Name: construction of an affordable and easy-to-build zebrafish facility
Uploaded: 2014-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
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Os autores gostariam de agradecer ao Instituto de Investigação de Presbyterian College School of Pharmacy para apoio financeiro deste projecto através dos Prêmios pequena farmácia de Investigação &amp; Collaboration (SPARC) Award. Os autores agradecem ao Sr. John Smink, Gerente do Laboratório de Pesquisa de Animais Aquáticos da Universidade Clemson, Clemson, SC por sua técnica de revisão assistência manuscrito.

NOTA: Estes protocolos seguir as orientações do IACUC de Presbyterian College. 1. Materiais Adquirir listadas na Tabela 1. 2. Monte a 5 Shelf Chrome De acordo com as instruções do fabricante. Este será utilizado para abrigar o mecanismo. 3. Construa o reservatório de água e sistema de filtração (Figuras 1 e 2). <ol><li> Usando a Figura 1A como um guia, o layout do balde de 18 litros, bomba, filtros e lâmpada UV para determinar a localização da instalação final e tamanho. </li><li> Uma vez que as peças são colocadas para fora, medir e cortar o tubo de PVC ¾ &quot;para o comprimento necessário para a montagem. Variar os comprimentos de todas as tubulações de acordo com as necessidades e limitações de espaço específicos. </li><li> Montar os tubos e acessórios, como previsto anteriormente usando o primer PVC e cimento, veja abaixo (3.3.2 e 3.3.3). <ol><li> Lixe as bordas do corte do tubo com uma lixa até que eles são suaves ao toque de umd não há restos. </li><li> Primeiro o lado de fora do tubo e o interior do acessório com o iniciador de PVC comprado com o cotonete incluídos a partir do iniciador de PVC. </li><li> Cimento e o tubo de montagem em conjunto aplicando o cimento de PVC para o exterior do tubo usando o cotonete incluídos. Repita o procedimento para todas as etapas que precisam cimentação PVC. </li><li> Coloque o balde 18 litros de um dos lados da construção de prateleira. </li><li> Instalar um conector de anteparo do lado do reservatório. </li><li> Anexar um tubo de PVC de ¾ &quot;da antepara. </li><li> Conecte a outra extremidade do ¾ &quot;tubo para a entrada da bomba usando um ¾&quot; com rosca fazer um encaixe. </li><li> Conecte-se os filtros para a bomba usando dois cotovelos de 90 graus e ¾ &quot;tubo de PVC. <ol><li> Use um filtro de papel seguido por um filtro de carvão ativado para filtrar os detritos e reduzir os níveis de cloro e produtos químicos na água. </li></ol></li><li> Ligue a lâmpada UV ao accordi filtrosng a instruções do fabricante. </li></ol></li><li> Ligar a bomba e um sistema de filtro para o lado de cima da primeira prateleira do bastidor utilizando laços de arame. Varie a ordem da montagem e fixação de acordo com o tamanho e layout da prateleira / cremalheira escolhido. </li><li> Adicionar 1 BioBall por galão de água para o reservatório de água quando a bomba e do sistema de filtro são montados e ligados à prateleira. </li></ol> 4. Construa a principal linha de alimentação (Figuras 1B e 2). <ol><li> Meça e corte um pedaço de ¾ &quot;tubo de PVC para ligar a lâmpada UV para a alimentação principal </li><li> Use um &quot;tee PVC para iniciar a linha de alimentação principal, ligando o tee ao ¾&quot; ¾ de escape PVC vindo do filtro UV. . <ol><li> Adicionar uma válvula on-off para o fundo do T do PVC para servir como um dreno para a lavagem de manutenção do sistema. </li><li> Comece a principal linha de abastecimento a partir do topo do ¾ &quot;tee PVC, medindo e corte ¾&quot; PVCtubo com o comprimento desejado para proporcionar tubos de alimentação para cada uma das prateleiras na cremalheira. </li><li> Instale ¾ &quot;tees de PVC para as linhas