Este estudio fue apoyado por subvenciones del Consejo Sueco de Investigación (90293501, A0290401, A0290402), del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea en virtud de acuerdo de subvención n ° 602699 (DIREKT), la Fundación NovoNordisk, la Fundación Gurli y Edward Brunnberg, Tallo Terapia, Vleugel Fundación y Fundación Åke Wiberg.

NOTA: Se extrajo sangre de individuos sanos por venopunción sistema abierto en señal de aprobación ante la Junta de Revisión Ética en Uppsala (Permit No. 2008/264). 1. Las células Siembra <ol><li> Células de cultivo primarias humanas endoteliales de vena umbilical (HUVEC) a 37 ° C en 5% de CO 2 en matraces T75 recubiertos con gelatina al 1% en PBS pH 7,4. </li><li> Retire el medio de cultivo de un frasco T75 que contiene HUVEC (u otro tipo de células endoteliales humanas primarias) y lavar las células con EDTA 2,1 mM en PBS pH 7,4. Separar las células mediante la adición de 1 ml 0,25% de tripsina-EDTA y se incubó durante 2 - 3 minutos en 37 ° C. </li><li> Recoger las células por lavado el matraz con 9 ml 10% de FBS en PBS pH 7,4 y transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml. Centrifugar las células a 735 xg durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular cuidadosamente en medio de crecimiento celular endotelial microvascular (CE GMMV) y contar las células en una cámara de Bürker. Semillas 21.000 cells / cm 2 en las diapositivas de cultivo de células de 1 pocillo e incubar a 37 ° C. El HUVEC se confluente después de 1 - 2 días de cultivo. Monitorear la morfología celular y la confluencia diariamente bajo un microscopio de luz. </li></ol> 2. Preparación de sangre entera <ol><li> Preparar todas las superficies artificiales que estarán en contacto con la sangre con una doble capa de heparina inmovilizada (CHS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Materiales recubiertos CHS protegido del polvo se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta 6 meses sin pérdida de la función. </li><li> Utilice venopunción sistema abierto para extraer la sangre de un donante sano en breve (&lt;30 min) antes de comenzar el experimento endotelial cámara de sangre. Pareja de una aguja hipodérmica (18 G x 50 mm) a CHS tubo de silicona recubierto (diámetro interno: 2 mm) antes de recoger cuidadosamente la sangre en un tubo de 50 ml recubiertos CHS. Suplemento de sangre con heparina no fraccionada para llegar a una concentración final de 0,75 UI / ml. Mezclar suavemente la sangre por inverting el tubo de 2 - 3 veces. </li></ol> Modelo 3. Sangre Cámara endotelial <ol><li> Fabrique cámaras de sangre (Figura 1A; vista superior) en acrílico polimetilmetacrilato (PMMA) que consta de dos cilindros (altura 8 mm y el radio de 9 mm) que se pegan a una diapositiva de PMMA (25 x 75 mm). Coloque los bordes de los cilindros hacia arriba con juntas tóricas de goma para sellar la cámara de sangre contra los portaobjetos de vidrio con las células endoteliales en cultivo (Figura 1B). Girar las cámaras de sangre conectados a la diapositiva cultivo con células endoteliales a partir de entonces en una posición vertical (Figura 1C). </li><li> Utilice una punta de pipeta CHS recubierto de transferir 1,5 ml de sangre en cada CHS recubiertos cámara teniendo cuidado de no activar la sangre. </li><li> Transferir 1 ml de sangre en tubos de microcentrífuga que contiene 30 l 0,34 MK 3 EDTA para llegar a una concentración final de 10 mM K 3 EDTA para la determinación de las concentraciones de proteína de plasma inicial utilizandoun ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Mezclar con cuidado la sangre y mantener los tubos en hielo. </li><li> Retire las paredes de plástico del cultivo celular portaobjetos de vidrio de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cuidadosamente lavar las células en PBS pH 7,4. Asegúrese de eliminar posteriormente tanto líquido como sea posible de las diapositivas. No dejes que las células se sequen. </li><li> Posicionar el cursor en la parte superior de las cámaras de sangre, con células que se enfrenta la sangre. Fije la corredera mediante la colocación de una abrazadera alrededor de la cámara de células endoteliales de sangre. Utilice un portaobjetos de plástico para soporte adicional para evitar la rotura de la lámina de vidrio de cultivo celular al colocar la abrazadera. </li><li> Fijar la cámara de células endoteliales de la sangre en una rueda giratoria (40 cm de diámetro) en lugar de un baño de agua a 37 ° C. Girar cada cámara en la rueda en 0,5 xg durante 30 min. </li><li> Después de la incubación, desmantelar la cámara de células endoteliales en la sangre. Lavar los portaobjetos de cultivo de células en PBS pH 7,4 y fijar las células en hielo frío 1% de paraformaldehído (PFA) fo 10 min. Transferir 1 ml de sangre de cada cámara a tubos de microcentrífuga que contiene 30 l 0,34 MK 3 EDTA para llegar a una concentración final de 10 mM K 3 EDTA y mezclar suavemente los tubos. Mantener los tubos en hielo. </li><li> Centrifugar los tubos a 4.560 xg durante 10 minutos en 4 ° C. Transferir el plasma de la sangre a los nuevos tubos de microcentrífuga y tienda en -70 ° C hasta su posterior análisis. </li></ol> 4. Análisis de sangre endotelial Interacciones <ol><li> Lleve a cabo la tinción de inmunofluorescencia con el ratón anti-CD16 humano seguido de cabra secundario anti-ratón Alexa 488 y phalloidin-TexasRed. Realizar cada etapa de tinción durante 1 hora a temperatura ambiente y lavar los portaobjetos en PBS pH 7,4 entre cada paso. Contratinción los núcleos con DAPI durante 10 min a temperatura ambiente. Analizar los componentes sanguíneos unidos a las células endoteliales por microscopía de fluorescencia en combinación con análisis de imagen usando el software de análisis de imagen adecuado tal como CellProfiler. </li><li> Quantify las reacciones en el compartimento de la sangre con trombina-antitrombina (TAT) ELISA según las instrucciones del fabricante de las muestras de plasma. </li><li> Usar herramientas estadísticas adecuadas, por ejemplo., Una prueba t no pareada, para analizar los datos. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

