この研究は、n 602699（DIREKTを）°グラント契約の下、スウェーデンの研究評議会（90293501、A0290401、A0290402）、欧州共同体の第7次フレームワークプログラムからの助成金によって支えられ、NovoNordisk財団、GurliとエドワードBrunnberg財団は、セラピー、Vleugel幹財団とオーケWiberg財団。

注：血液はウプサラの倫理審査委員会（許可番号264分の2008）と承認にオープンシステムの静脈穿刺により健常人から採取した。 1.播種細胞<ol><li> PBS pH7.4中1％ゼラチンでコーティングしたT75フラスコ中、5％、37℃で培養初代ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）CO 2。 </li><li> T75のHUVECを含むフラスコ（または一次ヒト内皮細胞の他のタイプ）からの培養培地を除去し、PBSのpHは7.4で2.1 mMのEDTAを用いて細胞を洗浄する。 37℃で3分 - 1ミリリットル0.25％トリプシン-EDTAを追加し、2インキュベートすることによって細胞を剥離。 </li><li> PBS pH7.4中に9ミリリットルの10％FBSの入ったフラスコをすすぐことによって細胞を収集し、15mlチューブに細胞懸濁液を移す。 5分間735×gで細胞をスピンダウン。 </li><li>上清を除去し、内皮細胞増殖培地微小血管（EC GMMV）で慎重に細胞ペレットを再懸濁し、ビルケルチャンバー内の細胞を数える。シード21000 C1ウェル細胞培養スライド中のエル/ cm 2で、37℃でインキュベートする。培養2日 - HUVECを1の後にコンフルエントされます。光学顕微鏡下で毎日の細胞形態とフルエンシーを監視します。 </li></ol>全血の調製<ol><li>製造元の指示に従って固定化されたヘパリン（CHS）の二重層と血液と接触するすべての人工表面を準備する。ほこりから保護CHS材料がコーティングされた機能を喪失することなく6ヶ月まで室温で保存することができる。 </li><li>血液内皮室実験を開始する直前に健康なドナー（&lt;30分）から血液を描画するオープンシステム静脈穿刺を使用してください。慎重にCHSコーティングされた50ミリリットルチューブに血液を採取する前に：カップルは、皮下注射針CHS被覆されたシリコンチューブ（2ミリメートル内径）に（18 Gが50ミリメートルをX）。未分画ヘパリンと補足血液は0.75 IU / mlの最終濃度に到達する。 inveにより穏やかに血液を混ぜる3回 - チューブ2をrting。 </li></ol> 3.血液内皮商工モデル<ol><li> PMMAスライド（25×75ミリメートル）に接着されている2シリンダー（高さ8ミリメートルと半径9ミリメートル）から成るアクリルポリメチルメタクリレート（PMMA）で、血液室（トップビュー図1A）を製作する。培養内皮細胞（ 図1B）でガラススライドに対する血液チャンバをシールするゴム製のOリングで上向きシリンダの端部を取り付ける。その後垂直位置（ 図1C）中の内皮細胞と培養スライドに接続された血液チャンバーを回転させます。 </li><li>血液を活性化しないように注意しながら、各CHSコーティングされたチャンバー内に1.5ミリリットルの血液を転送するために、CHSコーティングされたピペットチップを使用してください。 </li><li>使用した初期血漿タンパク質濃度の決定のために、10mMのK 3 EDTAの最終濃度に達するように30μlの0.34 MK 3 EDTAを含む微小遠心管に転送1血液ml酵素免疫測定法（ELISA）を。慎重に血液を混ぜ、氷上にチューブを保つ。 </li><li>製造業者の指示に従って細胞培養スライドガラスのプラスチック壁を取り外し、慎重にPBS pH7.4中で細胞を洗浄する。その後スライドからできるだけ多くの液体を除去してください。細胞が完全に乾くせてはいけない。 </li><li>血液に直面して細胞を用いて、血液室の上にスライドを置きます。血液内皮細胞室の周りにクランプを置くことによって、スライドを固定します。クランプを配置するときに、細胞培養スライドガラスの破損を回避するために、追加のサポートのためのプラスチック製のスライドを使用する。 </li><li> 37℃の水浴中で回転するホイール​​上の血液内皮細胞チャンバを修正（40直径cm）の場所。 30分間の0.5×gでホイール上の各チャンバを回転させる。 </li><li>インキュベーション後、血液内皮細胞チャンバを解体。 PBS pH7.4中での細胞培養スライドを洗浄し、氷冷1％パラホルムアルデヒド（PFA）は、fで細胞を固定10分。 μlの0.34 MK 3 EDTAを30を含むマイクロ遠心チューブに各チャンバからの転送を1mlの血液を、10mM K 3 EDTAの最終濃度を達成し、穏やかにチューブを混合する。氷の上でチューブを保管してください。 </li><li> 4℃で10分間4560×gでチューブを遠心。さらなる分析まで-70℃で新しいマイクロ遠心チューブや店舗への血液の血漿を転送します。 </li></ol>血液内皮相互作用の解析4。 <ol><li>二次ヤギ抗マウスアレクサ488およびファロイジン - テキサスレッドに続くマウス抗ヒトCD16で免疫蛍光染色を行います。室温で1時間各染色工程を実行し、各ステップの間にPBS（pH7.4）中でスライドを洗浄する。室温で10分間、DAPIによる核の対比染色。このようCellProfilerのような適切な画像分析ソフトウェアを用いて画像解析と組み合わせて、蛍光顕微鏡により内皮細胞に結合した血液成分を分析する。 </li><li> QUANTIFY血漿サンプルの製造元の指示に従ってトロンビン - アンチトロンビン（TAT）をELISAで血液区画における反応。 </li><li> 例えば 、適切な統計ツールを使用してください。、不対t検定を、データを分析する。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