horizontais que entrarão cada prateleira do rack. </li><li> Opcionalmente (e sugeriu), adicionar uma ¾ &quot;on-off válvula para cada linha de fornecimento de prateleira para permitir o isolamento de cada prateleira e um design modular do sistema. </li></ol></li><li> Use um tubo de PVC de ¾ &quot;como uma redução da pressão de linha na prateleira de cima. Se esta linha passa sobre a parte de trás da prateleira, prateleira para usar este armazenamento. Terminar a redução de pressão de linha na linha de escape principal (Figura 1B) com um ¾ &quot;válvula de ligar-desligar. </li><li> Uma vez que os passos acima foram concluídos, prime e cimentar o tubo de PVC em conjunto, como feito anteriormente, quando a construção do sistema de reservatório e filtração. </li></ol> 5. Construa a principal linha de escape (Figuras 1C e 2). <ol><li> Executar o comprimento vertical da linha de escape principal para o outro lado da cremalheira from da linha de alimentação principal. Use um tubo de 2 &quot;PVC para esta linha vertical para receber a linha de alimentação principal para as linhas de topo e de drenagem dos tanques de peixes de cada prateleira. </li><li> Corte os pedaços de 2 &quot;tubo de PVC para a linha de escape principal vertical e usar 2&quot; tees PVC para receber as linhas de drenagem do tanque de peixes de cada prateleira. Termine a linha de escape principal no tanque de estoque para expelir a água reciclada por um filtro de esponja. </li><li> Corte uma abertura de uma polegada de todo o comprimento dos dois &quot;pedaços de tubos de PVC e anexar a linha de escape principal vertical com PVC t-shirt para as linhas horizontais de drenagem dos tanques de peixe. </li><li> Tampe as duas &quot;linhas de drenagem horizontais com um 2&quot; cap PVC. </li><li> Prime e cimentar as peças usando os acessórios necessários (conectores, mamilos ou cotovelos). </li></ol> 6. Construir os tanques de peixes (Figura 3). <ol><li> Com a perfuração, corte um &quot;furo na parte de trás do tanque de peixes 1&quot; 1 1/8 abaixo da borda superior com uma serra craniana. </li><li&gt; Deslize um ¾ &quot;PVC adaptador macho roscada (com um O-ring # 18 em anexo) através do orifício (a partir do interior do tanque para o exterior). </li><li> Encaixe e aperte a 90 graus 3/4 &quot;rosca cotovelo PVC ao adaptador macho para criar o tubo de escape do tanque de peixes. Adicionar um pedaço de malha fina antes de aparafusar a porca de fixação para evitar peixe-zebra passar pelo sistema de escape. </li><li> Coloque o tanque de peixes com seu final do tubo de escape para o espaço aberto da linha de drenagem atrás dos tanques </li></ol> 7. A partir do sistema de água <ol><li> Em vários recipientes, tais como a utilizada para o reservatório, medida três vezes a quantidade de água contida no interior do sistema. Deixe que esta água repousar à temperatura ambiente para o condicionamento durante 48 horas. </li><li> Adicionar água para o sistema e deixá-lo circular durante um período mínimo de 3 dias. <ol><li> Mudar a água no sistema vigorosamente durante os primeiros 3 dias de circulação, a fim de libertar o sistema de contaminantes that residem dentro dos tubos. </li></ol></li><li> Adicionar zebrafish arranque e permitir que o ciclo de nitrogênio para se estabelecer. Normalizar o pH para um consistente 7. Mantenha sete peixe-zebra por 1,8 L, e alimentá-los duas vezes por dia durante a semana e uma vez por dia durante a semana, como sugerido por Linbo 4 e 6 McNabb. </li><li> Monitorar o nitrato de (&lt;75 mg / L), nitrito (&lt;10 mg / L), e de amónio (0 mg / L) por dia durante a primeira semana após a adição de peixe, e duas vezes por semana, uma vez os níveis desejados foram mantidas com as mudanças de água regulares . </li></ol>

