Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial (NIDCR) concessão F32 (DE021929) para JLF e uma bolsa DE016402 NIDCR R01 para RAS

1. Prepare tungstênio Agulhas <ol><li> Corte uma haste de tungstênio ao meio usando cortadores de fio, de modo que a vara não dobrar. </li><li> Colocar a haste através da extremidade cónica de uma 5 3/4 em vidro de borosilicato pipeta Pasteur. </li><li> Deixando cerca de 3/4 em da degola rebento do vidro, aderem a vara para a ponta da pipeta com uma pequena pérola de &quot;adesivo hot melt&quot; (HMA), que é o bastão de cola usada para uma pistola de cola. O HMA deve ser rapidamente derretido em uma chama de álcool, tomando cuidado para não queimar a cola e gerar fumaça preta. </li><li> Utilizando um par de pinças, dobrar a ponta da haste de tungsténio (cerca de 1/4 a partir do topo final) até um ângulo de 45 ° é atingido. </li><li> Segurando a pipeta de Pasteur, colocar cerca de 1/8 da da ponta da haste de tungsténio na chama de uma lâmpada de propano. Segure a ponta firme e exatamente perpendicular à chama. </li><li> Retire a agulha da chama do momento que uma pequena mancha laranja de TUNGSdez moscas fora da agulha. </li></ol> 2. Prepare Spemann Pipettes <ol><li> Utilizando um bico de Bunsen, o calor da extremidade mais estreita de uma pipeta de Pasteur de vidro, até a pouco para além do afunilamento começa a derreter. Retire do fogo e puxe a ponta até a pipeta fica selado. Assegure-se que continua a haver uma porção da parte afunilada que tem um diâmetro externo de cerca de 0,7-1,0 mm. Quebre o final selada cerca de 4 cm do cone. </li><li> Anexar cerca de 2 pés (60 cm) de tubo de borracha para a largura (aberto) final da pipeta. Soprar sobre a outra extremidade do tubo de borracha para assegurar que nenhum ar pode passar através da parte cónica da pipeta Pasteur. </li><li> Usando um cilindro de gás propano com um maçarico de chama ligado lápis, aquecer uma área oval, de um lado da pipeta logo abaixo do início da conicidade. Soprar ar muito suavemente e constantemente, através do tubo de borracha, com uma pequena quantidade de pressão (aproximadamente a quantidade de pressão necessária para dizer que o início do letter &quot;P&quot; em nível de conversação). Quando o vidro se torna suave de um lado e começa a fivela para fora, remover rapidamente a pipeta da chama e golpe duro e constante através do tubo de borracha. Isso fará com que a parte aquecida do vidro para formar uma bolha em forma de salsicha que pode aparecer, que é bom. Se a bolha é muito pequeno, tente derretendo e soprando o vidro novamente. A última janela aberta no vaso deve ser de cerca de 0,25 in (6,35 mm) de largura por 0,5 cm (12,7 mm) de comprimento. </li><li> Apontando a extremidade cónica para cima, raspe a bolha em um recipiente de resíduos de vidro, enquanto soprando suavemente através do tubo para evitar que fragmentos de vidro de entrar na pipeta. </li><li> Usando a chama de propano, queimar as bordas restantes da bolha e fogo-polonês nas laterais da janela aberta. Tome cuidado para não derreter o eixo da pipeta. </li><li> Com um lápis ponto diamante, marcar a extremidade cónica da pipeta aproximadamente 1,25 em (30 mm) a partir da janela e quebrar a pontacom uma pinça, de modo que a abertura da pipeta é cortado de forma limpa (pipetas de descarte com pontas quebradas ou irregulares). </li><li> Usando fórceps e da borda de uma chama de um queimador de álcool, dobrar a porção estreita da pipeta em 0,375 (9,5 mm) a partir da ponta com um ângulo de aproximadamente 60 °, de modo que a parte dobrada está situado num plano vertical, quando da abertura da janela está na posição de 01:00 para o uso com a mão direita e as 11:00 h para o uso do canhoto. Este passo é melhor realizado em um free-projecto de gabinete. </li><li> -Polonês fogo a ponta usando a chama de álcool sob um microscópio de dissecação. Não se esqueça de fechar a ponta, mas sim manter a rodada de abertura e suave sem qualquer constrição. </li><li> Cortar um pedaço de 1 (25 mm) de um tubo de borracha, pulverizar o pedaço de tubo com 70% de etanol, e o tubo de deslize ao longo do eixo da pipeta até a abertura da janela está completamente coberto. Isso funciona como o &quot;diafragma&quot; da pipeta Spemann. </li><li> Coloque uma lâmpada ml látex de borracha 2sobre a parte inferior aberta da pipeta. A lâmpada mantém a pressão negativa na pipeta Spemann. </li><li> Para praticar o uso de uma pipeta de Spemann, transferir os grânulos de cromatografia de cerca de 100-200 um de diâmetro a partir de um ponto marcado em uma placa de Petri com um ponto marcado na outra sob