<html>血液と血管壁との間の複数の相互作用は、通常による内皮の非粘着性および抗血栓性のために静止状態に維持される。7炎症を伴う病理学的状態の間、内皮は接着受容体の発現8で得られた増加と活性化され止血を阻害する能力が低下。今度は血液中のカスケードシステムの9の活性化は、さらに血栓症および白血球動員を引き起こす内皮の血栓形成を増幅する。10内皮細胞および全血の間のこの微妙な相互作用のより良い理解を得るために、我々は持っている培養された内皮細胞は、全血と接触して配置されているインビトロ方法における新規に開発した。我々の知る限りでは、私たちのセットアップは、より長い期間のために全く又はほとんどない抗凝固剤とのヒト全血とインキュベートした内皮細胞を示す最初のものである。 塩基 &quot;&gt;このシステムの感度は、血液と接触して配置されるすべての表面上に固定化されたヘパリンの保護層と組み合わせてオープン系静脈穿刺によってイネーブルされる。血液調達中に開放系の使用は、静脈​​穿刺時に、カスケードシステムの活性化を減少させる抗凝固剤の自己決定された量の使用を可能にしながら、市販の真空に血液チューブは、しかし、研究の意図されたエンドポイントに応じて使用することができる。ほとんどの市販のクローズドシステムのチューブに加え、抗凝固剤の最終濃度を敏感阻害することができる、そうでなければ、ハード設定で、相互作用を研究するために、図6を保護ヘパリン表面はさらに、内皮細胞以外の表面による面接触を通る血液の活性化を排除する5確かに、未分画ヘパリンの少量を補充した全血のインキュベーションCHSの保護なしチャンバは、血餅形成をもたらした。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;チャンバー内部の気泡は、内皮細胞とのインキュベーションの間、血液の混合を可能にします。気泡サイズの影響を評価するために、我々は2つ​​の異なる血液容量を用いた。このモデルでは、我々は、HUVECとインキュベートしたチャンバ内にかかわらず、気泡の大きさの類似のTATレベルを測定した。 TATは、しかし、完全にCHS室治療に小さな気泡サイズが増加した。これは、前述した内皮細胞の特性11によれば、不活性CHSチャンバ内で不足している内皮細胞によって提供される凝固の増大した活性化の際に調節効果を示す。システム内の気泡は、チャンバの回転時の流れを生成する。バブルのサイズは、この回転システム内の力に影響を与えます。これは、より小さな気泡が血液すなわち時に減少した力を表す高いTAT値、血液の動きを作成した図2Dにおける我々の結果で示されているチャンバ内に低く、それによってカスケード系の活性化は、より高い程度で起こる。それは、このシステムでは、我々は壁や中央で最低に沿って最高速度で室内全体にスピードでは異なるであろう回転流を作成していることに言及すべきである。これは明らかに内皮細胞に対して流動する点とせん断応力との最適な環境ではないが、それでも、我々は安定した再現性のある結果を生成するシステムを有する。より最適な条件は、乱流の非存在下で循環する層流を含むであろう。これは、ここに表示されるモデルでは、しかし、不可能であり、我々の知識にこのようなシステムは、現在まで利用できません。 、システムに追加の抗凝固剤なしまたは低レベルの全血を用いて組み合わせることが可能ではない、いくつかのマイクロ流体システム市販さがあるが、それによって血液および内皮細胞に存在するすべての成分間の相互作用を適切に敏感な評価を可能にすることができない。 さらに、TNFαは、独立して、血液量のTATの重形成と組み合わせてHUVEC活性化に向けて血液細胞の動員における2倍の増加があった。これは、モデル系の安定性を検証し、また、全血との組合せで活性化された内皮細胞を使用する可能性を示している。将来、血液内皮細胞チャンバは、活性化の様々な条件やステージの下の細胞上で発現されるマーカーの種々の活性化内皮細胞に対する白血球の動員を調査するために使用することができる。さらに、モデルは、炎症状態に対する効果を評価するために、薬理学的薬剤と組み合わせて使用​​することができる。 要約すると、我々は、血管疾患の関連性の調査を実行するためにインビトロ系で完全なヒトを作成するためにヒト血液と血管細胞とチャンバモデルを組み合わせて大きな利点を示す。

