Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Schwedischen Forschungsrat (90293501, A0290401, A0290402), Siebte Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung unterstützt Nr 602.699 (DIREKT), der NovoNordisk Stiftung, der Gurli und Edward Brunnberg Stiftung, Stamm Therapie, Vleugel Stiftung und Åke Wiberg Foundation.

HINWEIS: Das Blut wurde von gesunden Individuen durch offene Systemvenenpunktion bei der Genehmigung mit der Ethical Review Board in Uppsala (Permit No. 2008/264) erstellt. 1. Seeding Cells <ol><li> Kultur primären menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) bei 37 ° C in 5% CO 2 in T75-Flaschen mit 1% Gelatine in PBS pH 7,4 beschichtet. </li><li> Entfernen Kulturmedium aus einem T75-Kolben mit HUVEC (oder eine andere Art von primären humanen Endothelzellen) und wasche die Zellen mit 2,1 mM EDTA in PBS pH 7,4. Lösen die Zellen durch Zugabe von 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA und Inkubation für 2 - 3 min in 37 ° C. </li><li> Sammeln Zellen durch Spülen des Kolbens mit 9 ml 10% FBS in PBS pH 7,4 und übertragen die Zellsuspension in ein 15 ml Röhrchen. Spin down die Zellen bei 735 xg für 5 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet vorsichtig in endothelialen Zellwachstumsmedium mikrovaskulären (EG GMMV) und zählen Sie die Zellen in einer Bürker Kammer. Seed 21.000 cEllen / cm 2 in 1-Well-Zellkultur Dias und bei 37 ° C. 2 Tage der Kultur - Die HUVEC wird nach dem 1. konfluent werden. Überwachen Sie die Zellmorphologie und Konfluenz täglich unter einem Lichtmikroskop. </li></ol> 2. Herstellung von Vollblut <ol><li> Bereiten alle künstlichen Oberflächen, die mit Blut in Kontakt mit einer Doppelschicht aus immobilisiertem Heparin (CHS) sein wird gemäß den Anweisungen des Herstellers. CHS staub- beschichtete Materialien können bei Raumtemperatur bis zu 6 Monate ohne Funktionsverlust gelagert werden. </li><li> Verwenden offenes System der Blutabnahme, um Blut aus einem gesunden Spender kurz (&lt;30 min) vor dem Start des Blut endothelialen Kammer Experiment ziehen. Paar eine Injektionsnadel (18 G x 50 mm), um CHS beschichteten Silikonschlauch (Innendurchmesser: 2 mm) vor der Blutentnahme sorgfältig in ein CHS beschichteten 50-ml-Röhrchen. Supplement Blut mit unfraktioniertem Heparin, um eine Endkonzentration von 0,75 IU / ml zu erreichen. Mischen Sie das Blut sanft INVErting das Rohr 2 - 3 mal. </li></ol> 3. Blut Endothelial Chamber Modell <ol><li> Herstellung Blutkammern (1A, Draufsicht) in Acryl Polymethylmethacrylat (PMMA), die aus zwei Zylindern (Höhe 8 mm und der Radius 9 mm), die zu einer PMMA Schieber (25 x 75 mm) aufgeklebt werden. Montieren Sie die Kanten der Zylinder nach oben mit Gummi-O-Ringe, um die Blutkammer gegen die Glasobjektträger mit kultivierten Endothelzellen (Abbildung 1B) zu versiegeln. Drehen der Blutkammer