um microscópio. </li><li> Para limpar a pipeta Spemann, retire o bulbo de borracha e local pipeta, ponta para baixo, em um copo alto forrado com algodão ou gaze na parte inferior e preenchido com água destilada e detergente copos. </li></ol> 3. Esterilizar e incubar ovos <ol><li> Wipe ovos com etanol a 70% e colocar os ovos em tabuleiros de plástico de ovo. </li><li> Definir os ovos numa incubadora aquecida a 37,5 ° C e 85-87%. </li><li> Incubar os ovos até que eles atinjam HH9.5, cerca de 26 horas, para a codorna e 48 horas para pato. </li></ol> 4. Janela Eggs <ol><li> Retirar uma pequena peça de concha exterior da parte superior do ovo com uma pinça, tendo o cuidado de não perfurar o invólucro interior membrane. </li><li> Usando uma seringa com uma agulha de 18 G por 1 polegada, fazer um buraco na ponta mais estreita do ovo e retirar aproximadamente 1-2 ml de albumina. </li><li> Coloque fita adesiva transparente sobre o buraco e marca punção no shell. </li><li> Cortar uma &quot;janela&quot; ao longo da superfície superior do ovo (através da fita transparente) usando uma tesoura curva. </li></ol> 5. Visualize Embriões e preparar para a cirurgia <ol><li> Usando uma vareta de vidro, escova suavemente uma pequena quantidade de vermelho neutro (0,02 g / mL em BSS de Hank) sobre o embrião. </li><li> Corte a membrana vitelina e puxe-o sobre o embrião usando uma agulha de tungstênio afiadas-chama. </li><li> Re-selar o ovo, colocando fita adesiva transparente sobre a janela. </li></ol> 6. Separe o tecido do doador a partir do embrião de Doadores <ol><li> Retire a fita da janela sobre o ovo do embrião doador. </li><li> Para cortar a dobra neural da ectoderme adjacente do embrião dador, fazer fendas em ambos sides do tubo neural, utilizando uma agulha afiada tungsténio-chamas (fabricado como descrito acima). </li><li> Em seguida, cortam o tubo neural aos níveis anteriores e posteriores desejadas do enxerto e o enxerto de separar do resto do tubo neural. </li><li> Remover a dobra neural do embrião dador utilizando uma pipeta de Spemann ou outro tipo de micropipeta. </li><li> Em seguida, retirar a fita adesiva a partir da janela sobre o ovo do hospedeiro e usar a pipeta Spemann para colocar a dobra neural doador ao lado do embrião hospedeiro adjacente à região do tubo neural, que vai receber o transplante. </li></ol> 7. Separe o tecido hospedeiro e Transplante do tecido do doador <ol><li> Separa-se a dobra neural do tubo neural do embrião hospedeiro, como feito com o doador. Tome cuidado para remover um enxerto de igual tamanho que o tecido do doador. </li><li> Suavemente empurrar este tecido hospedeiro longe do embrião. </li><li> Então, com uma agulha de tungstênio sem corte ou a ponta arredondada de um micropipette, mova suavemente o doador neural dobra no tubo neural de acolhimento, mantendo as orientações ântero-posterior e dorso-ventral adequadas. Certifique-se que o enxerto é dobrado ao longo dos lados, mas não se esqueça de picar ou danos aos tecidos subjacentes. Para ajudar a manter o controle da nota orientação original as assimetrias no tecido do doador ou coloração diferencial do vermelho neutro. Nós também foto-documento o embrião dador com o tecido que acompanha excisada, bem como a quimera imediatamente após a cirurgia. </li><li> Salina estéril deve ser adicionado ao ovo se o embrião hospedeiro mostra sinais de dessecação. </li><li> Agora, cuidadosamente re-vedação e rotular o ovo, e devolvê-lo suavemente para uma incubadora de humidade elevada (70-80%), onde o embrião quimérico pode desenvolver para a fase desejada para análise. </li></ol> 8. Recolha de Quimeras <ol><li> Certifique-se de coletar embriões quiméricos em acabado de fazer fixador frio da Serra e colocá-los imediatamente em uma rocker a 4 ° C durante uma fixação S / N. Isto irá permitir a detecção mais sensível de células de codorniz com o anticorpo anti-codorniz. </li><li> Para as análises de expressão gênica por meio de RT-qPCR, congelar embriões diretamente em nitrogênio líquido antes da extração de RNA. </li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A crista neural é uma população de células embrionárias transiente que migra muito em todo o embrião e diferencia-se em diversos tipos celulares, incluindo osteoblastos, condrócitos e que contribuem para o esqueleto craniofacial. Transplante crista neural no sistema quimérico codorna-pato tem contribuído grandemente para a nossa compreensão das interações de tecido e vias de sinalização que regulam o desenvolvimento do esqueleto craniofacial. No entanto, dado o vasto potencial da crista neural também gerar células