Criando quimeras do prosencéfalo aviário para avaliar o desenvolvimento facial

Este método permite aos investigadores avaliar as interações teciduais entre o prosencéfalo basal e a face. A principal vantagem dessa técnica é que isola o prosencéfalo basal para avaliação e evita a contaminação com células da crista neural, o que confundiria a análise. A parte difícil desta técnica é a remoção do prosencéfalo do hospedeiro e a substituição pelo tecido doador.

Quem demonstrará o procedimento será Diane Hu, pesquisadora do laboratório do Dr. Ralph Marcucio. Para começar, prepare mídia DMEM com vermelho neutro, uma pipeta de transferência de vidro e tungstênio afiado. Usando uma seringa de 10 mililitros e uma agulha calibre 18, remova 0,5 mililitros de albumina da extremidade pontiaguda da casca do ovo.

Faça um pequeno furo em cima da concha usando a ponta da tesoura. Em seguida, coloque um pedaço de fita adesiva sobre o orifício e corte uma abertura circular para expor o embrião. Manchar o embrião com vermelho neutro.

Colher enxertos de tecido do lado esquerdo do prosencéfalo basal do estágio sete ou oito embriões. Use agulhas curvas de tungstênio afiadas para incisar suavemente um pedaço do prosencéfalo. Para não incluir a endoderme subjacente, deslize a agulha abaixo do prosencéfalo e paralela ao eixo do tubo neural.

Retirar o enxerto do embrião doador usando a pipeta de transferência de vidro e transferi-lo para DMEM contendo vermelho neutro por dois minutos para corá-lo. Em seguida, coloque o enxerto corado em DMEM que não contenha vermelho neutro até estar pronto para o enxerto. Incubar ovos fertilizados de frango branco Leghorn a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada até o estágio de Hamburger-Hamilton sete a oito.

Expor embriões conforme demonstrado anteriormente. Usando agulhas de tungstênio afiadas, prepare o local do enxerto cortando e, em seguida, removendo um pedaço de 0,3 por 0,2 milímetro do prosencéfalo basal para acomodar o enxerto. Evite a ruptura excessiva da endoderme subjacente, que será evidente à medida que os grânulos de gema começarão a vazar através de qualquer lágrima que for feita.

Após a transferência do enxerto para o hospedeiro, posicione-o para substituir o prosencéfalo basal extirpado do hospedeiro. Coloque a fita bem sobre o orifício e devolva os embriões à incubadora de 37 graus Celsius até que estejam prontos para análise. Inicialmente, as quimeras eram criadas a partir do transplante de tecidos de codornas em embriões de pintinhos.

Usando o anticorpo QCPN, as células de codorna foram visualizadas e distinguidas dos tecidos do hospedeiro. O sistema codorniz-pintinho confirmou que todo o enxerto era composto apenas por tecido neural e não estava contaminado com outros tipos celulares. O transplante de tecido de codorna em embriões de pato levou a quimeras severamente deformadas devido a um cérebro de codorna de desenvolvimento mais rápido.

Para tanto, foi realizado o transplante de tecidos de pato em embriões de galinha. As quimeras de pato-pintinho resultantes sugerem que o cérebro participa da regulação da morfologia. Hibridização de montanha inteira C2 foi usada para avaliar a expressão de ouriços Sonic em quimeras.

Semelhante à morfologia, a expressão do ouriço Sonic no lado do pato da quimera parecia mais parecida com pato. A preparação do site host exige prática. Um grande número de embriões não sobrevive, então criar um grande número de quimeras pode ajudar a garantir amostras adequadas para análise.

Este método permitiu avaliar como os sinais do cérebro moldam o domínio de expressão do ouriço Sonic na zona ectodérmica frontonasal.