zu dem Kulturträger mit Endothelzellen danach in einer vertikalen Position (1C) verbunden ist. </li><li> Verwenden Sie ein CHS beschichtet Pipettenspitze bis 1,5 ml Blut in jeder CHS beschichtet Kammer kümmert sich nicht um das Blut zu aktivieren übertragen. </li><li> 1 ml Blut in Mikrozentrifugenröhrchen mit 30 ul 0,34 MK 3 EDTA auf eine Endkonzentration von 10 mM K 3 EDTA zur Bestimmung der anfänglichen Plasmaproteinkonzentrationen zu erreichen mitein Enzym Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Vorsichtig das Blut und die Rohre halten auf Eis. </li><li> Entfernen Sie die Kunststoffwände der Zellkulturobjektträgern gemäß den Anweisungen des Herstellers und sorgfältig waschen Sie die Zellen in PBS pH 7,4. Achten Sie darauf, anschließend entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich aus den Folien. Lassen Sie sich nicht die Zellen austrocknen. </li><li> Legen Sie die Folie auf der Oberseite der Blutkammern, mit Zellen mit Blick auf das Blut. Sichern Sie den Schlitten, indem eine Klammer um das Blut von Endothelzellen Kammer. Verwenden Sie einen Kunststoff-Rutsche für zusätzliche Unterstützung zum Bruch der Zellkultur Glasobjektträger zu vermeiden, wenn Sie den Klemme. </li><li> Befestigen Sie den Blut Endothelzellen Kammer auf einem rotierenden Rad (40 cm Durchmesser) in einem 37 ° C Wasserbad. Drehen jeder Kammer auf das Rad bei 0,5 × g für 30 min. </li><li> Nach der Inkubation zerlegen Blut Endothelzellen Kammer. Waschen Sie die Zellkulturträger in PBS pH 7,4 und fixieren die Zellen in eiskaltem 1% Paraformaldehyd (PFA) foder 10 min. 1 ml Blut aus jeder Kammer zu Mikrozentrifugenröhrchen mit 30 ul 0,34 MK 3 EDTA auf eine Endkonzentration von 10 mM K 3 EDTA zu erreichen, und die Röhrchen vorsichtig mischen. Halten Sie die Röhrchen auf Eis. </li><li> Zentrifugieren der Röhrchen bei 4.560 xg für 10 min bei 4 ° C. Übertragen Sie das Blutplasma, um neue Reaktionsgefäße und lagern in -70 ° C bis zur weiteren Analyse. </li></ol> 4. Analyse der Blut Endothelial Wechselwirkungen <ol><li> Zuführen Immunfluoreszenzfärbung mit Maus-anti-Mensch-CD16, gefolgt von sekundären Ziege-anti-Maus-Alexa 488 und Phalloidin-TexasRed. Führen Sie jede Färbung Schritt für 1 h bei Raumtemperatur und Waschen der Objektträger in PBS pH 7,4 zwischen jedem Schritt. Gegenfärbung der Zellkerne mit DAPI für 10 min bei Raumtemperatur. Analyse Blutkomponenten an die Endothelzellen durch Fluoreszenzmikroskopie in Kombination mit Bildanalyse unter Verwendung von geeigneten Bildanalysesoftware, wie CellProfiler gebunden. </li><li> Quantify die Reaktionen im Blut Fach mit Thrombin-Antithrombin (TAT) ELISA nach Herstellerangaben der Plasmaproben. </li><li> Verwenden geeigneter statistischer Instrumente, z. B., einem ungepaarten t-Test, um die Daten zu analysieren. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