musculares lisas, adipócitos, melanócitos, células de Schwann, neurônios, o sistema quimera codorna-pato tem um tremendo potencial para futuras aplicações, particularmente em conjunto com o rápido avanço da biologia de células-tronco e medicina regenerativa. Desde codorna e pato são as duas espécies criadas comercialmente, um pronto fornecimento de ovos fertilizados relativamente barata está disponível a partir de uma variedade de fazendas. Assim, esta técnica deve ser acessível a researcdela operando dentro de uma ampla gama de orçamentos e espaço facilidade. Embora esta técnica é muito poderosa, ainda há várias limitações. Como outras técnicas cirúrgicas, a qualidade ea viabilidade de quimeras codorna-pato confiar nas habilidades cirúrgicas do pesquisador e, portanto, não haverá mais variação inter e intra-individual entre os experimentos, em comparação com outros modelos, como aqueles que utilizam o mouse genética. Além disso, há também a variação nas taxas de desenvolvimento e as fases de embriões individuais que contribuem para a reprodutibilidade e sucesso de cada transplante. Embriões de aves também são muito suscetíveis à desidratação e, portanto, as etapas críticas durante a cirurgia incluem manter os níveis de luz baixa, o tempo sob o microscópio a um mínimo, os ovos seladas com fita adesiva, tanto quanto possível, e alta umidade na incubadora de pós-operatório de evitar a dessecação. Em termos de viabilidade das quimeras, usually entre 50-75% sobrevivem, embora estas percentagens podem diminuir o mais velho a etapa de coleta. Em uma típica sessão de 4-6 horas de cirurgia, um cirurgião experiente pode gerar 10-15 quimeras. O sucesso dos transplantes também depende muito da qualidade das ferramentas. Boas ferramentas de levar a resultados reprodutíveis, mais consistentes. Usando um maçarico para fazer agulhas de tungstênio permite agulhas extremamente afiadas para ser feita. O tipo de tocha usado faz uma grande diferença, pois controla o tamanho da chama. Nitidez eletrolítica também pode ser usado, mas esta abordagem não chega nem perto de produzir agulhas tão acentuada. Utilize hastes de tungstênio em vez de fios acondicionados em bobinas de modo que as agulhas podem ser feitas em linha reta. A micropipeta de Spemann, enquanto que consome tempo e é difícil de fazer, é um instrumento ideal para a transferência do tecido. A pipeta pode ser personalizado com diferentes tamanhos de aberturas, e pode ser utilizado repetidamente. Um fator crítico para usinga Spemann micropipeta é ter algum líquido no pipeta antes de tocar a ponta para a superfície do embrião. Algum do fluido irá fluir sempre para fora quando o contacto é feito com o menisco sobre o embrião. Pressionando sobre o diafragma permite que o tecido fluido e enxerto a ser ejetado de forma muito precisa, ao passo que um pouco desistir no diafragma suavemente suga o tecido doador do enxerto para a pipeta. A manutenção de um pouco de pressão positiva no diafragma mantém o tecido do enxerto doador na ponta da pipeta durante a transferência, e um pouco de pressão adicional sobre o diafragma permite que o tecido do enxerto doador para ser deliberadamente colocado no hospedeiro. Para a proteção da pipeta Spemann durante o armazenamento e esterilização, retire a lâmpada a partir do final de largura e insira cuidadosamente a ponta cônica para o bulbo. Coloque a pipeta Spemann em um tubo de ensaio de vidro, cubra a parte superior com uma folha de alumínio, e autoclave antes da cirurgia. Após várias pipetas são reAdy para ser esterilizado novamente para a cirurgia, inverter as pipetas, aquecê-los quase a ferver na mesma solução de água destilada e de detergente de vidro, e em seguida enxaguar repetidamente com água destilada. Pipetas Autoclave em seus tubos individuais. O tubo de borracha que se forma o diafragma eo bulbo de borracha deve ser substituído depois de várias esterilizações ou quando se tornam escurecido e duro. Muitos dos componentes do presente protocolo envolve equipamento perigoso. Por exemplo, o procedimento para a realização de um Spemann Micropipeta envolve três tipos de chamas, bem como aquecimento, puxar, sopro, dobra, corte e polimento de vidro. Portanto, uso de equipamento de proteção individual adequado (PPE), que aumenta a segurança, como óculos de proteção e um jaleco é crítica. Além disso, porque muitas pessoas sofrem, ou têm potencial para se desenvolver, alergias ao ovo, use sempre luvas ao manusear ovos. Com estas precauções em mente, o sistema quimérico codorna-pato isa método seguro, eficiente e relativamente acessível, que tem muitas aplicações futuras.