<html> Múltiples interacciones entre la sangre y la pared del vaso se mantienen normalmente en un estado de reposo debido a la naturaleza no adhesiva y anti-trombótica del endotelio. 7 Durante condiciones patológicas que implican inflamación, el endotelio se activa con un aumento resultante en la expresión del receptor de adhesión y 8 una capacidad reducida para inhibir la hemostasia. 9 La activación de los sistemas de cascada en la sangre a su vez amplifica la trombogenicidad del endotelio causando más la trombosis y el reclutamiento de leucocitos. 10 Para obtener una mejor comprensión de este delicado interacciones entre las células endoteliales y la sangre entera, tenemos desarrollado un nuevo método in vitro donde las células endoteliales cultivadas se colocan en contacto con la sangre entera. Para nuestro conocimiento, nuestra configuración es el primero en mostrar las células endoteliales incubadas con sangre humana entera con ninguna o muy poca anticoagulante durante períodos de tiempo más largos. nt &quot;&gt; La sensibilidad de este sistema se activa por punción venosa sistema abierto en combinación con una capa protectora de heparina inmovilizada en todas las superficies puestas en contacto con la sangre. El uso de un sistema abierto durante la obtención de la sangre reduce la activación de los sistemas de cascada durante la punción venosa mientras que permite el uso de una cantidad autodeterminada de anticoagulante. tubos de sangre evacuados disponibles en el mercado pueden, sin embargo, ser utilizados en función de los criterios de valoración previstos del estudio. La concentración final de anticoagulante añadido a los tubos del sistema cerrado más disponibles en el mercado pueden inhibir sensible , y de otra manera difícil de estudiar, las interacciones en la configuración. 6 una superficie protectora heparina elimina la activación adicional de sangre a través de la superficie de contacto por cualquier superficies que no sean las células endoteliales. 5 De hecho, la incubación de la sangre entera suplementado con una pequeña cantidad de heparina no fraccionada en cámara sin la protección de CHS resultó en la formación de coágulos. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; La burbuja de aire dentro de la cámara permite que la mezcla de la sangre durante la incubación con las células endoteliales. Con el fin de evaluar el efecto del tamaño de la burbuja de aire, se utilizaron dos volúmenes de sangre diferentes. En este modelo, que mide los niveles de TAT similares independientemente del tamaño de las burbujas de aire en las cámaras incubadas con HUVEC. TAT fue, sin embargo, aumentó con un tamaño de burbuja de aire más pequeño en las cámaras totalmente CHS tratada. Esto, de acuerdo con las propiedades descritas anteriormente de células endoteliales 11, indica un efecto regulador sobre el aumento de la activación de la coagulación proporcionado por las células endoteliales que se carece en la cámara de CHS inerte. La burbuja de aire en el sistema crea un flujo después de la rotación de la cámara. El tamaño de la burbuja afectará a las fuerzas dentro de este sistema de rotación. Esto se muestra por nuestros resultados en la Figura 2D fuera una burbuja más pequeño crea valores TAT más altos representan una disminución de la fuerza de la sangre es decir, el movimiento de la sangredentro de la cámara es menor y por lo tanto la activación del sistema de cascada se produce en un grado superior. Cabe mencionar que en este sistema que estamos creando un flujo giratorio que será diferente en la velocidad a través de la cámara con la velocidad más alta a lo largo de las paredes y la más baja en el centro. Esto no es, obviamente, un ambiente óptimo en lo que respecta al flujo y esfuerzo de corte para las células endoteliales, pero todavía tenemos un sistema que produce resultados estables y repetibles. Condiciones óptimas incluirían circulación de flujo laminar en ausencia de turbulencia. Esto es, sin embargo, no es posible en el modelo representado aquí y a nuestro conocimiento un sistema de este tipo no está disponible hasta la fecha. Aunque, hay varios sistemas de microfluidos comercialmente disponibles que no son posibles para combinar con sangre entera sin o con bajos niveles de anticoagulante añadido al sistema de ese modo dejar de permitir la evaluación sensible adecuada de las interacciones entre todos los componentes presentes en la sangre y las células endoteliales. Además, hubo un aumento de 2 veces en el reclutamiento de células de la sangre hacia TNF activa HUVEC en combinación con una formación de TAT duplicado independientemente del volumen de sangre. Esto verifica la estabilidad del sistema de modelo y también muestra la posibilidad de utilizar un endotelio activado en combinación con la sangre entera. Future en, la cámara de células endoteliales de sangre se puede utilizar para investigar el reclutamiento de células de la sangre hacia las células endoteliales activadas por una variedad de marcadores expresados ​​en las células en diversas condiciones y etapas de activación. Además, el modelo se puede usar en combinación con agentes farmacológicos con el fin de evaluar los efectos sobre las condiciones inflamatorias. En resumen, mostramos el gran beneficio de la combinación de un modelo de cámara con las células sanguíneas y vasculares humanas para crear un humano completo sistema in vitro para llevar a cabo investigaciones relevantes de la enfermedad vascular.