<html> Mehrere Interaktionen zwischen der Blutgefäßwand und werden normalerweise in einem Ruhezustand aufgrund der Nichtklebe und antithrombotische Beschaffenheit des Endothels gehalten. 7 Bei pathologischen Zuständen, die eine Entzündung, wird das Endothel mit einer resultierenden Zunahme der Haftrezeptorexpression 8 aktiviert und eine reduzierte Fähigkeit zur Hemmung der Hämostase. 9 Aktivierung der Kaskadenanlagen im Blut wiederum verstärkt die Thrombogenität des Endothels verursacht weitere Thrombose und Leukozytenrekrutierung. 10 Um ein besseres Verständnis für diese heikle Interaktionen zwischen Endothelzellen und Vollblut zu gewinnen, haben wir entwickelten ein neuartiges Verfahren, bei dem in vitro kultivierten Endothelzellen in Kontakt mit Vollblut gegeben. Nach unserem Wissen ist unser Setup der Erste, der Endothelzellen mit menschlichem Vollblut mit keinen oder sehr wenig Antikoagulans für längere Zeiträume inkubiert zeigen. nt &quot;&gt; Die Empfindlichkeit dieses Systems wird durch Venenpunktion offenen System in Kombination mit einer Schutzschicht aus immobilisiertem Heparin auf alle mit Blut in Kontakt gebracht Oberflächen ermöglicht. Die Verwendung eines offenen Systems während der Blutbeschaffungs reduziert die Aktivierung der Kaskadensysteme während der Blutentnahme während die die Verwendung einer selbstbestimmten Menge von Antikoagulans. Kommerziell erhältliche evakuierten Blutröhrchen kann jedoch abhängig von den beabsichtigten Endpunkte der Studie verwendet werden. Die Endkonzentration von Antikoagulans zu den meisten kommerziell erhältlichen geschlossenen System Röhrchen gegeben empfindlich hemmen und ansonsten schwer in der Setup studieren Wechselwirkungen. 6 eine Schutz Heparin Oberfläche beseitigt weiterhin die Aktivierung des Blutes durch Oberflächenkontakt mit anderen als den Endothelzellen Oberflächen. 5 Tatsächlich Inkubation von Vollblut mit einer kleinen Menge an unfraktioniertem Heparin ergänzt Kammer ohne den Schutz der CHS in Folge der Gerinnselbildung. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Die Luftblase in der Kammer ermöglicht Mischen des Blutes während der Inkubation mit den Endothelzellen. Um die Wirkung des Luftblasengröße zu bewerten, haben wir zwei verschiedene Blutvolumen. In diesem Modell messen wir ähnliche TAT Ebenen unabhängig von Luftblasengröße in Kammern mit HUVEC inkubiert. TAT war, stieg jedoch mit einem kleineren Luftblasengröße in den voll CHS behandelten Kammern. Diese in Übereinstimmung mit den zuvor beschriebenen Eigenschaften der Endothelzellen 11 zeigt eine regulatorische Wirkung auf die verstärkte Aktivierung der Gerinnung durch die Endothelzellen, die in der inerten CHS Kammer fehlt vorgesehen. Die Luftblase in dem System erzeugt eine Strömung bei einer Drehung der Kammer. Die Größe der Blase ist, die Kräfte in diesem Drehsystem beeinflussen. Dies wird durch unsere Ergebnisse in 2D gezeigt waren eine kleinere Blase erzeugt höhere TAT Werten, die eine verringerte Kraft auf den Blut dh die Blutbewegunginnerhalb der Kammer geringer ist und dadurch die Aktivierung des Kaskadensystems in einem höheren Ausmaß auftritt. Es sollte erwähnt werden, dass in diesem System schaffen wir eine rotierende Strömung, die in der Geschwindigkeit verschieden sein wird über die Kammer mit der höchsten Geschwindigkeit auf den Wänden und dem niedrigsten in der Mitte. Dies ist offensichtlich nicht eine optimale Umgebung hinsichtlich Strömung und Scherbeanspruchung für die Endothelzellen, aber wir haben ein System Herstellung von stabilen und reproduzierbaren Ergebnissen. Weitere optimalen Bedingungen würde beinhalten zirkulierenden laminare Strömung in der Abwesenheit von Turbulenzen. Dies ist jedoch nicht möglich, in der hier dargestellten Modells und unseres Wissens ein solches System nicht verfügbar ist aktuell. Obwohl es mehrere mikrofluidische Systeme im Handel erhältlich, die nicht möglich ist, mit Vollblut ohne oder mit geringen Mengen von Antikoagulans zu dem System hinzugefügt werden, wodurch kombinieren können korrekten empfindliche Auswertung der Wechselwirkungen zwischen allen im Blut und Endothelzellen Komponenten ermöglichen. Weiterhin gab es eine 2-fache Zunahme bei der Einstellung von Blutzellen in Richtung TNF aktiviert HUVEC in Kombination mit einem verdoppelten Bildung von TAT unabhängig von dem Blutvolumen. Dies belegt die Stabilität des Modellsystems und zeigt auch die Möglichkeit, ein aktiviertes Endothel in Kombination mit Vollblut verwenden. Zukunft der Blutkammer Endothelzellen verwendet werden, um Blutzellrekrutierung zu aktivierten Endothelzellen durch eine Vielzahl von Markern auf Zellen unter verschiedenen Bedingungen und Stufen der Aktivierung exprimiert untersuchen. Darüber hinaus kann das Modell in Kombination mit pharmakologischen Mitteln, um Auswirkungen auf Entzündungszustände auswerten verwendet werden. Zusammenfassend zeigen wir den großen Vorteil der Kombination einer Kammermodell mit menschlichem Blut und Gefäßzellen, um eine vollständige menschliche in vitro-System die relevanten Untersuchungen von Gefäßerkrankungen durchführen zu erstellen.