O esqueleto facial desenvolve com o crescimento e fusão de vários processos faciais que são compostos de crista neural e mesodermal mesenchyme cercado por ectodérmica e camadas epiteliais endoderme 1-11. Eventos morfogenéticos dentro de cada processo são regidos por interações de sinalização distintas entre o mesênquima e epitélio em torno de 12-16. Alterações a estas interações de sinalização e / ou seus efetores downstream contribuir para fenótipos da doença e também pode ser relevante para a evolução do esqueleto craniofacial 17, 18. Portanto, elucidando o momento ea natureza das interações de tecido tem um grande potencial para aumentar a nossa compreensão da biologia do desenvolvimento e da evolução do esqueleto facial. A utilização de embriões quiméricos para investigar as interações de tecido tem uma longa história em biologia do desenvolvimento. Esta abordagem foi iniciada por Hans Spemann e seu laboratórioque descobriu embrionárias &quot;organizadores&quot; através do transplante de tecidos entre os embriões de diferentes espécies de anfíbios. Spemann era um mestre de técnicas de micro-cirúrgicos, cuja mão-habilidades foram complementadas com o seu desenvolvimento de ferramentas especializadas, nomeadamente a pipeta Spemann. Viktor Hamburger era um estudante de pós-graduação no laboratório de Hans Spemann em Freiburg durante a década de 1920, que é quando os experimentos de transplante de originais que levaram ao Prêmio Nobel da Spemann foram realizados. Quando Hamburger mudou-se para Washington University, em St. Louis, em 1935, ele detalhou o processo de fazer uma micropipeta Spemann em seu Manual de Embriologia Experimental 19. Desenhou Noden era um estudante de pós-graduação no laboratório de Hamburger na Universidade de Washington até 1972. Depois de se mudar para a Universidade de Massachusetts, Amherst e depois para a Universidade de Cornell, Noden continuou fabricando e usando micropipetas Spemann por seus transplantes cirúrgicos envolvendo quimeras codorna-galinha. &amp;# 160;. Enquanto um estudante de pós-graduação, um dos autores (Rich Schneider) treinados, com Drew Noden em Cornell 1995-1998 O protocolo a seguir para fazer uma micropipeta Spemann é baseado em descrições escritas por Hamburger e Noden e inclui modificações subseqüentes feitas por Schneider. O uso de quimeras codorna-de bico para o estudo do desenvolvimento craniofacial e, especialmente, para a compreensão das contribuições de células da crista neural foi iniciada por Noden e por Le Douarin no início de 1970, revisto em Le Douarin et al 20. Esta abordagem tem sido amplamente adotado em muitos estudos e por inúmeros outros pesquisadores 1, 4, 5, 21-38. As taxas equivalentes de crescimento e morfologia de codorna e galinha fazer transplantes dentro deles ideal para o estudo do destino celular e rastreamento de linhagem. No entanto, por causa das semelhanças entre codorna e galinha, alterações morfológicas induced por células do doador são difíceis de decifrar. Em contraste, outros sistemas quiméricos aviária incluíram pato doméstico como uma forma de estudar os mecanismos que fazem embriões anatomicamente distinto 39-50. Mais especificamente, o sistema quimérico codorna-pato oferece vários benefícios para discernir os efeitos do doador sobre o hospedeiro, e vice-versa. Primeiro, os embriões de codorna e pato são distintas no tamanho do corpo e forma, que fornece uma maneira direta para explorar ou doador-mecanismos específicos do hospedeiro de formação de padrões através da análise para domínios diferenciais de expressão gênica (Figuras 1 A e B). Em segundo lugar, os embriões de codorna e pato têm consideravelmente diferentes taxas de maturação, com codorna incubação em 17 dias e pato eclosão em 28 dias. Crista neural transplantados mantém a sua taxa de maturação intrínseca dentro do ambiente de acolhimento e, assim, a identificação de mudanças temporais na expressão gênica, interações tecido, histogênese e morfogênese é possível51-57. Finalmente, o anticorpo anti-nuclear de codorniz (Q ¢ PN) permite que os dadores e albergar as contribuições celulares para ser permanentemente distinguidos um do outro através do reconhecimento de uma proteína que é expressa ubiquamente em células de codorniz, mas ausente de células de pato.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>TEK</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s BSS w/o phenol red</td><td>Invitrogen</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Red</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4638-5G</td><td>0.22 &amp;micro;m filter-sterilized</td></tr><tr><td>18 G Needles</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>5 ml syringe</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Dumont forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Straight Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Curved Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Spemann Pipette</td><td></td><td></td><td>Hand-made in lab</td></tr><tr><td>Egg Holder</td><td></td><td></td><td>Glass ashtray and modeling clay</td></tr><tr><td>Alcohol Burner</td><td>Fisher</td><td>04-245-1</td><td></td></tr><tr><td>Transparent Tape</td><td>3M Scotch</td><td>600</td><td></td></tr><tr><td>Glass Stirring Rod</td><td>Fisher</td><td>11-380C</td><td>Tip is narrowed and rounded using a flame</td></tr><tr><td>Tungston wire (0.004 x 3 inches)</td><td>A-M Systems</td><td>7190</td><td>Tip is flame-sharpened in a propane torch</td></tr><tr><td>Bunsun Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>S49117</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>22-183-632</td><td>9-inch (229 mm)</td></tr><tr><td>Rubber Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-178C</td><td>amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 in/1.6 mm; O.D.: 0.375 in/9.5 mm; I.D.: 0.25 in/6.4 mm</td></tr><tr><td>Propane Fuel Cylinder</td><td>BernzOmatic</td><td>UL2317</td><td>TX-9 with torch style &quot;A&quot; with a screw-on brass &quot;pencil flame&quot; torch</td></tr><tr><td>Diamond Point Pencil</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-268912</td><td></td></tr><tr><td>Rubber Bulbs</td><td>Fisherbrand</td><td>S32325</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras

A geração de embriões quiméricos é uma abordagem ampla e poderosa para estudar os destinos celulares, interações tecido e espécie-específicos contribuições para a análise histológica e desenvolvimento morfológico dos embriões vertebrados. Em particular, a utilização de embriões quiméricos estabeleceu a importância da crista neural em dirigir a morfologia específica da espécie do complexo craniofacial. O método aqui descrito utiliza duas espécies de aves, pato e codorniz, com notavelmente diferente morfologia craniofacial. Este método facilita muito a investigação da regulação molecular e celular de padrão específico da espécie no complexo craniofacial. Experimentos em codorna e pato embriões quiméricos já revelaram interações mediadas tecido da crista neural e comportamentos de células-autônoma que regulam padrão espécie-específicos no esqueleto craniofacial, musculatura e tegumento. A grande diversidade de derivados da crista neural sugere um potencial significativopara futuras aplicações do sistema quimérico codorna-pato para a compreensão do desenvolvimento dos vertebrados, doenças e evolução.

Antes de posterior análise, a eficiência do transplante tem de ser ensaiada. Para análise histológica, análises de expressão morfológica, ou gene em amostras de tecido, células de codorniz deve ser detectado por imuno-histoquímica utilizando anticorpos Q ¢ PN tal como descrito 36. Para as análises de RNA, espécie-específicos contribuições para os tecidos de interesse pode ser calculada usando uma estratégia baseada em PCR 58. Após a eficácia do transplante foi validado, outras medidas de resultados morfológicas ou moleculares pode ser avaliada em quimeras. As interações entre as células da crista neural doadores e tecidos circundantes derivados do hospedeiro que fundamentam histogênese adequada e morfogênese do complexo craniofacial já sido extensivamente estudada. Em particular, mesênquima da crista neural dirige morfologia específica da espécie da face 7, 13, 51, 59, teste padrão da pena 52, padrão muscular 56 </s<html> up&gt; e cartilagem 53, 57 através da regulação da expressão gênica host. Por exemplo, mesênquima da crista neural dita quando formas de osso na mandíbula por temporalmente regulação da expressão Bmp4 55. Recentemente, investigações têm-se centrado nas interações tecido que ocorrem muito cedo no desenvolvimento craniofacial. Neste sentido, experiências utilizando quimeras codorna-pato mostraram embriões hospedeiros influenciar a migração da crista neural, determinando limites morfológicos. Ou seja, em embriões quck quiméricos, células da crista neural doador de codorna migrar para o anfitrião pato mandibular arco em um padrão de pato-like (Figura 1D). Apesar de esta contribuição hospedeiro ao tamanho da população da crista neural, da crista neural doador continua a gerar um esqueleto mandibular que é codorniz semelhante em tamanho e forma (Figura 1E). e 1 &quot;fo: Content-width =&quot; 6 pol &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Quail-Duck Chimeric sistema. (A) Quail e (B) crânios pato apresentam diferenças consideráveis ​​em tamanho e forma, e, portanto, são ideais para o uso de um sistema quimérico para estudar o desenvolvimento craniofacial (modificado de Tokia et al. 56). (C) O delineamento experimental para a geração de embriões quiméricos quck unilaterais de correspondência de fase HH9.5 codorna e embriões de pato. A dobra neural é removido de um lado de embriões de codorniz e transplantadas em embriões de pato após uma peça equivalente da dobra neural foi removido. (D) As células doadoras de codorniz (verde) pode ser seguido em quimeras utilizando um anticorpo anti-codorniz (Q ¢ PN) como mostrado na vista ventral de H12 embrião quimérico. (F) em mandíbulas quck em HH38, a codorna doador-derivadas Meckel7; s cartilagem é mais curto e mais reto do que a observada para a cartilagem contralateral derivados do hospedeiro pato de Meckel, que é maior e curvado. Reproduzido Tokita et al., Dev. Bio. 306, 377 (2007) com permissão da Elsevier.