Métodos para el análisis de las interacciones de la sangre vascular en la enfermedad cardiovascular generalmente implican experimentos de investigación animal. Resultados creados en modelos animales experimentales de investigación pueden, sin embargo, tienen poca o ninguna incidencia en las enfermedades humanas. 1,2 Como tal, hay una necesidad de una buena y fiable en modelos in vitro para investigar las interacciones celulares entre el compartimiento de la sangre y las células endoteliales vasculares en un sistema similar a la humana. Por ello, hemos establecido un modelo de cámara de las células endoteliales en la sangre. Esto se basa en un modelo descrito previamente utilizado para investigar las interacciones entre los biomateriales y sangre humana entera. 3 Contrariamente a otras configuraciones in vitro, donde por lo general un número limitado de componentes purificados, es decir, trombocitos, leucocitos o células endoteliales están disponibles, el actual modelo incorpora todos los componentes presentes en un vaso sanguíneo. La configuración del endotelio arterial cmodelo de cámara de ell está diseñado para permitir el uso de la sangre humana recién extraída con poco o ningún anticoagulante añadido. La sangre almacenada durante períodos de tiempo más largos adquirir los llamados lesiones de almacenamiento donde ruptura de los eritrocitos puede interferir con delicadas interacciones entre la sangre y las células endoteliales. 4 Para evitar la formación de coágulos durante la manipulación de sangre entera ex vivo o bien requiere altas dosis de anticoagulante o que todo el material en contacto con la sangre tiene que ser no activante. Como superficies no activadoras son raros en el entorno de laboratorio, materiales, alternativamente, pueden estar equipados con una capa protectora de heparina inmovilizada. Una capa protectora de heparina inmovilizada (denominado en lo sucesivo como superficie de heparina Corline (CHS)) que se puede aplicar a la mayoría de los materiales de la creación de una superficie donde puede producirse contacto con la sangre sin causar una activación de la cascada de la coagulación. 5 Por lo tanto, mediante el suministro de las cámaras con CHS, el ce endotelial arterialll modelo de cámara permite el uso de concentraciones muy bajas de anticoagulante en la sangre. Evitar la adición de altas concentraciones de anticoagulante en el modelo de cámara endotelial sangre hace que sea posible estudiar interacciones sensibles dentro de un vaso sanguíneo que de otro modo podrían ser enmascarado. 6 El modelo de cámara de las células endoteliales de la sangre se compone de dos cámaras formadas uniendo cilindros de plástico (altura: 8 mm; radio: 9 mm) a un portaobjetos de plástico. Los bordes hacia arriba en los cilindros están equipadas con ranuras que están equipados con juntas tóricas de caucho utilizadas para el sellado de las cámaras contra el portaobjetos de cultivo celular. Las cámaras están sólo parcialmente llenos de sangre como el aire que queda en la cámara mantiene la sangre en movimiento cuando las cámaras se hacen girar posteriormente en una posición vertical (Figura 1). Con el fin de evaluar la funcionalidad del modelo, hemos realizado experimentos con ya sea un CHS recubierto completamentecámara o de vena umbilical humana células endoteliales (HUVEC). Dos volúmenes de sangre separadas se analizaron y la formación de trombina antitrombina (TAT) complejos (un marcador indirecto de la coagulación) se midió con ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). A continuación, se evaluó el efecto de los volúmenes de sangre y factor de necrosis tumoral (TNF) estimulado las células endoteliales en el reclutamiento de leucocitos por análisis de imagen. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" /> Figura 1. Configuración del modelo de cámara de las células endoteliales en la sangre. (A) Vista superior dibujo esquemático de la cámara de sangre realizado en PMMA. (B) las células endoteliales humanas primarias son cultivadas en portaobjetos de cámara 1 pocillos. Sangre completa humana fresca se añade a dos cámaras en un portaobjetos de microscopio. Las cámaras y todo el material utilizado para la manipulación de la sangre se tratan con un recubrimiento de protección HS. Después de la eliminación de las paredes de la cell cultura de diapositivas, las células se colocan frente a la sangre y el sistema se sujeta cerrada. cámaras celulares (C) El endotelial sangre se incuban a continuación en virtud de la rotación en 37 ° C. Después, las reacciones en el compartimento de la sangre pueden ser analizadas por ELISA y las células endoteliales pueden ser analizados por microscopía.