心血管疾患、血液血管の相互作用を分析するための方法は、一般に、動物研究実験を含む。実験的研究、動物モデルで作成された結果はこのように、しかし、ヒトの疾患のほとんど、または全く意味を有していてもよい1,2、血液区画と血管内皮細胞間の細胞間相互作用を調査するためのインビトロモデルにおいて良好で信頼性のための必要性がある人間のようなシステム。そこで我々は、血液内皮細胞チャンバーモデルを確立している。これは、生体材料とヒト全血との間の相互作用を調査するために使用前に説明したモデルに基づいている。通常、精製された成分の数を制限し、他のin vitroでのセットアップの3反しすなわち、血小板は、白血球または内皮細胞が利用可能で、現在のモデルは、すべて組み込まれて血管中に存在する成分。 血液内皮cの設定エル室モデルはほとんど、または全く追加の抗凝固剤との新たに採取したヒト血液の使用を可能にするように設計されている。より長い期間の間保存された血液は、赤血球の破壊は、血液および内皮細胞との間の微妙な相互作用を妨害し得る、いわゆる記憶病変を取得する。4 ex vivoでの全血の取り扱い中に血餅形成を回避するために抗凝固剤または血液と接触するすべての材料が非活性である必要は、高用量のいずれかを必要とする。非活性化表面のような材料は、代替的に固定化されたヘパリンの保護層を備えていてもよい、実験室環境ではまれである。血液接触は、凝固カスケードの活性化を引き起こすことなく、発生する可能性表面を形成する大部分の材料に適用することができる固定化されたヘパリンの保護層（以下、Corlineヘパリン表面（CHS）と呼ばれる）。5したがって、とチャンバ家具によってCHS、血液内皮CEllの室モデルは、血液中の抗凝固剤の非常に低い濃度の使用を可能にする。血液内皮室モデルにおける抗凝固剤の高濃度の添加を回避する他の方法でマスクされる可能性があり、血管内の敏感な相互作用を研究することを可能にする。6 プラスチック製顕微鏡スライドに：;（9ミリメートル、半径8ミリメートル、高さ）の血液内皮細胞室モデルは、プラスチック製のシリンダーを取り付けることにより形成された二つの室から構成されています。シリンダーに上向きに縁が細胞培養スライドに対してチャンバーを密封するため使用されるゴムのOリングが付いていた溝が付いています。チャンバは部分的にしかチャンバは、その後、垂直位置（ 図1）に回転すると、チャンバ内に残された空気が移動中の血液を保持するように、血液で満たされている。 モデルの機能性を評価するために、我々は完全に被覆されたCHSのいずれかで実験を行ったチャンバまたはヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）。二つの別々の血液量をアッセイし、トロンビンアンチトロンビン（TAT）複合体（凝集の間接的マーカー）の形成は、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）で測定した。次に、血液量の影響を評価し、腫瘍壊死因子（TNFα）は、画像解析により、白血球動員に内皮細胞を刺激した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" /> 血液内皮細胞室モデルの1.セットアップ図。 （A）上部PMMAで作ら血液チャンバの概略図を表示する。（B）一次ヒト内皮細胞を、1ウェルチャンバースライド上で培養される。新鮮ヒト全血を、顕微鏡スライド上の2つのチャンバに添加される。チャンバおよび血液を処理するために使用されるすべての材料は、保護HSコーティングで処理される。 CEの壁を除去した後llの培養スライドは、細胞は血液に面して配置され、システムがシャットダウンをクランプする。（C）血液内皮細胞チャンバを37°Cで回転させながらインキュベートする。その後、血液区画における反応は、ELISAによって分析され、内皮細胞は、顕微鏡検査によって分析することができる。

