente, as reacções no compartimento do sangue pode ser analisada por ELISA e as células endoteliais podem ser analisadas por microscopia.

<table><tbody><tr><td>Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td><td>PromoCell</td><td>C-12200</td><td>Any other type of primary human endothelial cell may be used.</td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td><td>PromoCell</td><td>C-22120</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-2500</td><td>Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.</td></tr><tr><td>TAT ELISA</td><td>Enzyme Research Lab.</td><td>TAT-EIA-C</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD16</td><td>DAKO</td><td>F7011</td><td>Dilution 1:100</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11001</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Phalloidin-Texas Red</td><td>Molecular Probes</td><td>A22287</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>Dilution 10 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-6758</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco Life Tecnologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>1 well cell culture slides</td><td>BD Falcon</td><td>354101</td><td></td></tr><tr><td>Blood Chambers</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS</td></tr><tr><td>Clamps</td><td>Office Depot</td><td>2052204</td><td></td></tr><tr><td>Corline Heparin Surface (CHS)</td><td>Corline Systems AB</td><td>945-00</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic needle</td><td>Terumo</td><td>NN-1850R</td><td>Size: 18 G x 5 mm</td></tr><tr><td>Unfractionated Heparin (UFH)</td><td>Leo Pharma</td><td>585679</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>1709958</td><td>Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Broad Institute</td><td>CellProfiler</td><td>Available for free at www.cellprofiler.org</td></tr></tbody></table>

a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium

A maioria de todas as doenças conhecidas são acompanhadas por perturbações do sistema cardiovascular. Os estudos sobre a complexidade das vias que interagem activados durante a patologias cardiovasculares são, no entanto, limitada pela falta de métodos robustos e fisiologicamente relevantes. De forma a modelar eventos patológicos vasculares temos desenvolvido um ensaio in vitro para estudar a interacção entre o endotélio e sangue total. O ensaio consiste em células endoteliais humanas primárias, que são colocados em contacto com o sangue total humano. O método utiliza sangue nativo com muito pouco ou nenhum anticoagulante, permitindo estudo das interacções entre os componentes delicados moleculares e celulares presentes em um vaso sanguíneo. Foi investigada a funcionalidade do ensaio, comparando a activação da coagulação por diferentes volumes de sangue incubadas com ou sem células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC). Considerando um volume de sangue maior contribuído paraum aumento na formação de trombina antitrombina (TAT) complexos, presença de HUVEC resultou na activação da coagulação reduzida. Além disso, foi aplicada a análise de imagens de fixação de leucócitos para HUVEC estimulado com fator de necrose tumoral (TNF) e encontrou a presença de células CD16 + para ser significativamente maior em TNFa estimulou as células, em comparação com células não estimuladas após o contato do sangue. Em conclusão, o ensaio pode ser aplicado para estudar as patologias vasculares, em que as interacções entre o endotélio e o compartimento do sangue são perturbados.