Methoden zur Analyse von Blut-Kreislauf-Interaktionen bei kardiovaskulären Erkrankungen sind generell mit Tierforschung Experimente. Ergebnisse in experimentellen Tiermodellen erstellt Forschung kann jedoch nur wenig oder keine Auswirkungen auf die menschliche Erkrankung. 1,2 Als solches gibt es einen Bedarf für eine gute und zuverlässige in-vitro-Modellen, um zelluläre Wechselwirkungen zwischen dem Blutabteil und vaskuläre Endothelzellen zu untersuchen eine menschenähnliche System. Wir haben deshalb eine Blut Endothelzellen Kammer Modell etabliert. Dieser basiert auf einer zum Wechselwirkungen zwischen Biomaterialien und menschlichem Vollblut untersuchen zuvor beschriebenen Modell. 3 Im Gegensatz zu anderen In-vitro-Setups, wo in der Regel beschränkte Anzahl gereinigten Komponenten, dh, Thrombozyten, Leukozyten oder Endothelzellen zur Verfügung stehen, enthält das vorliegende Modell alle die Komponenten präsentieren in einem Blutgefäß. Der Aufbau der Blut endothelial cell Kammer-Modell ist auf die Verwendung von frisch entnommenen menschlichen Blutes mit wenig oder ohne Zusatz von Antikoagulans zu ermöglichen. Blut während längere Zeiträume gespeichert erwerben sogenannten Lagerläsionen, wo Abbau von Erythrozyten kann mit empfindlichen Wechselwirkungen zwischen Blut und Endothelzellen stören. 4 Gerinnselbildung während der Handhabung von Vollblut ex vivo zu vermeiden erfordert entweder hohe Dosen von Antikoagulans oder das gesamte Material in Kontakt mit Blut nicht-aktivierende sein. Als nicht-aktivierenden Oberflächen sind selten in der Laborumgebung können Materialien wahlweise mit einer Schutzschicht aus immobilisiertem Heparin ausgestattet werden. Eine Schutzschicht aus immobilisiertem Heparin, die meisten Materialien schaffen eine Oberfläche, wo Blutkontakt kann ohne eine Aktivierung der Gerinnungskaskade auftreten, angewendet werden kann (nachstehend als Corline Heparin Fläche (CHS) bezeichnet). 5 Somit kann durch Ausstattung der Kammern mit CHS, das Blut endothelialen cell Kammer Modell ermöglicht die Verwendung von sehr geringen Konzentrationen von Antikoagulans im Blut. Vermeidung der Zugabe von hohen Konzentrationen von Antikoagulans im Blut endothelial Kammer Modell ermöglicht es, empfindliche Wechselwirkungen innerhalb eines Blutgefäßes, die andernfalls verdeckt sein könnten, zu prüfen. 6 Das Blut Endothelzellen Kammer Modell besteht aus zwei Kammern, die durch Anbringen Kunststoffzylinder ausgebildet (Höhe: 8 mm; Radius: 9 mm) zu einem Kunststoffobjektträger. Die Kanten nach oben auf den Zylinder mit Nuten, die mit Gummi-O-Ringe zur Abdichtung der Kammern gegenüber dem Zellkulturträger ausgestattet sind, verwendet, ausgestattet. Die Kammern nur teilweise mit Blut gefüllt, wenn die Luft in die Kammer gelassen hält Blut in Bewegung, wenn die Kammern werden anschließend in eine vertikale Position (Figur 1) gedreht wird. Um die Funktionalität des Modells zu bewerten, führten wir Experimente mit entweder einer vollständig beschichteten CHSKammer oder menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC). Zwei getrennte Blutvolumina wurden untersucht und die Bildung von Thrombin, Antithrombin (TAT) -Komplexe (ein indirekter Marker der Koagulation) wurde mit Enzym-gebundenen Immunosorbent-Assay (ELISA) gemessen. Wir haben dann beurteilt die Wirkung von Blutvolumina und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) stimuliert Endothelzellen auf Leukozytenrekrutierung durch Bildanalyse. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Aufbau des Blut Endothelzellen Kammer-Modell. (A) Draufsicht schematische Zeichnung der Blutkammer in PMMA. (B) Primäre humane Endothelzellen auf 1-well Kammer-Objektträgern kultiviert werden. Frisches menschliches Blut wird einem zwei Kammern auf einem Objektträger zugegeben. Die Kammern und zur Handhabung des Blutes verwendet alles Material mit einer Schutzbeschichtung HS behandelt. Nach dem Entfernen der Wände des cell Kulturträger, die Zellen gegenüber dem Blut angeordnet und das System gespannt wird geschlossen. (C) Das Blut endothelialen Zellkammern werden dann unter Drehung in 37 ° C inkubiert. Danach können die Reaktionen in der Blutkammer durch ELISA analysiert und die Endothelzellen kann durch Mikroskopie analysiert.