<table><tbody><tr><td>Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td><td>PromoCell</td><td>C-12200</td><td>Any other type of primary human endothelial cell may be used.</td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td><td>PromoCell</td><td>C-22120</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-2500</td><td>Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.</td></tr><tr><td>TAT ELISA</td><td>Enzyme Research Lab.</td><td>TAT-EIA-C</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD16</td><td>DAKO</td><td>F7011</td><td>Dilution 1:100</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11001</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Phalloidin-Texas Red</td><td>Molecular Probes</td><td>A22287</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>Dilution 10 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-6758</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco Life Tecnologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>1 well cell culture slides</td><td>BD Falcon</td><td>354101</td><td></td></tr><tr><td>Blood Chambers</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS</td></tr><tr><td>Clamps</td><td>Office Depot</td><td>2052204</td><td></td></tr><tr><td>Corline Heparin Surface (CHS)</td><td>Corline Systems AB</td><td>945-00</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic needle</td><td>Terumo</td><td>NN-1850R</td><td>Size: 18 G x 5 mm</td></tr><tr><td>Unfractionated Heparin (UFH)</td><td>Leo Pharma</td><td>585679</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>1709958</td><td>Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Broad Institute</td><td>CellProfiler</td><td>Available for free at www.cellprofiler.org</td></tr></tbody></table>

a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium

すべての既知の疾患の大部分は、心血管系の障害を伴う。心血管病態中に活性化相互作用する経路の複雑さへの研究は、しかし、堅牢かつ生理学的に関連する方法の欠如によって制限されている。病理学的な血管イベントをモデル化するために、我々は、内皮および全血の間の相互作用を研究するためのインビトロアッセイを開発した。アッセイは、ヒト全血と接触して配置されている一次ヒト内皮細胞から構成されている。この方法は、血管内に存在する分子と細胞成分との間の微妙な相互作用の研究を可能にする、全くないか非常に少ない抗凝固剤とのネイティブな血液を利用しています。 我々は、またはヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）なしでインキュベートし、異なる血液容量によって凝固の活性を比較することによって、アッセイの機能性を調べた。大きな血液量はに貢献したのに対し、トロンビンはアンチトロンビン（TAT）複合体の形成の増加は、HUVECの存在は、凝固の減少活性化をもたらした。さらに、本 ​​発明者らは、腫瘍壊死因子（TNFα）で刺激し、CD16 +細胞の存在は、TNFαに有意に高いことが見出さHUVECへの白血球の付着の画像解析を適用し、血液接触後の非刺激細胞と比較して、細胞を刺激した。結論として、アッセイは、内皮および血液区画との間の相互作用が乱されている血管の病理を研究するために適用することができる。