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Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Este artigo descreve um método para gerar embriões quiméricos que são projetados para testar as contribuições específicas de espécies de crista neural e / ou outros tecidos para o desenvolvimento craniofacial.

Avaliando Contribuições Espécies específicas Para o Desenvolvimento Craniofacial Utilizando Quimeras Codorniz-pato

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

assessing-species-specific-contributions-to-craniofacial-development

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K visualizações.  University of California at San Francisco.  Este artigo descreve um método para gerar embriões quiméricos que são projetados para testar as contribuições específicas de espécies de crista neural e / ou outros tecidos para o desenvolvimento craniofacial. 

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Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. Patterning of the Meckel&#39;s cartilage, a first pharyngeal arch derivative, involves the migration of cranial neural crest (CNC) cells and the progressive partitioning, proliferation and organization of differentiated chondrocytes. Several studies have described CNC migration during lower jaw&#160;morphogenesis, but the details of how the chondrocytes achieve organization in the growth and extension of Meckel&#8217;s cartilage remains unclear. The sox10 restricted and chemically induced Cre recombinase-mediated recombination generates permutations of distinct fluorescent proteins (RFP, YFP and CFP), thereby creating a multi-spectral labeling of progenitor cells and their progeny, reflecting distinct clonal populations. Using confocal time-lapse photography, it is possible to observe the chondrocytes behavior during the development of the zebrafish Meckel&#8217;s cartilage.
Multispectral cell labeling enables scientists to demonstrate extension of the Meckel&#8217;s chondrocytes.&#160;During extension phase of the Meckel&#8217;s cartilage, which prefigures the mandible, chondrocytes intercalate to effect extension as they stack in an organized single-cell layered row. Failure of this organized intercalating process to mediate cell extension provides the cellular mechanistic explanation for hypoplastic mandible that we observe in mandibular malformations.

Cell organization of craniofacial bones has long been hypothesized but never directly visualized. Multi-spectral cell labeling and in vivo live imaging allows visualization of dynamic cell behavior in zebrafish lower jaw. Here, we detail the protocol to manipulate Zebrabow transgenic fish and directly observe cell intercalation and morphological changes of chondrocytes in the Meckel&#8217;s cartilage.

