Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (NIDCR) subvención F32 (DE021929) a JLF y una subvención DE016402 NIDCR R01 para RAS

1. Preparar tungsteno Agujas <ol><li> Cortar una varilla de tungsteno en el medio usando cortadores de alambre para que la varilla no se dobla. </li><li> Enrosque la varilla a través del extremo afilado de un pipeta Pasteur de 5 3/4 en vidrio de borosilicato. </li><li> Dejar aproximadamente 3/4 en la adherencia vara del vidrio, adherir la varilla a la punta de la pipeta con una pequeña capa de &quot;adhesivo de fusión en caliente&quot; (HMA), que es la barra de pegamento utilizado para una pistola de pegamento. La HMA debe fundirse rápidamente en una llama de alcohol, teniendo cuidado de no quemar el pegamento y generar humo negro. </li><li> El uso de un par de fórceps, doblar la punta de la varilla de tungsteno (aproximadamente 1/4 desde el extremo superior) hasta que se alcanza un ángulo de 45 °. </li><li> Sujetando la pipeta Pasteur, colocar 1/8 en la punta de la varilla de tungsteno en la llama de un soplete de propano. Mantenga la punta constante y exactamente perpendicular a la llama. </li><li> Retire la aguja de la llama en el momento de una pequeña mancha de color naranja de tungsdiez moscas fuera de la aguja. </li></ol> 2. Preparar Spemann Pipetas <ol><li> El uso de un mechero Bunsen, calentar el extremo estrecho de una pipeta Pasteur hasta que el vidrio poco más allá de la forma cónica comienza a derretirse. Retire del fuego y tirar de la punta hasta que se sella la pipeta. Asegúrese de que queda una porción de la parte ahusada que tiene un diámetro exterior de aproximadamente 0,7-1,0 mm. Romper el extremo sellado a cerca de 4 cm de la puesta a punto. </li><li> Fije unos 2 pies (60 cm) de tubo de goma al extremo ancho (abierta) de la pipeta. Blow en el otro extremo del tubo de goma para asegurar que el aire no puede pasar a través de la parte cónica de la pipeta Pasteur. </li><li> El uso de un cilindro de combustible de propano con una antorcha de llama lápiz adjunta, calentar un área ovalada en un lado de la pipeta justo por debajo del inicio de la conicidad. Soplar aire muy suavemente y constantemente a través del tubo de goma con una ligera cantidad de presión (aproximadamente la cantidad de presión necesaria para decir el comienzo de la Letter &quot;P&quot; a nivel de conversación). Cuando el vidrio se ablanda en un lado y comienza a doblarse hacia afuera, eliminar rápidamente la pipeta de la llama y soplar fuerte y constante a través del tubo de goma. Esto hará que la parte calentada del vidrio para formar una burbuja en forma de salchicha que pueden aparecer, la cual está muy bien. Si la burbuja es demasiado pequeño, trate de fusión y soplando el vidrio de nuevo. La ventana abierta final en el cristal debe estar alrededor de 0,25 in (6,35 mm) de ancho por 0,5 pulgadas (12,7 mm) de largo. </li><li> Señalando el extremo cónico hacia arriba, raspar la burbuja en un recipiente de residuos de vidrio, mientras que sopla suavemente a través de la tubería para evitar que fragmentos de vidrio de entrar en la pipeta. </li><li> Uso de la llama de propano, quemar los bordes restantes de la burbuja y de fuego-pula los lados de la ventana abierta. Tenga cuidado de no derretir el eje de la pipeta. </li><li> Con un lápiz con punta de diamante, anotar el extremo cónico de la pipeta aproximadamente 1.25 in (30 mm) de la ventana y rompa la puntacon pinzas de manera que la abertura de la pipeta se corta limpiamente (pipetas de descarte con puntas rotas o irregulares). </li><li> El uso de pinzas y el borde de una llama de un mechero de alcohol, doblar la parte estrecha de la pipeta en 0.375 (9,5 mm) de la punta a un ángulo de aproximadamente 60 ° de modo que la parte doblada es en un plano vertical cuando la abertura de la ventana está en la posición 1:00 para el uso diestro y 11:00 para el uso de la mano izquierda. Este paso se lleva a cabo mejor en un recinto sin corrientes de aire. </li><li> Fuego-pule la punta utilizando la llama de alcohol con un microscopio de disección. Asegúrese de no cerrar la punta sino más bien mantener la abertura redonda y lisa sin ninguna constricción. </li><li> Corte un 1 en (25 mm) tubo de goma, rociar el trozo de tubo con etanol al 70%, y deslice el tubo sobre el eje de la pipeta hasta que la abertura de la ventana esté completamente cubierto. Esto funciona como el &quot;diafragma&quot; de la pipeta de Spemann. </li><li> Coloque una bombilla ml látex de caucho 2sobre la parte inferior abierta de la pipeta. El bulbo mantiene la presión negativa en la pipeta de Spemann. </li><li> Para practicar el uso de una pipeta de Spemann, transferir perlas de cromatografía de alrededor de 100-200 m de diámetro a partir de una mancha marcada en una placa de Petri a una mancha marcada en otro bajo un microscopio. </li><li> Para