<table><tbody><tr><td>Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td><td>PromoCell</td><td>C-12200</td><td>Any other type of primary human endothelial cell may be used.</td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td><td>PromoCell</td><td>C-22120</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-2500</td><td>Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.</td></tr><tr><td>TAT ELISA</td><td>Enzyme Research Lab.</td><td>TAT-EIA-C</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD16</td><td>DAKO</td><td>F7011</td><td>Dilution 1:100</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11001</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Phalloidin-Texas Red</td><td>Molecular Probes</td><td>A22287</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>Dilution 10 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-6758</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco Life Tecnologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>1 well cell culture slides</td><td>BD Falcon</td><td>354101</td><td></td></tr><tr><td>Blood Chambers</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS</td></tr><tr><td>Clamps</td><td>Office Depot</td><td>2052204</td><td></td></tr><tr><td>Corline Heparin Surface (CHS)</td><td>Corline Systems AB</td><td>945-00</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic needle</td><td>Terumo</td><td>NN-1850R</td><td>Size: 18 G x 5 mm</td></tr><tr><td>Unfractionated Heparin (UFH)</td><td>Leo Pharma</td><td>585679</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>1709958</td><td>Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Broad Institute</td><td>CellProfiler</td><td>Available for free at www.cellprofiler.org</td></tr></tbody></table>