<table><tbody><tr><td>Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td><td>PromoCell</td><td>C-12200</td><td>Any other type of primary human endothelial cell may be used.</td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td><td>PromoCell</td><td>C-22120</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-2500</td><td>Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.</td></tr><tr><td>TAT ELISA</td><td>Enzyme Research Lab.</td><td>TAT-EIA-C</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD16</td><td>DAKO</td><td>F7011</td><td>Dilution 1:100</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11001</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Phalloidin-Texas Red</td><td>Molecular Probes</td><td>A22287</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>Dilution 10 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-6758</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco Life Tecnologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>1 well cell culture slides</td><td>BD Falcon</td><td>354101</td><td></td></tr><tr><td>Blood Chambers</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS</td></tr><tr><td>Clamps</td><td>Office Depot</td><td>2052204</td><td></td></tr><tr><td>Corline Heparin Surface (CHS)</td><td>Corline Systems AB</td><td>945-00</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic needle</td><td>Terumo</td><td>NN-1850R</td><td>Size: 18 G x 5 mm</td></tr><tr><td>Unfractionated Heparin (UFH)</td><td>Leo Pharma</td><td>585679</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>1709958</td><td>Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Broad Institute</td><td>CellProfiler</td><td>Available for free at www.cellprofiler.org</td></tr></tbody></table>