limpiar la pipeta Spemann, retire la tapa de goma y el lugar de la pipeta, la punta hacia abajo, en un vaso alto forrada con algodón o gasa en el fondo y llena de agua destilada y detergente cristalería. </li></ol> 3. Esterilizar e incubar los huevos <ol><li> Limpie los huevos con etanol al 70% y colocar los huevos en bandejas de huevos de plástico. </li><li> Establecer los huevos en una incubadora calentada a 37,5 º C y 85-87%. </li><li> Incubar los huevos hasta que alcancen HH9.5, aproximadamente 26 horas para la codorniz y 48 horas para el pato. </li></ol> 4. Ventana Huevos <ol><li> Retirar una pequeña pieza de la carcasa exterior de la parte superior del huevo con unas pinzas, teniendo cuidado de no perforar la cáscara interior membrane. </li><li> Utilizando una jeringa con una aguja de 18 G de 1 pulgada, hacer un agujero en la punta más estrecha del huevo y retirar aproximadamente 1-2 ml de albúmina. </li><li> Coloque cinta adhesiva transparente sobre el agujero y la marca de punción en la cáscara. </li><li> Corte una &quot;ventana&quot; a lo largo de la superficie superior del huevo (a través de la cinta transparente) con unas tijeras curvas. </li></ol> 5. Visualice embriones y prepararse para la cirugía <ol><li> Utilizando una varilla de vidrio, cepillar suavemente una pequeña cantidad de rojo neutro (0,02 g / ml en BSS de Hank) sobre el embrión. </li><li> Cortar la membrana vitelina y tire de ella sobre el embrión utilizando una aguja de tungsteno llama afilada. </li><li> Vuelva a sellar el huevo mediante la colocación de cinta adhesiva transparente sobre la ventana. </li></ol> 6. Separe el tejido donante del embrión del Donante <ol><li> Retire la cinta de la ventana en el huevo del embrión donante. </li><li> Para cortar el pliegue neural del ectodermo adyacente del embrión donante, hacer ranuras en ambos sidES del tubo neural, utilizando una aguja de tungsteno de llama-afilado (fabricado como se describe anteriormente). </li><li> Luego, cortar a través del tubo neural en los planos anterior y posterior deseadas del injerto y separar el injerto del resto del tubo neural. </li><li> Retire el pliegue neural del embrión donante utilizando una pipeta de Spemann u otro tipo de micropipeta. </li><li> A continuación, retire el adhesivo de la ventana en el huevo de acogida y utilizar la pipeta Spemann colocar el pliegue neural donante junto con el embrión de acogida junto a la zona del tubo neural que recibirá el trasplante. </li></ol> 7. Separe el tejido del huésped y el trasplante de tejido del donante <ol><li> Separar el pliegue neural del tubo neural del embrión de acogida, como se hizo con el donante. Tenga cuidado de eliminar un injerto de igual tamaño que el tejido del donante. </li><li> Empuje suavemente este tejido huésped lejos del embrión. </li><li> Luego, con una aguja de tungsteno romo o la punta redondeada de un micropipette, mueva suavemente el neural donante doblez en el tubo neural de acogida, el mantenimiento de las orientaciones antero-posterior y dorso-ventral adecuadas. Asegúrese de que el injerto está escondido en lo largo de los lados, pero asegúrese de no meter o daño a los tejidos subyacentes. Para ayudar a mantener un seguimiento de la nota de la orientación del original cualquier asimetría en el tejido de un donante o de tinción diferencial de la Red Neutral. También foto-documento el embrión donante con el tejido extirpado acompaña, así como la quimera inmediatamente después de la cirugía. </li><li> La solución salina estéril se debe añadir al huevo si el embrión de acogida muestra signos de desecación. </li><li> Ahora, con cuidado volver a sellar y etiquetar el huevo, y suavemente volver a una incubadora de una alta humedad (70-80%), donde el embrión quimérico puede desarrollar a la etapa deseada para su análisis. </li></ol> 8. Colección de quimeras <ol><li> Asegúrese de recoger los embriones quiméricos en recién hecha fijador frío de Serra y colocar inmediatamente en un rocker a 4 ° C para una fijación O / N. Esto permitirá una detección más sensible de células de codorniz con el anticuerpo anti-codorniz. </li><li> Para los análisis de la expresión génica a través de RT-qPCR, congelar embriones directamente en nitrógeno líquido antes de la extracción de ARN. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La cresta neural es una población transitoria de células embrionarias que migra ampliamente en todo el embrión y se diferencia en diversos tipos de células, incluyendo condrocitos y osteoblastos, que contribuyen al esqueleto craneofacial. El trasplante de la cresta neural en el sistema quimérico codorniz-duck ha contribuido en gran medida a nuestra comprensión de las interacciones de tejidos y vías de señalización que regulan el desarrollo del esqueleto craneofacial. Sin embargo, dado el vasto potencial de la cresta neural para generar también las células del músculo liso, adipocitos, melanocitos, células de Schwann, y las neuronas, el sistema quimera codorniz pato tiene un tremendo potencial para futuras aplicaciones, en particular en combinación con el rápido avance de la biología de células madre y la medicina regenerativa. Desde la codorniz y pato son ambas especies criados comercialmente, un suministro de huevos fertilizados relativamente baratos está disponible de una variedad de granjas. Por lo tanto, esta técnica debe ser accesible a researcde ella opera dentro de una amplia gama de presupuestos y el espacio del establecimiento. Aunque esta técnica es muy poderosa, aún quedan varias limitaciones. Al igual que otras técnicas quirúrgicas, la calidad y la viabilidad de las quimeras de codorniz-pato se basan en las habilidades quirúrgicas del investigador, y por lo tanto, habrá mayor variación inter e intra-individual entre los experimentos en comparación con otros modelos, como los que utilizan el ratón genética. Por otra parte, también hay variación en las tasas de desarrollo y etapas de embriones individuales que contribuye a la reproducibilidad y el éxito de cada trasplante. Embriones de aves son también muy susceptibles a la deshidratación y por lo tanto los pasos críticos durante la cirugía incluyen mantener los niveles de luz baja, el tiempo bajo el microscopio a un mínimo, los huevos sellados con cinta tanto como sea posible, y alta humedad en la incubadora después de la operación a evitar la desecación. En cuanto a la viabilidad de las quimeras, usually entre 50-75% sobreviven, aunque estos porcentajes pueden disminuir cuanto mayor la etapa de recolección. En una típica sesión de 4-6 horas de la cirugía, un cirujano experimentado puede generar 10-15 quimeras. El éxito de los trasplantes también depende en gran medida de la calidad de las herramientas. Las buenas herramientas conducen a resultados más consistentes y reproducibles. El uso de un soplete de propano para que las agujas de tungsteno permite agujas muy afiladas para hacerse. El tipo de la antorcha utilizada hace una gran diferencia, ya que controla el tamaño de la llama. Afilar electrolítico también se puede utilizar, pero este enfoque no llega siquiera a acercarse a la producción de agujas como agudo. Utilice barras de tungsteno en vez de alambre de la cola de impresión de manera que las agujas pueden ser enderezados. La micropipeta Spemann, mientras que consume mucho tiempo y es difícil de hacer, es un instrumento ideal para la transferencia de tejido. La pipeta se puede personalizar con diferentes tamaños de aberturas, y se puede utilizar en varias ocasiones. Un factor crítico para usinGA Spemann micropipeta es tener algo de líquido en la pipeta antes de tocar la punta a la superficie del embrión. Parte del líquido siempre fluirá a cabo cuando se hace contacto con el menisco sobre el embrión. Al pulsar sobre el diafragma permite que el tejido fluido y el injerto sea expulsada con gran precisión, mientras que un poco dejando que el diafragma hacia arriba chupa suavemente el donante de tejido de injerto en la pipeta. El mantenimiento de un poco de presión positiva en el diafragma mantiene el tejido del injerto del donante en la punta de la pipeta durante la transferencia, y un poco de presión adicional sobre la membrana permite que el tejido del injerto donante para ser colocado deliberadamente en el huésped. Para la protección de la pipeta Spemann durante el almacenamiento y la esterilización, retire la bombilla del extremo ancho e inserte con cuidado la punta cónica en el bulbo. Coloque la pipeta Spemann en un tubo de ensayo de vidrio, cubrir la parte superior con papel de aluminio, y el autoclave antes de la cirugía. Después de varias pipetas son ready a esterilizar de nuevo para la cirugía, invertir las pipetas, calentar ellos casi a ebullición en la misma solución de agua destilada y detergente artículos de vidrio, y luego enjuagar varias veces con agua destilada. Pipetas Autoclave en sus tubos individuales. El tubo de goma que forma el diafragma y la pera de goma debe ser reemplazado después de varias esterilizaciones o cuando se convierten oscurecida y rígido. Muchos de los componentes de este protocolo involucran equipo peligroso. Por ejemplo, el procedimiento para hacer una Spemann Micropipeta implica tres tipos de llamas, así como calefacción, tirando, soplado, de flexión, corte y pulido de vidrio. Por lo tanto, el uso de equipo de protección personal (PPE), que aumenta la seguridad, tales como gafas y una bata de laboratorio es crítica. Además, debido a que muchas personas sufren de, o tienen el potencial de desarrollarse, alergia al huevo, siempre use guantes al manipular los huevos. Con estas precauciones en mente, el sistema quimérico codorniz pato iSA método seguro, eficaz, y relativamente accesible que tiene muchas aplicaciones futuras.