a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium

La mayoría de todas las enfermedades conocidas se acompañan de trastornos del sistema cardiovascular. Los estudios sobre la complejidad de las vías que interactúan activados durante patologías cardiovasculares son, sin embargo, limitadas por la falta de métodos robustos y fisiológicamente relevantes. Con el fin de modelar eventos vasculares patológicas hemos desarrollado un ensayo in vitro para el estudio de la interacción entre el endotelio y la sangre entera. El ensayo consiste en células endoteliales humanas primarias, que se colocan en contacto con sangre humana entera. El método utiliza la sangre nativa con muy poco o ningún anticoagulante, que permite el estudio de las interacciones entre los delicados componentes moleculares y celulares presentes en un vaso sanguíneo. Hemos investigado la funcionalidad del ensayo mediante la comparación de activación de la coagulación por diferentes volúmenes de sangre incubadas con o sin células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). Mientras que un volumen de sangre mayor contribuyó aun aumento en la formación de complejos de antitrombina trombina (TAT), la presencia de HUVEC dio como resultado reducción de la activación de la coagulación. Además, se aplicó análisis de imagen de unión de leucocitos a HUVEC estimuladas con factor de necrosis tumoral (TNF) y se encontró la presencia de células CD16 + a ser significativamente mayor en las células estimuladas TNF en comparación con células no estimuladas después de contacto con la sangre. En conclusión, el ensayo se puede aplicar para estudiar patologías vasculares, donde se perturban las interacciones entre el endotelio y el compartimiento de sangre.