A necessidade do CHS Coating A fim de medir as reacções específicas em sangue total para aqueles induzido pelas células endoteliais, todos os materiais utilizados para a câmara da célula endotelial arterial deve ser fornecida com um revestimento CHS antes da utilização. A Figura 2A (à esquerda) mostra uma câmara não revestidos após 30 min de contato do sangue com um presente coágulo claramente visível. Tratar com a câmara de CHS (Figura 2A, à direita), por outro lado protege o sangue a partir da activação descontrolada, assegurando que os resultados são devido às interacções de células endoteliais-sangue. O efeito do volume de sangue na Câmara Ativação da coagulação é mais provável em sangue estagnado como a probabilidade de interação entre os fatores de coagulação ativados é aumentada. No modelo de câmara da célula endotelial de sangue, o sangue é mantido em movimento, devido à circulação de uma bolha de ar no interior da câmara. Em order para determinar o efeito das variações no volume de sangue, e portanto, também o tamanho da bolha de ar, uma câmara de CHS revestido foi ligado a uma lâmina de vidro revestida CHS que foi testada com 1,5 ml ou 1,75 ml de sangue total para 30 minutos. O volume de sangue sem qualquer movimento pela bolha de ar é 2,5 vezes maior quando 1,75 ml de sangue é adicionado à câmara quando comparado com 1,5 ml de sangue é usado (Figura 2B). Os valores medidos TAT sugeriu aumento TAT-formação com o aumento do volume de sangue (Figura 2D). Quando HUVEC (Figura 2C) foram incubadas ou com 1,5 ou 1,75 ml de sangue completo, nenhuma diferença foi observada entre os dois grupos, sugerindo que as células endoteliais podem modular a activação da coagulação (Figura 2D). O efeito do TNF no recrutamento de células do sangue e ativação da coagulação A fim de estudar o efeito do TNFa sobre o recrutamento de leucócitos, as HUVEC foram mimoed com 20 ng / ml TNF 4 horas antes do contato do sangue. O contato do sangue - quer com 1,5 ml ou 1,75 ml de sangue - foi continuada durante 30 min, após o que as lâminas de cultura foram coradas para CD16 (Figura 2F), representada por imagem e o número de células CD16 + foi quantificado. O recrutamento de células CD16 + aumentou significativamente com o tratamento com TNFa (Figura 2E) 100-256 células CD16 + / mm 2 (p &lt;0,0001), com 1,5 ml de sangue e 172-378 (P &lt;0,0001) com 1,75 ml de sangue. A formação de complexos de TAT foram medidos nas amostras de plasma correspondentes do sangue incubadas com células ou TNFa tratados ou não tratados (Figura 2G). Células de TNFa estimulada induzida uma duplicação aproximada dos complexos de TAT em comparação com células não tratadas. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" /> Figoure 2: Funcionalidades do modelo de câmara de células endoteliais do sangue. (A), com ou sem câmaras CHS foram incubadas com sangue inteiro. Sem CHS, um coágulo foi formado após 30 min. Medição da trombina-antitrombina (TAT) complexos, um marcador indireto de coagulação, no sangue incubadas sem CHS foi&gt; 6000 mg / ml. (B) O volume de sangue não continuou se movendo pela bolha de ar em rotação varia de acordo com diferentes volumes de sangue. Com a adição de 1,5 ml de sangue, este volume será de 0,3 ml, ao passo que irá aumentar para 0,74 ml com a adição de 1,75 ml. (C) HUVEC com imagens de microscopia de contraste de fase típica mostram a morfologia das células endoteliais de uma monocamada confluente antes de contato do sangue. (D) os valores TAT para câmaras completamente CHS revestidos mostram uma ligeira diferença quando diferentes volumes de sangue são adicionados. A adição de 1,5 ml de sangue resultou em 35 ± 11 ug / ml (n = 7) em comparação com 1,75 ml, o que resultou em 8577; 70 ug / ml de TAT (n = 8). Esta diferença já não está presente quando as HUVEC foram incubadas com os mesmos volumes do sangue; 66 ± 55 ug / ml para 1,5 ml (n = 5) e 66 ± 29 ug / ml para 1,75 ml (n = 7). (E) Quantificação do número de células CD16 + presentes em ambos não estimuladas ou estimuladas TNFa HUVEC depois contato do sangue. O número de células CD16 + é significativamente aumentada com TNFa estimulado células incubadas quer com 1,5 ml (basais: 100 ± 40 células / mm; TNFa: 256 ± 121 células / mm) ou 1,75 ml (basais: 172 ± 67 células / mm; TNF: 378 ± 185 células / mm) de sangue total (F) Imagens representativas de não estimulada e TNF estimulada HUVEC coradas para phalloidin (vermelho), CD16 (verde) e DAPI (azul).. Barra de escala = 250 um (L) A formação de complexos TAT é aproximadamente o dobro TNFa estimulada por células, em comparação com células não tratadas foram incubadas com sangue (1,5 ml:. 2.1 ± 0,1 vezes mais TAT, n = 3; 1,75 ml: 1,7 ± 1,0 vezes mais TAT, n = 4). Todos os valores são apresentados como média ± desvio padrão; os valores de p foram calculados por meio de testes t não pareado. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar as interações entre a Whole Humano Sangue e endotélio

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

9.4K visualizações.  Uppsala University. The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

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Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

A microfluídica Endothelialized para estudo das interacções microvasculares em Doenças Hematológicas