El esqueleto facial se desarrolla a partir del crecimiento y fusión de múltiples procesos faciales que se componen de la cresta neural y el mesénquima mesodérmico rodeado por ectodérmico y endodérmico 1-11 capas epiteliales. Eventos morfogenéticos dentro de cada proceso se rigen por las interacciones de señalización claras entre el mesénquima y el epitelio que rodean 12-16. Las alteraciones en estas interacciones de señalización y / o de sus efectores contribuyen a fenotipos de la enfermedad y también pueden ser relevantes para la evolución del esqueleto craneofacial 17, 18. Por lo tanto, dilucidar el momento y la naturaleza de las interacciones de tejidos tiene un gran potencial para aumentar nuestra comprensión de la biología del desarrollo y la evolución del esqueleto facial. El uso de embriones quiméricos para investigar las interacciones de tejidos tiene una larga historia en la biología del desarrollo. Este enfoque fue iniciado por Hans Spemann y su laboratorioquien descubrió embrionarias &quot;organizadores&quot; mediante el trasplante de tejidos entre los embriones de diferentes especies de anfibios. Spemann fue un maestro de las técnicas micro-quirúrgicas cuya mano-skills se complementa con su desarrollo de herramientas especializadas, en particular la pipeta Spemann. Viktor hamburguesa era un estudiante graduado en el laboratorio de Hans Spemann en Friburgo durante la década de 1920, que es cuando se llevaron a cabo los experimentos de trasplante originales que llevaron al Premio Nobel de Spemann. Cuando la hamburguesa se ​​trasladó a la Universidad de Washington en St. Louis en 1935, detalló el proceso de hacer una micropipeta Spemann en su Manual de Embriología Experimental 19. Dibujó Noden era un estudiante graduado en el laboratorio de la hamburguesa en la Universidad de Washington hasta 1972. Después de trasladarse a la Universidad de Massachusetts, Amherst y luego a la Universidad de Cornell, Noden continuó la fabricación y el uso de micropipetas Spemann por sus trasplantes quirúrgicos que implican quimeras de codorniz-pollo. Y# 160;. Mientras que un estudiante de posgrado, uno de los autores (Rich Schneider) capacitados con dibujó Noden en Cornell 1995-1998 El siguiente protocolo para la toma de una micropipeta Spemann se basa en descripciones escritas por la hamburguesa y Noden, e incluye modificaciones posteriores efectuadas por Schneider. El uso de quimeras de codorniz-chick para el estudio del desarrollo craneofacial y, especialmente, para la comprensión de la contribución de las células de la cresta neural fue iniciado por Noden y por Le Douarin a principios de 1970, revisado en Le Douarin et al 20. Este enfoque ha sido ampliamente adoptado en muchos estudios y por numerosos otros investigadores 1, 4, 5, 21-38. Las tasas equivalentes de crecimiento y morfología de codorniz y pollo hacen trasplantes dentro de ellas ideales para el estudio del destino de la célula y el rastreo de linaje. Sin embargo, debido a las similitudes entre la codorniz y de pollo, cambios morfológicos indUCED por las células del donante son difíciles de descifrar. Por el contrario, otros sistemas quiméricos aviar han incluido pato doméstico como una forma de estudiar los mecanismos que hacen que los embriones anatómicamente distinto 39-50. Más específicamente, el sistema quimérico codorniz-duck ofrece múltiples beneficios para discernir los efectos del donante en el host, y viceversa. En primer lugar, codorniz y pato embriones son diferentes en tamaño y forma del cuerpo, lo que proporciona una forma directa para explorar por donantes o mecanismos de acogida específicos de la formación de patrones ensayando dominios diferenciales de la expresión de genes (Figuras 1 A y B). En segundo lugar, codorniz y pato embriones tienen considerablemente diferentes ritmos de maduración, con la codorniz de incubación en 17 días y el pato de la eclosión en 28 días. Cresta neural trasplantado mantiene su tasa de maduración intrínseca dentro del entorno de acogida, y por lo tanto, es posible la identificación de los cambios temporales en la expresión génica, interacciones tisulares, histogénesis, y la morfogénesis51-57. Finalmente, el anticuerpo anti-nucleares de codorniz (Q ¢ PN) permite donantes y beneficiarios contribuciones celulares estar permanentemente distinguen entre sí mediante el reconocimiento de una proteína que se expresa de forma ubicua en las células de codorniz, pero ausente en las células de pato.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>TEK</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s BSS w/o phenol red</td><td>Invitrogen</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Red</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4638-5G</td><td>0.22 &amp;micro;m filter-sterilized</td></tr><tr><td>18 G Needles</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>5 ml syringe</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Dumont forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Straight Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Curved Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Spemann Pipette</td><td></td><td></td><td>Hand-made in lab</td></tr><tr><td>Egg Holder</td><td></td><td></td><td>Glass ashtray and modeling clay</td></tr><tr><td>Alcohol Burner</td><td>Fisher</td><td>04-245-1</td><td></td></tr><tr><td>Transparent Tape</td><td>3M Scotch</td><td>600</td><td></td></tr><tr><td>Glass Stirring Rod</td><td>Fisher</td><td>11-380C</td><td>Tip is narrowed and rounded using a flame</td></tr><tr><td>Tungston wire (0.004 x 3 inches)</td><td>A-M Systems</td><td>7190</td><td>Tip is flame-sharpened in a propane torch</td></tr><tr><td>Bunsun Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>S49117</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>22-183-632</td><td>9-inch (229 mm)</td></tr><tr><td>Rubber Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-178C</td><td>amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 in/1.6 mm; O.D.: 0.375 in/9.5 mm; I.D.: 0.25 in/6.4 mm</td></tr><tr><td>Propane Fuel Cylinder</td><td>BernzOmatic</td><td>UL2317</td><td>TX-9 with torch style &quot;A&quot; with a screw-on brass &quot;pencil flame&quot; torch</td></tr><tr><td>Diamond Point Pencil</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-268912</td><td></td></tr><tr><td>Rubber Bulbs</td><td>Fisherbrand</td><td>S32325</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras

La generación de embriones quiméricos es un enfoque amplio y de gran alcance para el estudio de células destinos, las interacciones de tejidos y especies específicas contribuciones al histológico y el desarrollo morfológico de los embriones de vertebrados. En particular, el uso de embriones quiméricos ha establecido la importancia de la cresta neural en la dirección de la morfología específica de la especie del complejo craneofacial. El método descrito en este documento utiliza dos especies de aves, pato y codorniz, con notable diferente morfología craneofacial. Este método facilita en gran medida la investigación de la regulación molecular y celular del patrón específico de la especie en el complejo craneofacial. Los experimentos en embriones de codorniz y pato quiméricos ya han puesto de manifiesto las interacciones de tejido de la cresta neural mediada y comportamientos células autónomas que regulan el patrón específico de la especie en el esqueleto craneofacial, musculatura, y tegumento. La gran diversidad de derivados de la cresta neural sugiere un potencial significativopara futuras aplicaciones de la codorniz-duck sistema quimérico para entender el desarrollo de vertebrados, la enfermedad y la evolución.

Antes de su posterior análisis, la eficacia del trasplante necesita ser ensayada. Para histológico, la expresión morfológica, o el gen de análisis de muestras de tejido, células de codorniz deben ser detectados por inmunohistoquímica usando anticuerpo Q ¢ PN como se describe 36. Para los análisis de ARN, especies específicas de las contribuciones a los tejidos de interés se pueden calcular utilizando una estrategia basada en PCR 58. Después de la eficacia del trasplante ha sido validado, otras medidas de resultado morfológicas o moleculares pueden ser evaluados en quimeras. Las interacciones entre las células de la cresta neural donantes y tejidos derivados del huésped circundantes que subyacen histogénesis y la morfogénesis del complejo craneofacial adecuado previamente se han estudiado ampliamente. En particular, mesénquima de la cresta neural dirige la morfología específica de las especies de la cara 7, 13, 51, 59, modelo de la pluma 52, patrón de músculo 56 </s<html> arriba&gt; y cartílago 53, 57 a través de la regulación de la expresión génica de acogida. Por ejemplo, el mesénquima de la cresta neural dicta cuando se forma el hueso en la mandíbula por la regulación temporal Bmp4 expresión 55. Recientemente, las investigaciones se han centrado en las interacciones de tejidos que ocurren muy temprano en el desarrollo craneofacial. A este respecto, los experimentos que utilizan quimeras de codorniz-pato han demostrado embriones de acogida influyen en la migración de la cresta neural mediante la determinación de los límites morfológicos. Es decir, en los embriones quiméricos Quck, codorniz donante las células de la cresta neural migran hacia el host mandibular pato arco en un patrón de pato (Figura 1D). A pesar de esta contribución de acogida para el tamaño de la población de la cresta neural, de la cresta neural de donantes continúa generando un esqueleto mandibular que es-codorniz como en tamaño y forma (Figura 1E). e 1 &quot;fo: content-width =&quot; 6 pulgadas &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Quail-Duck Sistema quimérico. (A) codorniz y (B) cráneos de pato muestran diferencias considerables en tamaño y forma, y por lo tanto, son ideales para el uso de un sistema quimérico para estudiar el desarrollo craneofacial (modificado a partir de Tokia et al. 56). (C) Diseño experimental para generar unilaterales embriones quiméricos Quck de codorniz HH9.5 etapa de concordancia y embriones de pato. El pliegue neural se elimina de un lado de embriones de codorniz y trasplantado en embriones de pato después de una pieza equivalente del pliegue neural se ha eliminado. (D) células donantes de codorniz (verde) puede ser seguido en quimeras utilizando un anticuerpo anti-codorniz (Q ¢ PN) como se muestra en vista ventral de HH12 embrión quimérico. (F) En mandíbulas Quck en HH38, la codorniz donante deriva-Meckel7; s cartílago es más corto y más recto que la observada para el pato cartílago contralateral derivada del huésped de Meckel, que es más grande y curvada. Reproducido Tokita et al., Dev.. . Bio 306, 377 (2007) con permiso de Elsevier.