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	<li>Detrich, H., Westerfield, M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A.. , (2010).</li><li>Grim, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemogen+(hemgn),+a+transcription+factor+that+regulates+erythropoiesis+and+skeletogenesis+in+zebrafish.">Hemogen (hemgn), a transcription factor that regulates erythropoiesis and skeletogenesis in zebrafish.</a> , (2013).</li><li>Kim, S., Carlson, R., Zafreen, L., Rajpurohit, S. K., Jagadeeswaran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular,+easy-to-assemble,+low-cost+facility.">Modular, easy-to-assemble, low-cost facility.</a> Zebrafish. 6 (3), 269-274 (2009).</li><li>Linbo, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+(Danio+rerio)+husbandry+and+colony+maintenance+at+the+Northwest+Fisheries+Science+Center.">Zebrafish (Danio rerio) husbandry and colony maintenance at the Northwest Fisheries Science Center.</a> U.S. Dept. Commer., NOAA Tech. Memo. 62, (2009).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. 69, 4196 (2012).</li><li>McNabb, A., Scott, K., Ochsenstein, E., Seufert, K., Carl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Don't+be+afraid+to+set+up+your+fish+facility.">Don't be afraid to set up your fish facility.</a> Zebrafish. 9 (3), 120-125 (2012).</li><li>Garcia, R. L., Sanders, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+cleaning+and+disinfection+procedures+in+a+zebrafish+rerio)+facility.">Efficacy of cleaning and disinfection procedures in a zebrafish rerio) facility.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (6), 895-900 (2011).</li><li>Rivas-Boyero, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+a+nociceptin+receptor+from+zebrafish+(Danio+rerio).">Pharmacological characterization of a nociceptin receptor from zebrafish (Danio rerio).</a> J Mol Endocrinol. 46 (2), 111-123 (2011).</li><li>Sanchez-Simon, F. M., Zhang, X. X., Loh, H. H., Law, P. Y., Rodriguez, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphine+regulates+dopaminergic+neuron+differentiation+via+miR-133b.">Morphine regulates dopaminergic neuron differentiation via miR-133b.</a> Mol Pharmacol. 78 (5), 935-942 (2010).</li><li>Velasco, E. M., Law, P. Y., Rodr&#237;guez, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mu+opioid+from+the+zebrafish+exhibits+functional+characteristics+as+those+of+mammalian+mu+opioid+receptor.">Mu opioid from the zebrafish exhibits functional characteristics as those of mammalian mu opioid receptor.</a> Zebrafish. 6 (3), 259-268 (2009).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse para este papel.

O principal objetivo deste artigo é demonstrar que a construção de uma instalação de peixe-zebra funcional não é complicado e pode ser construído por pesquisadores de peixes novatos com conhecimento mínimo de construção. Além disso, este artigo mostra que os materiais para esta facilidade zebrafish funcional pode ser adquirido facilmente e acessível a partir de lojas de pet locais ou lojas de ferragens. Uma vez que todos os materiais e ferramentas foram adquiridos a construção do sistema e os tanques de p...