Visualização de condrócitos Intercalation e Direcional Proliferação via Zebrabow Análise celular clonal na cartilagem de Meckel o Embryonic

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. Chimeric avian embryos, in which quail donor tissue is transplanted into a chick embryo in ovo, combine the power of indelible genetic labeling of cell populations with the ease of manipulation presented by the avian embryo.
Quail-chick chimeras are a classical tool for tracing migratory neural crest cells (NCCs)1-3. NCCs are a transient migratory population of cells in the embryo, which originate in the dorsal region of the developing neural tube4. They undergo an epithelial to mesenchymal transition and subsequently migrate to other regions of the embryo, where they differentiate into various cell types including cartilage5-13, melanocytes11,14-20, neurons and glia21-32. NCCs are multipotent, and their ultimate fate is influenced by 1) the region of the neural tube in which they originate along the rostro-caudal axis of the embryo11,33-37, 2) signals from neighboring cells as they migrate38-44, and 3) the microenvironment of their ultimate destination within the embryo45,46. Tracing these cells from their point of origin at the neural tube, to their final position and fate within the embryo, provides important insight into the developmental processes that regulate patterning and organogenesis.
Transplantation of complementary regions of donor neural tube (homotopic grafting) or different regions of donor neural tube (heterotopic grafting) can reveal differences in pre-specification of NCCs along the rostro-caudal axis2,47. This technique can be further adapted to transplant a unilateral compartment of the neural tube, such that one side is derived from donor tissue, and the contralateral side remains unperturbed in the host embryo, yielding an internal control within the same sample2,47. It can also be adapted for transplantation of brain segments in later embryos, after HH10, when the anterior neural tube has closed47.
Here we report techniques for generating quail-chick chimeras via neural tube transplantation, which allow for tracing of migratory NCCs derived from a discrete segment of the neural tube. Species-specific labeling of the donor-derived cells with the quail-specific QCPN antibody48-56 allows the researcher to distinguish donor and host cells at the experimental end point. This technique is straightforward, inexpensive, and has many applications, including fate-mapping, cell lineage tracing, and identifying pre-patterning events along the rostro-caudal axis45. Because of the ease of access to the avian embryo, the quail-chick graft technique may be combined with other manipulations, including but not limited to lens ablation40, injection of inhibitory molecules57,58, or genetic manipulation via electroporation of expression plasmids59-61, to identify the response of particular migratory streams of NCCs to perturbations in the embryo's developmental program. Furthermore, this grafting technique may also be used to generate other interspecific chimeric embryos such as quail-duck chimeras to study NCC contribution to craniofacial morphogenesis, or mouse-chick chimeras to combine the power of mouse genetics with the ease of manipulation of the avian embryo.62

An approach for analyzing migration and eventual fate of avian neural crest cells in quail-chick chimeric embryos is described. This method is a simple and straightforward technique for tracing neural crest cells during migration and differentiation that are otherwise difficult to distinguish within an unmanipulated chick embryo.

Análise de migração da crista neural e Diferenciação por Cross-espécies de Transplantes

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

Neurociência

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the formation of quail-chicken chimeras and the use of the chorioallantoic membrane (CAM) to sustain the development of ectopic tissues date back to the last century. Nowadays, the combination of these classical techniques with recent in vitro methodologies offers novel prospects to further explore organ formation.
Here we describe a two-step approach to study early- and late-stages of organogenesis. Briefly, the embryonic region containing the presumptive territory of the organ is isolated from quail embryos and grown in vitro in an organotypic system (up to 48 h). Cultured tissues are subsequently grafted onto the CAM of a chicken embryo. After 10 days of in ovo development, fully formed organs are obtained from grafted tissues. This method also allows the modulation of signaling pathways by the regular administration of pharmacological agents and tissue genetic manipulation throughout in vitro and in ovo developmental steps. Additionally, developing tissues can be collected at any time-window to analyze their gene-expression profile (using quantitative PCR (qPCR), microarrays, etc.) and morphology (assessed with conventional histology and immunochemistry).
The described experimental procedure can be used as a tool to follow organ formation outside the avian embryo, from the early stages of organogenesis to fully formed and functional organs.

This article provides an updated approach to the classical quail-chicken chimera system to study organ formation, by combining novel in vitro and in ovo experimental procedures.

Abordagem em duas fases para explorar e tarde-estágios iniciais de formação do órgão no modelo aviária: O Timo e glândulas paratireoides organogênese paradigma