La necesidad de la CHS Recubrimiento Para medir reacciones en sangre entera específicas para los provocados por las células endoteliales, todos los materiales utilizados para la cámara de células endoteliales de sangre deben estar provistas de un revestimiento CHS antes de su uso. Figura 2A (izquierda) muestra una cámara sin recubrimiento después de 30 min de contacto de la sangre con un coágulo claramente visible presente. El tratamiento de la cámara con CHS (Figura 2A, derecha) en el otro lado protege la sangre de activación incontrolada, asegurándose de que los resultados son debido a las interacciones de células endoteliales de sangre. El efecto del volumen de sangre en la Cámara La activación de la coagulación es más probable en sangre estancada medida que se incrementa la probabilidad de interacción entre los factores de coagulación activados. En el modelo de cámara de células endoteliales de sangre, la sangre se mantiene en movimiento debido a la circulación de una burbuja de aire dentro de la cámara. En Order para determinar el efecto de los cambios en el volumen de sangre, y por lo tanto también el tamaño de burbuja de aire, una cámara de CHS recubierto se conecta a un portaobjetos de vidrio recubierto de CHS que fue probado con 1,5 ml o 1,75 ml de sangre entera para 30 min. El volumen de sangre sin ningún movimiento por la burbuja de aire es 2,5 veces más grandes cuando se añade 1,75 ml de sangre a la cámara en comparación a cuando se utiliza 1,5 ml de sangre (Figura 2B). Los TAT-valores medidos sugirieron aumentaron TAT-formación con un mayor volumen de sangre (Figura 2D). Cuando HUVEC (Figura 2C) se incubaron con 1,5 o 1,75 ml de sangre entera, no se observó ninguna diferencia entre los dos grupos, lo que sugiere que las células endoteliales pueden modular la activación de la coagulación (Figura 2D). El efecto de TNF en el reclutamiento de células de la sangre y la activación de la coagulación Con el fin de estudiar el efecto de TNF en el reclutamiento de leucocitos, HUVEC fueron treated con 20 ng / ml TNF 4 h antes de contacto con la sangre. Se continuó durante 30 min después de lo cual los portaobjetos de cultivo fueron teñidos para CD16 (Figura 2F), la imagen y el número de células CD16 + se cuantificó - contacto de la sangre - ya sea con 1,5 ml o 1,75 ml de sangre. El reclutamiento de células CD16 + se incrementó significativamente con el tratamiento con TNF (Figura 2E) 100-256 CD16 + células / mm 2 (p &lt;0,0001) con 1,5 ml de sangre y 172 a 378 (P &lt;0,0001) con 1,75 ml de sangre. La formación de complejos TAT se midió en las muestras de plasma correspondientes de la sangre incubadas con células ya sea TNF tratado o no tratado (Figura 2G). Células TNF estimulada indujeron una duplicación aproximada de complejos TAT ​​en comparación con las células no tratadas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" /> HigoUre 2: Funcionalidad del modelo de cámara de células endoteliales de sangre. (A) Cámaras con o sin CHS se incubaron con sangre completa. Sin CHS, se formó un coágulo después de 30 minutos. Medición de la trombina antitrombina (TAT-) complejos, un marcador indirecto de la coagulación en la sangre, incubadas sin CHS era&gt; 6.000 mg / ml. (B) El volumen de sangre no siguió moviéndose por la burbuja de aire que gira variará con diferentes volúmenes de sangre. Con la adición de 1,5 ml de sangre, este volumen será 0,3 ml, mientras que se incrementará a 0,74 ml con la adición de 1,75 ml. (C) HUVEC con imagen formada con microscopía de contraste de fase muestran la morfología típica de células endoteliales de una monocapa confluente antes de contacto con la sangre. (D) los valores de TAT para cámaras completamente CHS recubiertos muestran una ligera diferencia cuando se añaden diferentes volúmenes de sangre. La adición de 1,5 ml de sangre resultó en 35 ± 11 g / ml (n = 7) en comparación con 1,75 ml, lo que resultó en el 8577; 70 mg / ml TAT (n = 8). Esta diferencia ya no está presente cuando HUVEC se incuban con los mismos volúmenes de sangre; 66 ± 55 mg / ml de 1,5 ml (n = 5) y 66 ± 29 mg / ml de 1,75 ml (n = 7). (E) Cuantificación del número de células CD16 + presentes en ambos no estimulada o TNF estimulada después de HUVECs contacto con la sangre. El número de células CD16 + se incrementa significativamente con TNFa estimula las células incubadas ya sea con 1,5 ml (basal: 100 ± 40 células / mm; TNFa: 256 ± 121 células / mm) o 1,75 ml (basal: 172 ± 67 células / mm; TNFa: 378 ± 185 células / mm) de sangre completa (F) Imágenes representativas de no estimulada y TNFa estimulado HUVEC teñidas para phalloidin (rojo), CD16 (verde) y DAPI (azul).. Barra de escala = 250 m (G) La formación de complejos TAT se duplicó aproximadamente por TNFa células estimuladas en comparación con las células no tratadas se incubaron con sangre (1,5 ml:. 2.1 ± 0,1 veces más TAT, n = 3; 1.75 ml: 1,7 ± 1,0 veces más TAT, n = 4). Todos los valores se presentan como media ± desviación estándar; los valores de p se calcularon mediante pruebas t no apareados. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a>

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A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

Una Novela<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para el estudio de las interacciones entre Whole Sangre humana y del endotelio

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

a-novel-vitro-model-for-studying-interactions-between-human-whole

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

9.3K vistas.  Uppsala University. The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