In vivo modelos são essenciais para a realização de pesquisa biomédica abrangente uma vez que permitem pesquisas in vitro a ser traduzido no nível do sistema e dos organismos. Por exemplo, a investigação com pequenos mamíferos, roedores, ou seja, tem sido necessário o desenvolvimento de fármacos e na melhoria das drogas disponíveis. No entanto, a complexidade (financeiramente e logisticamente) pode fazer com que seja praticamente impossível construir e manter instalações de roedores para a experimentação propõe a pequenas instituições acadêmicas de pesquisa. No entanto, a pesquisa in vivo pode ser realizada utilizando outras espécies de animais que necessitem de logística menos elaborados. Peixe-zebra (Danio rerio) têm sido utilizados com sucesso como um modelo in vivo para o estudo da genética, desenvolvimento, fisiopatologia e farmacologia 1,2,10,11,12. As instalações necessárias para abrigar peixes-zebra para a experimentação são relativamente simples e significativamente menos caro quando comparado a rinstalações Odent. Kim et al. 3 descreveram recentemente em detalhe um tanque de 80 peixes-zebra sistema de habitação que pode ser construído por cerca de US $ 1.500, que inclui ambas as partes e os custos trabalhistas. Isto está em contraste com a quase 8500 dólares que seriam necessários para comprar um sistema de ready-made, 80 tanque de qualquer número de fornecedores comerciais. No entanto, a descrição dada por Kim et al. pode ser complicado e difícil de seguir para os novatos da investigação peixe. Acreditamos que uma instalação de peixe-zebra podem ser construídos de forma simplificada para um investimento de US $ 1.500. A criação de uma facilidade in vivo em pequenas instituições acadêmicas fornece suas faculdades mais uma ferramenta com a qual a produzir pesquisa mais poderoso e completo. Os estudos in vitro apoiados por resultados in vivo geralmente produzem investigação biomédica mais abrangente do que os dados obtidos utilizando apenas nas abordagens in vitro. Portanto, oimplementação de um centro de pesquisa in vivo irá melhorar significativamente o sucesso instituição em seus esforços globais de pesquisa (exposição do estudante com a investigação, publicações, comunicações, a busca de financiamento externo, etc.). A construção de uma unidade de peixe-zebra como o descrito neste estudo é ideal para instituições de pesquisa acadêmicas com recursos limitados (ou instituições sem in vivo centros de pesquisa) durante constrição Financial Times.

<table><tbody><tr><td>Item</td><td>Brand</td><td>Quantity</td><td></td></tr><tr><td>74-in H x 48-in W x 18-in D 5-shelf Steel Freestanding Shelving Unit</td><td>Style Selections</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>18-Gallon General Bucket/Tote</td><td>Centrex Plastics: LLC&amp;nbsp;Rugged Tote</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>6-Outlet Power Strip With 15-Ft. Cord</td><td>Master Electrician</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>9-Watt UV Water Garden Clarifier FiIter and UV lamp</td><td>Smartpond&amp;nbsp;</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>Whole House Water Replacement Filter</td><td>Whirlpool</td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>Opaque Whole-House Pre-Filtration Housing</td><td>Whirlpool</td><td>2</td><td></td></tr><tr><td>Thread Seal Tape</td><td>William H Harvey</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>8-fl oz LO-VOC PVC Cement</td><td>Oatey&amp;nbsp;</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>8-fl oz LO-VOC Primer</td><td>Oatey&amp;nbsp;</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>1/4-in x 100-ft Vinyl Drip Irrigation Distribution Tubing</td><td>Mister Landscaper&amp;nbsp;</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>1/4-in Barbed Drip Irrigation On/Off Valve</td><td>Mister Landscaper</td><td>33</td><td></td></tr><tr><td>9-Port NPT Irrigation Manifold with Filter</td><td>&amp;nbsp;Mister Landscaper</td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>Drop-In Filter with House&amp;nbsp;</td><td>Whirlpool</td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>2-in Dia 90-Degree PVC Elbow</td><td>LASCO</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>2-in Dia 90-Degree Tee</td><td>LASCO</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>3/4-in Dia 90-Degree Slip Elbow</td><td>LASCO</td><td>15</td><td></td></tr><tr><td>3/4-in Dia PVC Adapter</td><td>LASCO</td><td>7</td><td></td></tr><tr><td>3/4-in Dia PVC Tee</td><td>LASCO</td><td>12</td><td></td></tr><tr><td>2-in Dia PVC Cap</td><td>LASCO</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>1-in Dia x 3/4-in Dia PVC Adapter</td><td>LASCO</td><td>2</td><td></td></tr><tr><td>3/4-in PVC Socket In-Line Ball Valve</td><td>American Valve</td><td>5</td><td></td></tr><tr><td>1/2-in Dia x 3/4-in Dia PVC Adapter</td><td>Lasco</td><td>8</td><td></td></tr><tr><td>3/4-in Dia PVC Cap</td><td>Lasco</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>2-In x 5-Ft Pvc Pipe</td><td>Charlotte Pipe</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>&amp;frac34;-In x 10-Ft Pvc pipe</td><td>Charlotte Pipe</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>11/16x1-7/80 PVC ring</td><td>SXT</td><td>10</td><td></td></tr><tr><td>&amp;frac12;&amp;rdquo; PVC male adapter</td><td>SXT</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;frac34;&amp;rdquo; PVC coupling&amp;nbsp;</td><td>SXT</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;frac12;&amp;rdquo; PVC female adapter&amp;nbsp;</td><td>SXT</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>link</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.8 L Dual Beta Keeper</td><td>Top Fin</td><td>27</td><td></td></tr><tr><td>&amp;frac34;&amp;rdquo; PVC male adapter (w/ #18 O-ring)</td><td>SXT</td><td>28</td><td></td></tr><tr><td>90-degree &amp;frac34;&amp;rdquo; threaded PVC elbow</td><td>SXT</td><td>27</td><td></td></tr><tr><td>Fine Mesh</td><td>N/A</td><td>1 yard</td><td></td></tr><tr><td>Bulkhead Connector</td><td>N/A</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>Hacksaw</td><td>N/A</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>N/A</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>Hole saw</td><td>N/A</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable Wrench</td><td>N/A</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>Pliers&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>Tape Measure</td><td>N/A</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>Safety Glasses</td><td>N/A</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>Work Gloves</td><td>N/A</td><td>1</td><td></td></tr></tbody></table>