a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium

Die Mehrzahl aller bekannten Krankheiten, die durch Störungen des kardiovaskulären Systems begleitet. Studien über die Komplexität der Interaktion Wege während kardiovaskulärer Pathologien aktiviert werden, jedoch durch das Fehlen von robusten und physiologisch relevante Verfahren beschränkt. Um pathologischen vaskulären Ereignissen modelliert haben wir ein in-vitro-Assay zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Endothel und Vollblut entwickelt. Der Assay besteht aus primären humanen Endothelzellen, die in Kontakt mit dem menschlichen Gesamtblut gegeben werden. Das Verfahren nutzt Nativblut mit keiner oder sehr wenig Antikoagulans, sodass Studie von empfindlichen Wechselwirkungen zwischen in einem Blutgefäß vorliegenden molekularen und zellulären Komponenten. Wir untersuchten die Funktionalität des Tests durch Vergleichen der Gerinnungsaktivierung durch verschiedene Blutvolumen mit oder ohne menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC) inkubiert. Während ein größeres Blutvolumen trugen zueine Zunahme der Bildung von Thrombin Antithrombin (TAT) -Komplexe, der Anwesenheit von HUVEC zu einem Abfall der Aktivierung der Gerinnung. Ferner verwendeten wir die Bildanalyse von Leukozyten-Bindung an HUVEC stimuliert mit Tumornekrosefaktor (TNF) und fanden das Vorhandensein von CD16 + Zellen signifikant höher auf TNF-stimulierten Zellen im Vergleich zu nicht stimulierten Zellen nach dem Kontakt mit Blut sein. Abschließend kann der Assay verwendet werden, um vaskuläre Pathologien, wobei Wechselwirkungen zwischen dem Endothel und der Blutkammer gestört werden studieren.