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Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Microfluídica endotelizado para estudiar las interacciones microvasculares en Enfermedades Hematológicas

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Investigación

Bioingeniería

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

En Vitro Modelo de fisiológicos y patológicos de flujo de sangre con aplicación a las investigaciones de remodelado vascular celular

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

Un modelo 3D In Vitro y una tubería computacional para cuantificar el potencial vasculogénico de los progenitores endoteliales derivados de iPSC

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Biología del Desarrollo

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Inmunología e Infección

Diferenciación y estimulación mecánica de células endoteliales derivadas de hiPSC

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

Autor destacado: Estudio de células endoteliales derivadas de hiPSC cultivadas bajo estimulación mecánica mediada por fluidos 

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

In vitro Modelo de vaso humano fetal en chip para estudiar la mecanobiología del desarrollo

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

In Vitro 3D Cultivos Celulares Modelos Arteriales Para El Estudio De La Droga Vascular Dirigida Bajo Flujo

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood coagulation. This phenomenon is observed in many clinical situations, like organ transplantation in the presence of pre-formed anti-donor antibodies, including xenotransplantation, as well as in ischemia/reperfusion injury. In order to reduce animal experimentation according to the 3R standards (reduction, replacement and refinement), in vitro models to study the effect of endothelial cell activation on blood coagulation would be highly desirable. However, common flatbed systems of endothelial cell culture provide a surface-to-volume ratio of 1 - 5 cm2 of endothelium per mL of blood, which is not sufficient for natural, endothelial-mediated anticoagulation. Culturing endothelial cells on microcarrier beads may increase the surface-to-volume ratio to 40 - 160 cm2/mL. This increased ratio is sufficient to ensure the &#34;natural&#34; anticoagulation of whole blood, so that the use of anticoagulants can be avoided. Here an in vitro microcarrier-based system is described to study the effects of genetic modification of porcine endothelial cells on coagulation of whole, non-anticoagulated human blood. In the described assay, primary porcine aortic endothelial cells, either wild type (WT) or transgenic for human CD46 and thrombomodulin, were grown on microcarrier beads and then exposed to freshly drawn non-anticoagulated human blood. This model allows for the measurement and quantification of cytokine release as well as activation markers of complement and coagulation in the blood plasma. In addition, imaging of activated endothelial cell and deposition of immunoglobulins, complement- and coagulation proteins on the endothelialized beads were performed by confocal microscopy. This assay can also be used to test drugs which are supposed to prevent endothelial cell activation and, thus, coagulation. On top of its potential to reduce the number of animals used for such investigations, the described assay is easy to perform and consistently reproducible.

We present an in vitro model which allows the study and analysis of coagulation in whole, non-anticoagulated blood. Anticoagulation in the system depends on the natural anticoagulation effect of healthy endothelial cells and endothelial cell activation will result in clotting.

Evaluación de las propiedades anticoagulantes y antiinflamatorias de las células endoteliales mediante cultivo celular 3D y sangre no anticoagulada

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Medicina

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

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Microfluídica endotelizado para estudiar las interacciones microvasculares en Enfermedades Hematológicas

En Vitro Modelo de fisiológicos y patológicos de flujo de sangre con aplicación a las investigaciones de remodelado vascular celular

Un modelo 3D In Vitro y una tubería computacional para cuantificar el potencial vasculogénico de los progenitores endoteliales derivados de iPSC

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

In vitro Modelo de vaso humano fetal en chip para estudiar la mecanobiología del desarrollo

In vitro Modelo de vaso humano fetal en chip para estudiar la mecanobiología del desarrollo

In vitro Modelo de vaso humano fetal en chip para estudiar la mecanobiología del desarrollo

In Vitro 3D Cultivos Celulares Modelos Arteriales Para El Estudio De La Droga Vascular Dirigida Bajo Flujo

Evaluación de las propiedades anticoagulantes y antiinflamatorias de las células endoteliales mediante cultivo celular 3D y sangre no anticoagulada

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time