construction of an affordable and easy-to-build zebrafish facility

In vivo a pesquisa biomédica é essencial para traduzir em resultados in vitro em avanços clínicos. Pequenas instituições acadêmicas com recursos limitados encontrá-lo virtualmente impossível construir e manter instalações típicas de roedores para a investigação. Zebrafish pesquisa tem demonstrado ser uma alternativa valiosa para a pesquisa in vivo em farmacologia, fisiologia, desenvolvimento e estudos genéticos. Este artigo demonstra que uma instalação de peixe-zebra funcional pode ser construído de uma forma fácil e acessível. Nós demonstramos que esse mecanismo poderia ser construído em cerca de um dia de trabalho com ferramentas e conhecimentos mínimos. O custo dos 27 1.8 L tanque de peixes facilidade zebrafish construído neste estudo foi de aproximadamente US $ 1.500. Estima-se que a manutenção de um trabalho inicial de 150 peixes colônia por 3 meses é de R $ 1.000. Este projecto envolveu alunos, que foram introduzidas para aquaculturing de peixe-zebra para pesquisa propõe.

Construção do sistema de bomba e Flters Uma vez que o rack é montado e criou o primeiro passo é construir o sistema de bomba e filtro. Os filtros são ligados ao sistema de bomba e está localizado acima do nível inferior da primeira prateleira, que permite uma fácil manutenção e de substituição do filtro. Do mesmo modo, a lâmpada UV é conectado com o tubo de PVC de filtro e mantida no lugar com os plásticos de laços de fio para permitir a fácil substituição de uma lâmpada de UV, confor...

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Construction of an Affordable and Easy-to-Build Zebrafish Facility

A Zebrafish facility suitable for breeding and in vivo research is built in an easy and affordable manner. Maintenance is minimal. This facility is ideal for student involvement and independent research.

Construção de uma compilação de fácil Facility Zebrafish Acessível e

In vivo biomedical research is pivotal to translate in vitro findings into clinical advances. Small academic institutions with limited resources find it ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K visualizações.  Presbyterian College School of Pharmacy. A Zebrafish facility suitable for breeding and in vivo research is built in an easy and affordable manner. Maintenance is minimal. This facility is ideal for student involvement and independent research.