Die Notwendigkeit der CHS Coating Um Reaktionen in Vollblut spezifisch für die von den Endothelzellen hervorgerufen zu messen, müssen alle für das Blut Endothelzellen Kammer verwendeten Materialien mit einer CHS Schlichte vor Gebrauch eingerichtet werden. 2A (links) zeigt eine unbeschichtete Kammer nach 30 min Blutkontakt mit einem deutlich sichtbaren vorliegenden gerinnen. Behandeln der Kammer mit CHS (2A, rechts) auf der anderen Seite schützt das Blut aus unkontrollierte Aktivierung, so dass die Ergebnisse aufgrund der Endothelzellen Blut Wechselwirkungen. Die Wirkung des Blutvolumen in der Kammer Aktivierung der Koagulation ist als die Wahrscheinlichkeit der Wechselwirkung zwischen aktivierten Gerinnungsfaktoren erhöht wird wahrscheinlicher in stagnierenden Blut. Im Blut von Endothelzellen Kammer-Modell, wird das Blut in Bewegung aufgrund der Zirkulation einer Luftblase im Inneren der Kammer gehalten. In order, um die Wirkung von Änderungen des Blutvolumens Luftblasengröße zu bestimmen, und damit auch wurde eine CHS beschichtet Kammer zu einer CHS beschichteten Glasobjektträger, die mit 1,5 ml oder 1,75 ml Vollblut für 30 min getestet wurde, verbunden ist. Das Blutvolumen ohne Bewegung der Luftblase ist 2,5 Mal größer als 1,75 ml Blut in die Kammer aufgenommen Vergleich dazu, wenn 1,5 ml Blut verwendet wird (2B). Die gemessenen TAT-Werte vorgeschlagen TAT-Bildung mit einem erhöhten Blutvolumens (2D) erhöht. Wenn HUVEC (2C) wurden entweder mit 1,5 oder 1,75 ml Vollblut inkubiert wurde kein Unterschied zwischen den beiden Gruppen festgestellt, was darauf hindeutet, dass endotheliale Zellen die Aktivierung der Koagulation (2D) zu modulieren. Die Wirkung von TNF auf Blood Cell Rekrutierung und Aktivierung von Gerin Um die Wirkung von TNF auf die Rekrutierung von Leukozyten zu untersuchen, wurden HUVEC treated mit 20 ng / ml TNF &amp; agr; 4 Stunden vor der Blutkontakt. Blutkontakt - entweder mit 1,5 ml oder 1,75 ml Blut - wurde für 30 min, wonach die Kulturträger wurden für CD16 (2F) gefärbt fort, abgebildet und die Zahl der CD16 + Zellen quantifiziert wurde. Die Rekrutierung von CD16 + Zellen signifikant erhöht mit TNF-Behandlung (2E) 100-256 CD16 + Zellen / mm 2 (p &lt;0,0001) mit 1,5 ml Blut und 172 bis 378 (P &lt;0,0001) mit 1,75 ml Blut. Die Bildung von TAT-Komplexe wurden in den entsprechenden Plasmaproben Blut entweder mit TNF behandelten oder unbehandelten Zellen (Figur 2G) inkubiert gemessen. TNF-stimulierten Zellen induzierte eine ungefähre Verdoppelung der TAT-Komplexe im Vergleich zu unbehandelten Zellen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" /> Feigeure 2: Funktionalität des Blutes Endothelzellen Kammer-Modell. (A) Chambers mit oder ohne CHS wurden mit Vollblut inkubiert. Ohne CHS wurde ein Gerinnsel nach 30 min gebildet. Messung der Thrombin-Antithrombin (TAT) -Komplexe, indirekter Marker der Gerinnung in Vollblut ohne CHS inkubiert war&gt; 6000 pg / ml. (B) Das Blutvolumen nicht in Bewegung gehalten durch den rotierenden Luftblase mit unterschiedlichen Blutvolumina variieren. Mit der Zugabe von 1,5 ml des Blutes wird dieses Volumen 0,3 ml sein, während es auf 0,74 ml unter Zusatz von 1,75 ml zu erhöhen. (C) abgebildeten HUVEC mit Phasenkontrastmikroskopie zeigen typische endotheliale Zellmorphologie einer konfluenten Monoschicht vor Blutkontakt. (D) TAT-Werte für vollständig CHS beschichteten Kammern zeigen eine geringe Differenz, wenn verschiedene Blutvolumina werden hinzugefügt. Die Zugabe von 1,5 ml Blut in Folge 35 ± 11 pg / ml (n = 7) im Vergleich zu 1,75 ml, das in 85 resultierte77; 70 &amp; mgr; g / ml TAT (n = 8). Dieser Unterschied ist nicht mehr vorhanden, wenn HUVEC mit den gleichen Blutmengen inkubiert; 66 ± 55 ug / ml 1,5 ml (n = 5) und 66 ± 29 pg / ml 1,75 ml (n = 7). (E) Quantifizierung der Zahl der CD16 + Zellen auf entweder unstimuliert oder stimuliert TNF &amp; agr vorliegenden HUVECs nach Blutkontakt. Die Zahl der CD16 + Zellen signifikant erhöht mit TNF stimulierten Zellen, die entweder mit 1,5 ml (basal: 100 ± 40 Zellen / mm; TNFa: 256 ± 121 Zellen / mm) inkubiert und 1,75 ml (basal: 172 ± 67 Zellen / mm; TNF: 378 ± 185 Zellen / mm) von Vollblut (F) Repräsentative Bilder der unstimulierten und TNF-stimulierte HUVEC für Phalloidin (rot gefärbt), CD16 (grün) und DAPI (blau).. Maßstabsbalken = 250 &amp; mgr; m (g) die Bildung von TAT-Komplexe wird grob durch TNF stimulierten Zellen verdoppelt im Vergleich zu unbehandelten Zellen mit Blut (1,5 ml inkubiert. 2.1 ± 0,1 mal mehr TAT, n = 3; 1,75 ml: 1,7 ± 1,0 mal mehr TAT, n = 4). Alle Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt; p-Werte wurden durch ungepaarte t-Tests berechnet. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell für die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen humanem Vollblut und Endothel

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

a-novel-vitro-model-for-studying-interactions-between-human-whole

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

9.3K Aufrufe.  Uppsala University. The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

Serie: A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Forschung

Biotechnik

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

In-vitro-Modell von physiologischen und pathologischen Blutfluss mit Anwendung auf Untersuchungen der Gefäßzell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

Ein In-Vitro-3D-Modell und eine Computational Pipeline zur Quantifizierung des vaskulogenen Potenzials von iPSC-derived endotheliaalen Vorläufern