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Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

En este artículo se describe un método para generar embriones quiméricos que están diseñados para poner a prueba las contribuciones específicas de las especies de la cresta neural y / u otros tejidos para el desarrollo craneofacial.

Evaluar Aportes específicos de la especie para el desarrollo craneofacial Utilizando quimeras Quail-pato

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

assessing-species-specific-contributions-to-craniofacial-development

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K vistas.  University of California at San Francisco.  En este artículo se describe un método para generar embriones quiméricos que están diseñados para poner a prueba las contribuciones específicas de las especies de la cresta neural y / u otros tejidos para el desarrollo craneofacial. 

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Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. Patterning of the Meckel&#39;s cartilage, a first pharyngeal arch derivative, involves the migration of cranial neural crest (CNC) cells and the progressive partitioning, proliferation and organization of differentiated chondrocytes. Several studies have described CNC migration during lower jaw&#160;morphogenesis, but the details of how the chondrocytes achieve organization in the growth and extension of Meckel&#8217;s cartilage remains unclear. The sox10 restricted and chemically induced Cre recombinase-mediated recombination generates permutations of distinct fluorescent proteins (RFP, YFP and CFP), thereby creating a multi-spectral labeling of progenitor cells and their progeny, reflecting distinct clonal populations. Using confocal time-lapse photography, it is possible to observe the chondrocytes behavior during the development of the zebrafish Meckel&#8217;s cartilage.
Multispectral cell labeling enables scientists to demonstrate extension of the Meckel&#8217;s chondrocytes.&#160;During extension phase of the Meckel&#8217;s cartilage, which prefigures the mandible, chondrocytes intercalate to effect extension as they stack in an organized single-cell layered row. Failure of this organized intercalating process to mediate cell extension provides the cellular mechanistic explanation for hypoplastic mandible that we observe in mandibular malformations.

Cell organization of craniofacial bones has long been hypothesized but never directly visualized. Multi-spectral cell labeling and in vivo live imaging allows visualization of dynamic cell behavior in zebrafish lower jaw. Here, we detail the protocol to manipulate Zebrabow transgenic fish and directly observe cell intercalation and morphological changes of chondrocytes in the Meckel&#8217;s cartilage.