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A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related research fields. Thanks to its unique features, including large fecundity, embryo translucency, rapid and simultaneous development, etc., zebrafish embryos are often used for large scale toxicity assessment of chemicals and drug/compound screening. A typical screening procedure involves adult zebrafish spawning, embryos selection, and arraying the embryos into multi-well plates. From there, embryos are subjected to exposure and the toxicity of chemical, or the effectiveness of the drugs/compounds can be evaluated relatively quickly based on phenotypic observations. Among these processes, embryos arraying is one of the most time-consuming and labor-intensive steps that limits the throughput level. In this protocol, we present an innovative approach that makes use of a 3D-printed arraying template coupled with vacuum manipulation to speed up this laborious step. The protocol herein describes the overall design of the arraying template, a detailed experimental setup and step-by-step procedure, followed by representative results. When implemented, this approach should prove beneficial in a variety of research applications using zebrafish embryos as testing subjects.

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Here, we present a protocol to design and fabricate a zebrafish embryo arraying template, followed by a detailed procedure on the use of such template for high throughput zebrafish embryo arraying into a 96-well plate.

Um 3-dimensional (3D)-impresso modelo alto Throughput Zebrafish embrião põr

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Ambiente

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Microstructured dispositivos para Microinjection otimizado e imagem latente de larvas de Zebrafish

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Biologia do Desenvolvimento

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Automatizados análises comportamentais de alto rendimento em larvas do peixe

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Neurociência

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to prenatal ethanol exposure. Due to the complex pathology of FASD, animal models have proven critical to our current understanding of ethanol-induced developmental defects. Zebrafish have proven to be a powerful model to examine ethanol-induced developmental defects due to the high degree of conservation of both genetics and development between zebrafish and humans. As a model system, zebrafish possess many attributes that make them ideal for developmental studies, including large numbers of externally fertilized embryos that are genetically tractable and translucent. This allows researchers to precisely control the timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts. One important genetic tool available in zebrafish is transgenesis. However, generating transgenic constructs and establishing transgenic lines can be complex and difficult. To address this issue, zebrafish researchers have established the transposon-based Tol2 transgenesis system. This modular system uses a multisite Gateway cloning approach for the quick assembly of complete Tol2 transposon-based transgenic constructs. Here, we describe the flexible Tol2 system toolbox and a protocol for generating transgenic constructs ready for zebrafish transgenesis and their use in ethanol studies.

This work describes a protocol for the modular Tol2 transgenesis system, a gateway-based cloning method to create and inject transgenic constructs into zebrafish embryos.

O Sistema Zebrafish Tol2: Uma Abordagem de Transgênese Modular e Flexível Baseada em Gateway

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Investigando o desenvolvimento com manipulação de sinalização optogenética em peixe-zebra

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

Autor em destaque: Manipulando a sinalização em embriões de peixe-zebra para decodificar decisões de destino celular 

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

Ativação da Sinalização Optogenética em Embriões de Zebrafish

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and behavioural research. As a vertebrate, zebrafish share considerable genetic sequence similarity with humans and are being used as an animal model for various human disease conditions. The advantages of zebrafish in comparison to other common vertebrate models include high fecundity, low maintenance cost, transparent embryos, and rapid development. Due to the spur of interest in zebrafish research, the need to establish and maintain a productive zebrafish housing facility is also increasing. Although literature is available for the maintenance of a zebrafish laboratory, a concise video protocol is lacking. This video illustrates the protocol for regular housing, feeding, breeding and raising of zebrafish larvae. This process will help researchers to understand the natural behaviour and optimal conditions of zebrafish husbandry and hence troubleshoot experimental issues that originate from the fish husbandry conditions. This protocol will be of immense help to researchers planning to establish a zebrafish laboratory, and also to graduate students who are intending to use zebrafish as an animal model.

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

This protocol outlines regular maintenance and care to maintain optimal conditions for zebrafish husbandry. The video illustrates the protocol for system maintenance, regular housing, feeding, breeding, and raising of zebrafish larvae.

Cuidados e manutenção regular de um peixe-zebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Laboratório: Uma Introdução

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

Biologia

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

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A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

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