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Entwicklungsbiologie

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Immunologie und Infektion

Differenzierung und mechanische Stimulation von hiPSC-abgeleiteten Endothelzellen

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung von hiPSC-abgeleiteten Endothelzellen, die unter fluidisch vermittelter mechanischer Stimulation kultiviert wurden 

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

In vitro On-Chip-Modell eines fötalen menschlichen Gefäßes zur Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

In vitro 3D-zellkulierte arterielle Modelle zur Untersuchung des vaskulären Wirkstoff-Targetings unter Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood coagulation. This phenomenon is observed in many clinical situations, like organ transplantation in the presence of pre-formed anti-donor antibodies, including xenotransplantation, as well as in ischemia/reperfusion injury. In order to reduce animal experimentation according to the 3R standards (reduction, replacement and refinement), in vitro models to study the effect of endothelial cell activation on blood coagulation would be highly desirable. However, common flatbed systems of endothelial cell culture provide a surface-to-volume ratio of 1 - 5 cm2 of endothelium per mL of blood, which is not sufficient for natural, endothelial-mediated anticoagulation. Culturing endothelial cells on microcarrier beads may increase the surface-to-volume ratio to 40 - 160 cm2/mL. This increased ratio is sufficient to ensure the &#34;natural&#34; anticoagulation of whole blood, so that the use of anticoagulants can be avoided. Here an in vitro microcarrier-based system is described to study the effects of genetic modification of porcine endothelial cells on coagulation of whole, non-anticoagulated human blood. In the described assay, primary porcine aortic endothelial cells, either wild type (WT) or transgenic for human CD46 and thrombomodulin, were grown on microcarrier beads and then exposed to freshly drawn non-anticoagulated human blood. This model allows for the measurement and quantification of cytokine release as well as activation markers of complement and coagulation in the blood plasma. In addition, imaging of activated endothelial cell and deposition of immunoglobulins, complement- and coagulation proteins on the endothelialized beads were performed by confocal microscopy. This assay can also be used to test drugs which are supposed to prevent endothelial cell activation and, thus, coagulation. On top of its potential to reduce the number of animals used for such investigations, the described assay is easy to perform and consistently reproducible.

We present an in vitro model which allows the study and analysis of coagulation in whole, non-anticoagulated blood. Anticoagulation in the system depends on the natural anticoagulation effect of healthy endothelial cells and endothelial cell activation will result in clotting.

Bewertung der gerinnungshemmenden und entzündungshemmenden Eigenschaften von Endothelzellen mit 3D Zellkultur und nicht-Antikoagulanzien Vollblut

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Medizin

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

In Vitro Mikrofluidic Disease Model zur Untersuchung von Blut-Endothel-Wechselwirkungen und Blutgerinnsungsdynamik in Echtzeit

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

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Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten

In-vitro-Modell von physiologischen und pathologischen Blutfluss mit Anwendung auf Untersuchungen der Gefäßzell Remodeling

Ein In-Vitro-3D-Modell und eine Computational Pipeline zur Quantifizierung des vaskulogenen Potenzials von iPSC-derived endotheliaalen Vorläufern

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

In vitro On-Chip-Modell eines fötalen menschlichen Gefäßes zur Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie

In vitro On-Chip-Modell eines fötalen menschlichen Gefäßes zur Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie

In vitro On-Chip-Modell eines fötalen menschlichen Gefäßes zur Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie

In vitro 3D-zellkulierte arterielle Modelle zur Untersuchung des vaskulären Wirkstoff-Targetings unter Flow

Bewertung der gerinnungshemmenden und entzündungshemmenden Eigenschaften von Endothelzellen mit 3D Zellkultur und nicht-Antikoagulanzien Vollblut

In Vitro Mikrofluidic Disease Model zur Untersuchung von Blut-Endothel-Wechselwirkungen und Blutgerinnsungsdynamik in Echtzeit