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Bioengenharia

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

In Vitro Modelo de fisiológicos e patológicos fluxo de sangue com aplicativos para Investigações de Reformas celular Vascular

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

Modelo in vitro 3D e pipeline computacional para quantificar o potencial Vasculogênico de progenitores endoteliais derivados de iPSC

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Biologia do Desenvolvimento

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Imunologia e Infecção

Diferenciação e estimulação mecânica de células endoteliais derivadas de hiPSC

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

Autor em destaque: Estudando células endoteliais derivadas de hiPSC cultivadas sob estimulação mecânica mediada por fluidos 

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

In vitro Modelo de Embarcação Humana Fetal On-chip para Estudo da Mecanobiologia do Desenvolvimento

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

In Vitro 3D Cell-Cultured Modelos arteriais para estudar a segmentação de drogas vasculares sob fluxo

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood coagulation. This phenomenon is observed in many clinical situations, like organ transplantation in the presence of pre-formed anti-donor antibodies, including xenotransplantation, as well as in ischemia/reperfusion injury. In order to reduce animal experimentation according to the 3R standards (reduction, replacement and refinement), in vitro models to study the effect of endothelial cell activation on blood coagulation would be highly desirable. However, common flatbed systems of endothelial cell culture provide a surface-to-volume ratio of 1 - 5 cm2 of endothelium per mL of blood, which is not sufficient for natural, endothelial-mediated anticoagulation. Culturing endothelial cells on microcarrier beads may increase the surface-to-volume ratio to 40 - 160 cm2/mL. This increased ratio is sufficient to ensure the &#34;natural&#34; anticoagulation of whole blood, so that the use of anticoagulants can be avoided. Here an in vitro microcarrier-based system is described to study the effects of genetic modification of porcine endothelial cells on coagulation of whole, non-anticoagulated human blood. In the described assay, primary porcine aortic endothelial cells, either wild type (WT) or transgenic for human CD46 and thrombomodulin, were grown on microcarrier beads and then exposed to freshly drawn non-anticoagulated human blood. This model allows for the measurement and quantification of cytokine release as well as activation markers of complement and coagulation in the blood plasma. In addition, imaging of activated endothelial cell and deposition of immunoglobulins, complement- and coagulation proteins on the endothelialized beads were performed by confocal microscopy. This assay can also be used to test drugs which are supposed to prevent endothelial cell activation and, thus, coagulation. On top of its potential to reduce the number of animals used for such investigations, the described assay is easy to perform and consistently reproducible.

We present an in vitro model which allows the study and analysis of coagulation in whole, non-anticoagulated blood. Anticoagulation in the system depends on the natural anticoagulation effect of healthy endothelial cells and endothelial cell activation will result in clotting.

Avaliação das propriedades das células endoteliais utilizando cultura de células 3D e sangue não anticoagulado anticoagulantes e anti-inflamatório

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Medicina

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

Modelo de doença microfluida in vitro para estudar interações endoteliais de sangue inteiro e dinâmica do coágulo sanguíneo em tempo real

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

A Novel

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A microfluídica Endothelialized para estudo das interacções microvasculares em Doenças Hematológicas

In Vitro Modelo de fisiológicos e patológicos fluxo de sangue com aplicativos para Investigações de Reformas celular Vascular

Modelo in vitro 3D e pipeline computacional para quantificar o potencial Vasculogênico de progenitores endoteliais derivados de iPSC

In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

In vitro Modelo de Embarcação Humana Fetal On-chip para Estudo da Mecanobiologia do Desenvolvimento

In vitro Modelo de Embarcação Humana Fetal On-chip para Estudo da Mecanobiologia do Desenvolvimento

In vitro Modelo de Embarcação Humana Fetal On-chip para Estudo da Mecanobiologia do Desenvolvimento

In Vitro 3D Cell-Cultured Modelos arteriais para estudar a segmentação de drogas vasculares sob fluxo

Avaliação das propriedades das células endoteliais utilizando cultura de células 3D e sangue não anticoagulado anticoagulantes e anti-inflamatório

Modelo de doença microfluida in vitro para estudar interações endoteliais de sangue inteiro e dinâmica do coágulo sanguíneo em tempo real