Visualización de condrocitos Intercalación y direccional proliferación a través de análisis celular clonal Zebrabow en el cartílago de la embrionaria Meckel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. Chimeric avian embryos, in which quail donor tissue is transplanted into a chick embryo in ovo, combine the power of indelible genetic labeling of cell populations with the ease of manipulation presented by the avian embryo.
Quail-chick chimeras are a classical tool for tracing migratory neural crest cells (NCCs)1-3. NCCs are a transient migratory population of cells in the embryo, which originate in the dorsal region of the developing neural tube4. They undergo an epithelial to mesenchymal transition and subsequently migrate to other regions of the embryo, where they differentiate into various cell types including cartilage5-13, melanocytes11,14-20, neurons and glia21-32. NCCs are multipotent, and their ultimate fate is influenced by 1) the region of the neural tube in which they originate along the rostro-caudal axis of the embryo11,33-37, 2) signals from neighboring cells as they migrate38-44, and 3) the microenvironment of their ultimate destination within the embryo45,46. Tracing these cells from their point of origin at the neural tube, to their final position and fate within the embryo, provides important insight into the developmental processes that regulate patterning and organogenesis.
Transplantation of complementary regions of donor neural tube (homotopic grafting) or different regions of donor neural tube (heterotopic grafting) can reveal differences in pre-specification of NCCs along the rostro-caudal axis2,47. This technique can be further adapted to transplant a unilateral compartment of the neural tube, such that one side is derived from donor tissue, and the contralateral side remains unperturbed in the host embryo, yielding an internal control within the same sample2,47. It can also be adapted for transplantation of brain segments in later embryos, after HH10, when the anterior neural tube has closed47.
Here we report techniques for generating quail-chick chimeras via neural tube transplantation, which allow for tracing of migratory NCCs derived from a discrete segment of the neural tube. Species-specific labeling of the donor-derived cells with the quail-specific QCPN antibody48-56 allows the researcher to distinguish donor and host cells at the experimental end point. This technique is straightforward, inexpensive, and has many applications, including fate-mapping, cell lineage tracing, and identifying pre-patterning events along the rostro-caudal axis45. Because of the ease of access to the avian embryo, the quail-chick graft technique may be combined with other manipulations, including but not limited to lens ablation40, injection of inhibitory molecules57,58, or genetic manipulation via electroporation of expression plasmids59-61, to identify the response of particular migratory streams of NCCs to perturbations in the embryo's developmental program. Furthermore, this grafting technique may also be used to generate other interspecific chimeric embryos such as quail-duck chimeras to study NCC contribution to craniofacial morphogenesis, or mouse-chick chimeras to combine the power of mouse genetics with the ease of manipulation of the avian embryo.62

An approach for analyzing migration and eventual fate of avian neural crest cells in quail-chick chimeric embryos is described. This method is a simple and straightforward technique for tracing neural crest cells during migration and differentiation that are otherwise difficult to distinguish within an unmanipulated chick embryo.

Análisis de la migración de la cresta neural y la diferenciación de las especies cruzadas Trasplante

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

Neurociencias

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the formation of quail-chicken chimeras and the use of the chorioallantoic membrane (CAM) to sustain the development of ectopic tissues date back to the last century. Nowadays, the combination of these classical techniques with recent in vitro methodologies offers novel prospects to further explore organ formation.
Here we describe a two-step approach to study early- and late-stages of organogenesis. Briefly, the embryonic region containing the presumptive territory of the organ is isolated from quail embryos and grown in vitro in an organotypic system (up to 48 h). Cultured tissues are subsequently grafted onto the CAM of a chicken embryo. After 10 days of in ovo development, fully formed organs are obtained from grafted tissues. This method also allows the modulation of signaling pathways by the regular administration of pharmacological agents and tissue genetic manipulation throughout in vitro and in ovo developmental steps. Additionally, developing tissues can be collected at any time-window to analyze their gene-expression profile (using quantitative PCR (qPCR), microarrays, etc.) and morphology (assessed with conventional histology and immunochemistry).
The described experimental procedure can be used as a tool to follow organ formation outside the avian embryo, from the early stages of organogenesis to fully formed and functional organs.

This article provides an updated approach to the classical quail-chicken chimera system to study organ formation, by combining novel in vitro and in ovo experimental procedures.