CHSコーティングの必要性内皮細胞によって誘発されるものと、特定の全血での反応を測定するために、血液内皮細胞チャンバに使用されるすべての材料は、使用前にCHSコーティングを提出しなければならない。 図2A（左）の30分後、コーティングされていないチャンバを示しているはっきりと見えるクロット存在と血液接触。一方、CHSとの室（ 図2A、右）を治療することは結果が内皮細胞の血液の相互作用によるものであることを確認して、制御不能な活性化からの血液を保護します。 チャンバー内の血液量の影響活性化された凝固因子の間の相互作用の確率が増加するにつれて、凝固の活性化は、停滞血液中の可能性が高い。血液内皮細胞室モデルでは、血液に起因チャンバ内の気泡の循環に運動状態に維持される。 O中血液量の変化、ひいては気泡サイズの効果を決定するRDER、CHSコーティングされたチャンバーを1.5 mlまたは1.75ミリリットル、30分間、全血を用いて試験したCHSコーティングされたガラススライドに接続した。血液1.75mlの血液を1.5mlの（ 図2B）を用いた場合と比較して、チャンバーに添加されたときに気泡による任意の動きなしでの血液の体積が2.5倍大きい。測定されたTAT-値が増加した血液量（ 図2D）と増加したTAT-形成を示唆した。 HUVEC（ 図2C）は 、全血の1.5または1.75ミリリットルのいずれかとインキュベートした場合、差異は内皮細胞が凝固の活性化（ 図2D）を調節し得ることを示唆し、両群間で認められなかった。 血液細胞動員に対するTNFαの効果と凝固の活性化白血球動員に対するTNFαの効果を研究するために、HUVECを治療するた20ng / mlの前に血液接触へのTNFα4時間とエド。血液接触- 2.4 mlまたは1.75ミリリットルの血液のいずれかでは、 -培養スライドを画像化し、CD16 +細胞の数を定量した、CD16（ 図2F）について染色した後、30分間継続した。 CD16 +細胞の動員を、1.5mlの血液を100〜256 CD16 +細胞/ mm 2（p &lt;0.0001）からのTNFα処理（ 図2E）で有意に増加し、172から1.75ミリリットルの血液と378（P &lt;0.0001）である。 TAT複合体の形成は、TNFα処理又は未処理細胞のいずれか（ 図2G）とインキュベートした血液の対応する血漿サンプル中で測定した。未処理の細胞と比較して、TNFα刺激細胞は、TAT複合体の約2倍を誘導した。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" /> イチジクURE 2：血液内皮細胞室モデルの機能性。 CHSの有無にかかわらず、（A）チャンバーは、全血とともにインキュベートした。 CHSことなく、血餅を30分後に形成された。 CHSなしでインキュベートした血液中のトロンビン-アンチトロンビン（TAT）複合体は、凝固の間接的なマーカーの測定は、&gt; 6000 / mlであった。（B）血液の量は、異なる血液量に応じて変化する回転気泡により移動維持されない。コンフルエント単層の位相差顕微鏡ショー典型的な内皮細胞形態で画像化し、それが1.75ミリリットルを加えて0.74ミリリットルに増加するのに対し、血液1.5mlを追加すると、このボリュームは、0.3ミリリットルになります。（C）HUVECの前に異なる血液ボリュームが追加されたときに完全にコーティングされたCHS室用の血液接触。（D）のTAT値はわずかな違いを示しています。 1.5ミリリットルの血液を添加すると、85が得られた1.75ミリリットルに±11μg/ mlのた（n = 7）と比較して35を生じた77。 70 / mlのTATた（n = 8）。 HUVECは、同じ血液量と共にインキュベートされた場合、この差は、もはや存在しない。 1.5ミリリットルのための66±55μgの/ mlである（n = 5）で66±29 1.75ミリリットル（nは7 =）非刺激またはTNFαのいずれかでCD16 +細胞の数の（E）定量存在した後にHUVECを刺激するためのμg/ mlの血液接触。 CD16 +細胞の数が有意にTNFαと共に増加されるか、1.5ミリリットル（基礎：100±40細胞/ mm;TNFα：256±121細胞/ mm）とインキュベートした細胞刺激1.75ミリリットル（基礎：172±67細胞/ mmと、 TNFα：全血の378±185細胞/ mm）（F）HUVECはファロイジン（赤色について染色刺激され、刺激されていないとTNFαの代表的な画像）、CD16（緑色）及びDAPI（青色）。スケールバー=250μmの血液（1.5 mlをインキュベート未処理細胞と比較してTAT複合体の形成はほぼTNFαによって倍増される（G）の細胞を刺激した：2。1±0.1倍のTAT、n = 3である。 1.75ミリリットル：1.7±1.0倍のTATはn = 4）。すべての値は平均±標準偏差として提示されている。 p値は、不対t検定によって計算した。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