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed contributions to unveiling key processes in developmental biology.
Herein is described an optimized method to isolate embryonic tissues from quail and chickens by microsurgery and enzymatic digestion while preserving its biological properties. After isolation, tissues from both species are associated in an in vitro organotypic assay for 48 h. Quail and chicken tissues can be discriminated by distinct nuclear features and molecular markers allowing the study of the cellular cross-talk between heterospecific association of tissues. This approach is, therefore, a useful tool for studying complex tissue interactions in developmental processes with highly dynamic spatial modifications, such as those occurring during pharyngeal morphogenesis and the formation of the foregut endoderm-derived organs. This experimental approach was first developed to study the epithelial-mesenchymal interactions during early-stages of thymus formation. In this, the endoderm-derived prospective thymic rudiment and mesoderm-derived mesenchyme, were isolated from quail and chicken embryos, respectively.
The capacity of the associated tissues to generate organs can be further tested by grafting them onto the chorioallantoic membrane (CAM) of a chicken embryo. The CAM provides nutrients and allows gas exchanges to the explanted tissues. After 10 days of in ovo development, the chimeric organs can be analyzed in the harvested explants by conventional morphological methods. This procedure also allows studying tissue-specific contributions during organ formation, from its initial development (in vitro development) to the final stages of organogenesis (in ovo development).
Finally, the improved isolation method also provides three-dimensionally (3D) preserved embryonic tissues, that can also be used for high-resolution topographical analysis of tissue-specific gene-expression patterns.

This article provides a method to isolate pure embryonic tissues from quail and chicken embryos that can be combined to form ex vivo chimeric organs.

Isolamento de tecidos embrionários e formação de órgãos quiméricoes codorna-frango, usando o exemplo do Timo

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the strengths of this model system is that the effect of, and interaction among, tissues can be directly assessed in chimeric embryos. We have previously shown that signals from the forebrain contribute to facial morphogenesis by regulating the shape of the expression domain of Sonic hedgehog (SHH) in the Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ). In this article, the method of generating the forebrain chimeras and provide illustrations of the outcomes of these experiments is described.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of basal forebrain&#160;during craniofacial development.

Criando quimeras do prosencéfalo aviário para avaliar o desenvolvimento facial

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

A Label-free Xenograft Model for Investigating the Behavior of Human Stem Cell Spheroids in Chick Embryos

Xenografts are valuable methods to investigate the behavior of human cells in vivo. In particular, the embryonic environment provides cues for cell migration, differentiation, and morphogenesis, with unique instructive signals and germ layer identity that are often absent from adult xenograft models. In addition, embryonic models cannot discriminate self versus non-self tissues, eliminating the risk of rejection of the graft and the need for immune suppression of the host. This paper presents a methodology for transplantation of spheroids of human cells into chicken embryos, which are accessible, amenable to manipulation, and develop at 37 &#176;C. 
Spheroids allow the selection of a specific region of the embryo for transplantation. After being grafted, the cells become integrated into the host tissue, allowing the follow-up of their migration, growth, and differentiation. This model is flexible enough to allow the utilization of different adherent populations, including heterogeneous primary cell populations and cancer cells. To circumvent the need for prior cell labeling, a protocol for the identification of donor cells through hybridization of human-specific Alu probes is also described, which is particularly important when investigating heterogeneous cell populations. Furthermore, DNA probes can be easily adapted to identify other donor species. This protocol will describe the general methods for preparing spheroids, grafting into chicken embryos, fixing and processing tissue for paraffin sectioning, and finally identifying the human cells using DNA in situ hybridization. Suggested controls, examples of interpretation of results and various cell behaviors that can be assayed will be discussed in addition to the limitations of this method.

Here, we describe a method to transplant and identify human cell spheroids into chick embryos. This xenograft model uses the embryonic microenvironment as a source of instructive signals to assay cell migration, differentiation, and tropism and is especially suited for the study of primary and/or heterogeneous cell populations.

Xenografts are valuable methods to investigate the behavior of human cells in vivo. In particular, the embryonic environment provides cues for cell ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Avaliar Propriedades Sinalização de Ectodérmica Epitélio Durante o Desenvolvimento Craniofacial

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Biologia

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Transplantes faciais em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Os embriões

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and memory and learning4,5,6. As the only songbird with a sequenced genome, the zebra finch has great potential for use in developmental studies; however, the early stages of zebra finch development have not been well studied. Lack of research in zebra finch development can be attributed to the difficulty of dissecting the small egg and embryo. The following dissection method minimizes embryonic tissue damage, which allows for investigation of morphology and gene expression at all stages of embryonic development. This permits both bright field and fluorescence quality imaging of embryos, use in molecular procedures such as in situ hybridization (ISH), cell proliferation assays, and RNA extraction for quantitative assays such as quantitative real-time PCR (qtRT-PCR).&#160;This technique allows investigators to study early stages of development that were previously difficult to access.

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.

Dissecção e Análise de Downstream da Zebra Finch embriões em estágios iniciais de desenvolvimento

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...