Enfoque de dos pasos para explorar y finales-inicios de la formación de órganos en el modelo aviar: el timo y glándulas paratiroides organogénesis paradigma

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed contributions to unveiling key processes in developmental biology.
Herein is described an optimized method to isolate embryonic tissues from quail and chickens by microsurgery and enzymatic digestion while preserving its biological properties. After isolation, tissues from both species are associated in an in vitro organotypic assay for 48 h. Quail and chicken tissues can be discriminated by distinct nuclear features and molecular markers allowing the study of the cellular cross-talk between heterospecific association of tissues. This approach is, therefore, a useful tool for studying complex tissue interactions in developmental processes with highly dynamic spatial modifications, such as those occurring during pharyngeal morphogenesis and the formation of the foregut endoderm-derived organs. This experimental approach was first developed to study the epithelial-mesenchymal interactions during early-stages of thymus formation. In this, the endoderm-derived prospective thymic rudiment and mesoderm-derived mesenchyme, were isolated from quail and chicken embryos, respectively.
The capacity of the associated tissues to generate organs can be further tested by grafting them onto the chorioallantoic membrane (CAM) of a chicken embryo. The CAM provides nutrients and allows gas exchanges to the explanted tissues. After 10 days of in ovo development, the chimeric organs can be analyzed in the harvested explants by conventional morphological methods. This procedure also allows studying tissue-specific contributions during organ formation, from its initial development (in vitro development) to the final stages of organogenesis (in ovo development).
Finally, the improved isolation method also provides three-dimensionally (3D) preserved embryonic tissues, that can also be used for high-resolution topographical analysis of tissue-specific gene-expression patterns.

This article provides a method to isolate pure embryonic tissues from quail and chicken embryos that can be combined to form ex vivo chimeric organs.

Aislamiento de los tejidos embrionarios y formación de órganos quiméricas pollo codorniz utilizando el ejemplo de timo

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the strengths of this model system is that the effect of, and interaction among, tissues can be directly assessed in chimeric embryos. We have previously shown that signals from the forebrain contribute to facial morphogenesis by regulating the shape of the expression domain of Sonic hedgehog (SHH) in the Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ). In this article, the method of generating the forebrain chimeras and provide illustrations of the outcomes of these experiments is described.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of basal forebrain&#160;during craniofacial development.

Creación de quimeras del cerebro anterior aviar para evaluar el desarrollo facial

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

A Label-free Xenograft Model for Investigating the Behavior of Human Stem Cell Spheroids in Chick Embryos

Xenografts are valuable methods to investigate the behavior of human cells in vivo. In particular, the embryonic environment provides cues for cell migration, differentiation, and morphogenesis, with unique instructive signals and germ layer identity that are often absent from adult xenograft models. In addition, embryonic models cannot discriminate self versus non-self tissues, eliminating the risk of rejection of the graft and the need for immune suppression of the host. This paper presents a methodology for transplantation of spheroids of human cells into chicken embryos, which are accessible, amenable to manipulation, and develop at 37 &#176;C. 
Spheroids allow the selection of a specific region of the embryo for transplantation. After being grafted, the cells become integrated into the host tissue, allowing the follow-up of their migration, growth, and differentiation. This model is flexible enough to allow the utilization of different adherent populations, including heterogeneous primary cell populations and cancer cells. To circumvent the need for prior cell labeling, a protocol for the identification of donor cells through hybridization of human-specific Alu probes is also described, which is particularly important when investigating heterogeneous cell populations. Furthermore, DNA probes can be easily adapted to identify other donor species. This protocol will describe the general methods for preparing spheroids, grafting into chicken embryos, fixing and processing tissue for paraffin sectioning, and finally identifying the human cells using DNA in situ hybridization. Suggested controls, examples of interpretation of results and various cell behaviors that can be assayed will be discussed in addition to the limitations of this method.

Here, we describe a method to transplant and identify human cell spheroids into chick embryos. This xenograft model uses the embryonic microenvironment as a source of instructive signals to assay cell migration, differentiation, and tropism and is especially suited for the study of primary and/or heterogeneous cell populations.

Xenografts are valuable methods to investigate the behavior of human cells in vivo. In particular, the embryonic environment provides cues for cell ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

La evaluación de las propiedades de señalización de ectodérmica epitelio durante el desarrollo craneofacial

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Biología

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Los trasplantes faciales en<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los embriones

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analizando Craneofacial en la morfogénesis de pez cebra Utilizando 4D Microscopía Confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and memory and learning4,5,6. As the only songbird with a sequenced genome, the zebra finch has great potential for use in developmental studies; however, the early stages of zebra finch development have not been well studied. Lack of research in zebra finch development can be attributed to the difficulty of dissecting the small egg and embryo. The following dissection method minimizes embryonic tissue damage, which allows for investigation of morphology and gene expression at all stages of embryonic development. This permits both bright field and fluorescence quality imaging of embryos, use in molecular procedures such as in situ hybridization (ISH), cell proliferation assays, and RNA extraction for quantitative assays such as quantitative real-time PCR (qtRT-PCR).&#160;This technique allows investigators to study early stages of development that were previously difficult to access.

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.

La disección y análisis de aguas abajo de Zebra Finch embriones en etapas tempranas del desarrollo

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...