小説<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト全血と内皮の間の相互作用を研究するためのモデル

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

a-novel-vitro-model-for-studying-interactions-between-human-whole

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

9.3K ビュー.  Uppsala University. The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

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Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

生物工学

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

免疫・感染学

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

血管細胞リモデリングの研究への応用生理学的および病理学的血流のインビトロモデル

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

hiPSC由来内皮細胞の分化と機械的刺激

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

著者スポットライト:流体媒介性機械的刺激下で培養されたhiPSC由来内皮細胞の研究 

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

イン・ビトロ 発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

発生生物学

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

流れの下で標的とする血管薬を研究するためのin Vitro 3D細胞培養動脈モデル

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood coagulation. This phenomenon is observed in many clinical situations, like organ transplantation in the presence of pre-formed anti-donor antibodies, including xenotransplantation, as well as in ischemia/reperfusion injury. In order to reduce animal experimentation according to the 3R standards (reduction, replacement and refinement), in vitro models to study the effect of endothelial cell activation on blood coagulation would be highly desirable. However, common flatbed systems of endothelial cell culture provide a surface-to-volume ratio of 1 - 5 cm2 of endothelium per mL of blood, which is not sufficient for natural, endothelial-mediated anticoagulation. Culturing endothelial cells on microcarrier beads may increase the surface-to-volume ratio to 40 - 160 cm2/mL. This increased ratio is sufficient to ensure the &#34;natural&#34; anticoagulation of whole blood, so that the use of anticoagulants can be avoided. Here an in vitro microcarrier-based system is described to study the effects of genetic modification of porcine endothelial cells on coagulation of whole, non-anticoagulated human blood. In the described assay, primary porcine aortic endothelial cells, either wild type (WT) or transgenic for human CD46 and thrombomodulin, were grown on microcarrier beads and then exposed to freshly drawn non-anticoagulated human blood. This model allows for the measurement and quantification of cytokine release as well as activation markers of complement and coagulation in the blood plasma. In addition, imaging of activated endothelial cell and deposition of immunoglobulins, complement- and coagulation proteins on the endothelialized beads were performed by confocal microscopy. This assay can also be used to test drugs which are supposed to prevent endothelial cell activation and, thus, coagulation. On top of its potential to reduce the number of animals used for such investigations, the described assay is easy to perform and consistently reproducible.

We present an in vitro model which allows the study and analysis of coagulation in whole, non-anticoagulated blood. Anticoagulation in the system depends on the natural anticoagulation effect of healthy endothelial cells and endothelial cell activation will result in clotting.

3 D 細胞培養と非高血圧症全血を用いた血管内皮細胞の抗凝固および抗炎症作用の評価

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

医学

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

小説

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血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

血管細胞リモデリングの研究への応用生理学的および病理学的血流のインビトロモデル

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

イン・ビトロ発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

イン・ビトロ発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

イン・ビトロ発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

流れの下で標的とする血管薬を研究するためのin Vitro 3D細胞培養動脈モデル

3 D 細胞培養と非高血圧症全血を用いた血管内皮細胞の抗凝固および抗炎症作用の評価

全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

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血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

血管細胞リモデリングの研究への応用生理学的および病理学的血流のインビトロモデル

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

イン・ビトロ 発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

イン・ビトロ 発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

イン・ビトロ 発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

流れの下で標的とする血管薬を研究するためのin Vitro 3D細胞培養動脈モデル

3 D 細胞培養と非高血圧症全血を用いた血管内皮細胞の抗凝固および抗炎症作用の評価

全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

イン・ビトロ発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

イン・ビトロ発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

イン・ビトロ発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル