Diese Arbeit wurde durch ein National Institute of Dental und kraniofaziale Forschung (NIDCR) F32-Stipendium (DE021929), um JLF und NIDCR R01 Zuschuss DE016402 RAS finanziert

1. Bereiten Tungsten Nadeln <ol><li> Schneiden Sie ein Wolframstab in die Hälfte mit Drahtschneider, so dass die Stange nicht verbiegt. </li><li> Fädeln Sie den Stab durch die sich verjüngende Ende einer 5 3/4 in Borosilikatglas Pasteur Pipette. </li><li> Wobei ungefähr 3/4 in der Stange ragte aus dem Glas haften die Stange in die Pipettenspitze mit einem kleinen Wulst &quot;Heißschmelzkleber&quot; (HMA), die für eine Klebepistole verwendet Klebestift ist. Die HMA sollte sich schnell in einem Alkohol-Flamme geschmolzen werden, kümmert sich nicht um den Kleber zu verbrennen und schwarzen Rauch erzeugen. </li><li> Mit einer Zange, biegen Sie die Spitze der Wolframstab (ca. 1/4 in der oberen Ende), bis ein Winkel von 45 ° erreicht wird. </li><li> Halten des Pasteur-Pipette, stellen etwa 1/8 in der Spitze des Wolframstabes in die Flamme eines Propanbrenners. Halten Sie die Spitze stabil und exakt senkrecht zur Flamme. </li><li> Ziehen Sie die Nadel aus der Flamme der Moment, eine winzige Spur von Orange tungszehn Fliegen von der Nadel. </li></ol> 2. Bereiten Spemann Pipetten <ol><li> Mit einem Bunsenbrenner erhitzen, das schmale Ende einer Pasteur-Pipette, bis das Glas kurz über die Verjüngung zu schmelzen beginnt. Vom Herd nehmen und ziehen Sie die Spitze, bis die Pipette wird abgedichtet. Achten Sie darauf, dass es bleibt ein Teil des konischen Teil, der einen Außendurchmesser von ca. 0,7 bis 1,0 mm aufweist. Brechen Sie das verschlossene Ende aus etwa 4 cm von der Verjüngung. </li><li> Befestigen etwa 2 Fuß (60 cm) Gummischlauch der breiten (offene) Ende der Pipette. Schlag auf das andere Ende des Gummischlauchs, um sicherzustellen, daß keine Luft durch den konischen Teil des Pasteur-Pipette passieren. </li><li> Verwendung eines Propanbrennstoffzylinder mit einem daran befestigten Stift Flammenbrenner, Wärme eine ovale Fläche auf einer Seite der Pipette gerade unterhalb dem Beginn der Verjüngung. Blasen Luft sehr leicht und ständig durch den Gummischlauch mit einem leichten Druck (ungefähr die Menge an Druck benötigt, um den Beginn der Lette sagenr &quot;P&quot; am Gespräch Ebene). Wenn das Glas weich wird auf der einen Seite und beginnt, nach außen wölben, die Pipette schnell zu entfernen, von der Flamme und blasen hart und stabil durch den Gummischlauch. Dadurch wird der beheizte Teil des Glases, eine wurstförmige Blase, die Pop-, das ist gut zu bilden. Wenn die Blase zu klein ist, versuchen Schmelzen und bläst das Glas wieder. Die endgültige offenen Fenster in dem Glas sollte etwa 0,25 in (6,35 mm) breit und 0,5 Zoll (12,7 mm) lang sein. </li><li> Zeige das verjüngte Ende nach oben, kratzen die Blase in eine Glasabfallbehälter während sanft weht durch den Schlauch zum Glasfragmente in die Pipette zu verhindern. </li><li> Mit der Propanflamme, verbrennen die übrigen Kanten der Blase und Feuerpolitur die Seiten der offenen Fenster. Achten Sie darauf, um die Welle der Pipette zu schmelzen. </li><li> Mit einer Diamantspitze Bleistift, punkten die verjüngte Ende der Pipette etwa 1,25 in (30 mm) aus dem Fenster und brechen Sie die Spitzemit einer Pinzette, so dass der Pipettenöffnung ist sauber geschnitten (Ablage Pipetten mit gebrochenen oder unebenen Spitzen). </li><li> Mit einer Pinzette und dem Rand einer Flamme aus einem Brenner Alkohol, beugen der schmale Abschnitt der Pipetten 0,375 in (9,5 mm) von der Spitze bis zu einem Winkel von etwa 60 °, so dass der gebogene Abschnitt in einer vertikalen Ebene, wenn die Fensteröffnung ist am 01.00 Position für Rechtshänder Nutzung und 11:00 Uhr für Linkshänder Nutzung. Dieser Schritt wird am besten in einem zugfreien Gehäuse durchgeführt. </li><li> Brandlack die Spitze mit der Alkoholflamme unter einem Binokular. Achten Sie darauf, nicht zu schließen, von der Spitze zu halten, sondern um die Öffnung und glatt, ohne Verengung. </li><li> Schneiden Sie eine 1 in (25 mm) Stück Gummischlauch, Spray der Schlauchstück mit 70% Ethanol, und schieben Sie den Schlauch über den Schaft der Pipette, bis die Fensteröffnung vollständig bedeckt ist. Dieser fungiert als &quot;Membran&quot; der Spemann-Pipette. </li><li> Legen Sie eine Latex-Gummi-Birne 2 mlüber den offenen Boden der Pipette. Die Lampe behält Unterdruck im Spemann Pipette. </li><li> Um der Praxis mit einem Spemann Pipette Chromatographie Perlen von rund 100 bis 200 um im Durchmesser von einer markierten Stelle in eine Petrischale zu einer markierten Stelle in einem anderen unter dem Mikroskop. </li><li> Zur Reinigung des Spemann-Pipette, entfernen Sie den Gummiball und Ort Pipette, Spitze nach unten, in ein hohes Becherglas mit Baumwolle oder Gaze am Boden ausgekleidet und mit destilliertem Wasser und Glasreinigungsmittel gefüllt. </li></ol> 3. Sterilisieren und Eier inkubieren <ol><li> Wischen Eier mit 70% Ethanol und die Eier auf Kunststoffeierablagen. </li><li> Stellen Sie Eier in einem Wärmeschrank bei 37,5 ° C und 85-87%. </li><li> Eier auszubrüten, bis sie HH9.5, ca. 26 h für Wachteln und 48 Stunden für die Ente zu erreichen. </li></ol> 4. Fenster Eier <ol><li> Entfernen Sie ein kleines Stück der Außenhülle von der Spitze des Eies mit einer Pinzette, kümmert sich nicht um die Innenschale m Punktionembrane. </li><li> Unter Verwendung einer Spritze mit einer 18 G um 1-Zoll-Nadel, stoßen ein Loch an der engsten Spitze des Ei-und zurücktreten etwa 1-2 ml Albumin. </li><li> Zeigen transparenten Klebeband über das Loch und Einstichstelle in der Schale. </li><li> Schneiden ein &quot;Fenster&quot; auf der oberen Oberfläche des Eies (durch das durchsichtige Band) mit einer gebogenen Schere. </li></ol> 5. Visualisieren Embryonen und Vorbereitung für Chirurgie <ol><li> Mit einem Glasstab, Pinsel vorsichtig eine kleine Menge von Neutral Rot (0,02 g / ml in Hanks BSS) über den Embryo. </li><li> Schneiden Sie die Dotterhaut und ziehen ihn über den Embryo mit einem flamm geschärft Wolfram-Nadel. </li><li> Neu abdichten das Ei, indem transparente Klebeband über dem Fenster. </li></ol> 6. Trennen Sie das Spendergewebe aus dem Spender Embryo <ol><li> Entfernen Band aus dem Fenster auf dem Ei des Spenderembryo. </li><li> Um die neuronalen Stall aus dem angrenzenden Ektoderm des Spenders Embryo abgeschnitten sind, müssen Schlitze auf beiden sidn des Neuralrohrs, mit einem Flamm geschärft Wolfram Nadel (hergestellt wie oben beschrieben). </li><li> Dann wird über das Neuralrohr Schnitt an der gewünschten vorderen und hinteren Stufen des Transplantats und trennen das Transplantat von dem Rest des Neuralrohrs. </li><li> Entfernen des neuronalen Falte vom Spender Embryo unter Verwendung entweder eines Spemann Pipette oder eine andere Art von Mikropipette. </li><li> Dann entfernen Sie das Klebeband aus dem Fenster auf dem Host-Ei und verwenden Sie den Spemann-Pipette, um die Spender neuronalen Falte neben dem Wirtsembryo angrenzend an den Bereich des Neuralrohrs, die die Transplantation erhalten, werden zu platzieren. </li></ol> 7. Trennen Sie den Host-Gewebetransplantation und das Spendergewebe <ol><li> Trenne die neuronale fache des Neuralrohrs der Wirtsembryo, wie bei dem Spender durchgeführt. Achten Sie auf ein Transplantat von gleicher Größe wie das Spendergewebe zu entfernen. </li><li> Schieben Sie dieses Wirtsgewebe weit weg von den Embryo. </li><li> Dann, mit einem stumpfen Wolfram-Nadel oder der abgerundeten Spitze eines micropipette, sanft bewegen die Geber neuronalen in die Wirts Neuralrohr falten, die Aufrechterhaltung der richtigen anterior-posterioren und dorso-ventralen Orientierungen. Stellen Sie sicher, das Transplantat in an den Seiten versteckt, aber sicher sein, nicht zu stoßen oder Schäden an den darunter liegenden Gewebe. Um den Überblick über die ursprüngliche Ausrichtung Vermerk jeder Asymmetrie in der Spendergewebe oder Differential-Färbung aus der Neutral Red. Wir photo Dokument der Spender Embryo mit den beigefügten geschnittene Gewebe sowie der Chimäre unmittelbar nach der Operation. </li><li> Sterile Kochsalzlösung ist zum Ei gegeben werden, wenn die Wirtsembryo Anzeichen von Austrocknung. </li><li> Nun wieder vorsichtig Dichtung und beschriften Sie das Ei, und sanft schicken Sie es an einer hohen Feuchtigkeit Inkubator (70-80%), wo die chimären Embryo kann auf die gewünschte Stufe für die Analyse zu entwickeln. </li></ol> 8. Sammlung von Chimären <ol><li> Achten Sie darauf, chimären Embryonen in frisch zubereitete kalte Serras Fixiermittel zu sammeln und sofort legen sie auf ein Ro-cker bei 4 ° C für eine O / N-Fixierung. Dies wird für mehr empfindlichen Nachweis von Wachtel-Zellen mit dem anti-Wachtel-Antikörper zu ermöglichen. </li><li> Für Genexpressionsanalysen mittels RT-qPCR, gefrier Embryonen in flüssigem Stickstoff direkt vor der RNA-Extraktion. </li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Neuralleiste ist eine vorübergehende embryonalen Zellpopulation, die ausgiebig wandert den ganzen Embryo und differenziert in verschiedene Zelltypen, einschließlich Chondrozyten und Osteoblasten, die auf der kraniofazialen Skeletts beitragen. Umpflanzen Neuralleiste in der Wachtel-Ente chimären System hat wesentlich zu unserem Verständnis der Gewebe-Wechselwirkungen und Signalwege, die Entwicklung des Schädel-Gesichtsskeletts regulieren beigetragen. , Angesichts der riesigen Potenzial der Neuralleiste zu erzeugen auch glatte Muskelzellen, Fettzellen, Melanozyten, Schwann-Zellen und Neuronen, die ein enormes Potenzial für zukünftige Anwendungen, insbesondere in Verbindung mit der schnellen Weiterentwicklung der Stammzellbiologie jedoch die Wachtel-Ente Chimärensystem und der regenerativen Medizin. Da Wachteln und Enten sind beide kommerziell gezüchtete Arten, ist ein Vorrat an relativ preiswert befruchteten Eier aus einer Vielzahl von landwirtschaftlichen Betrieben zur Verfügung. Daher sollte diese Technik zugänglich sein researcihr Betrieb in einem weiten Bereich von Budgets und Anlage Raum. Obwohl diese Technik ist sehr leistungsfähig, gibt es weiterhin einige Einschränkungen. Wie andere chirurgische Techniken, die Qualität und die Lebensfähigkeit der Wachtel-Ente Chimären setzen auf die chirurgischen Fähigkeiten des Forschers, und deshalb wird es mehr inter-und intraindividuelle Unterschiede zwischen den Experimenten im Vergleich zu anderen Modellen, wie diejenigen, die Verwendung der Maus sein Genetik. Darüber hinaus gibt es auch Variationen in den Entwicklungsgeschwindigkeiten und Phasen der einzelnen Embryonen, die sich auf die Reproduzierbarkeit und den Erfolg jedes Transplantat trägt. Vogelembryonen sind auch sehr anfällig für Austrocknung und damit wichtige Schritte während der Operation gehören die Einhaltung der Lichtspiegel niedrig, die Zeit unter dem Mikroskop auf ein Minimum, die Eier mit Klebeband so viel wie möglich versiegelt und hoher Luftfeuchtigkeit in der postoperativen Inkubator Austrocknung zu vermeiden. In Bezug auf die Lebensfähigkeit der Chimären, usually zwischen 50-75% überleben, obwohl diese Prozentsätze können je älter die Sammelphase zu verringern. In einem typischen 4-6 h Sitzung der Operation kann ein erfahrener Chirurg 10-15 Chimären zu erzeugen. Der Erfolg der Transplantation hängt auch stark von der Qualität der Werkzeuge. Gute Werkzeuge führen zu konsistenten, reproduzierbaren Ergebnissen. Mit einem Propangasbrenner Wolfram Nadeln machen können extrem scharfen Nadeln gemacht werden. Die Art der Fackel verwendet, macht einen großen Unterschied, weil es die Größe der Flamme kontrolliert. Elektrolyt Schärfen kann auch verwendet werden, aber dieser Ansatz noch nicht einmal nahe kommen Herstellung Nadeln scharf. Verwenden Wolframstäben statt gespult Draht, so daß die Nadeln gerade werden. Die Spemann Mikropipette, während zeitaufwendig und schwierig zu machen, ist ein ideales Instrument für die Gewebetransfer. Die Pipette kann mit verschieden großen Öffnungen angepasst werden, und kann wiederholt verwendet werden. Ein kritischer Faktor für usinga Spemann Mikropipette ist, etwas Flüssigkeit in die Pipette, bevor Sie mit der Spitze an der Oberfläche des Embryos haben. Ein Teil des Fluids immer fließen, wenn der Kontakt mit dem Meniskus über dem Embryo gemacht. Durch Drücken auf die Membran ermöglicht Fluid-und Transplantatgewebe sehr genau ausgestoßen werden, während leicht lassen sich auf der Membran saugt sanft das Spendertransplantat Gewebe in die Pipette. Aufrechterhalten etwas positiver Druck auf die Membran hält das Spendertransplantat Gewebe an der Pipettenspitze während der Übertragung, und ein wenig zusätzlichen Druck auf die Membran erlaubt dem Spendertransplantat Gewebe gezielt in den Host abgegeben werden. Zum Schutz der Spemann-Pipette während der Lagerung und Sterilisation, entfernen Sie die Lampe aus dem breiten Ende und sorgfältig legen Sie die konische Spitze in der Birne. Setzen Sie den Spemann-Pipette in einem Reagenzglas, decken Sie die Oberseite mit Aluminiumfolie und Autoklavieren vor der Operation. Nach mehreren Pipetten sind ready wieder für die Operation sterilisiert werden, kehren die Pipetten, erwärmen sie fast zum Kochen in der gleichen Lösung aus destilliertem Wasser und Glasreinigungsmittel, und dann wiederholt mit destilliertem Wasser spülen. Autoklav Pipetten in ihre einzelnen Rohre. Der Schlauch, der die Membran und Gummidichtung bildet sollte nach mehreren Sterilisationen ersetzt werden, oder wenn sie abgedunkelten und steif werden. Viele der Komponenten dieses Protokoll beinhalten gefährlichen Geräten. Zum Beispiel das Verfahren zur Herstellung einer Mikropipette Spemann beinhaltet drei Arten von Flammen sowie Heizung, Ziehen, Blasen, Biegen, Schneiden und Polieren von Glas. Daher tragen richtige persönliche Schutzausrüstung (PSA), die die Sicherheit erhöht, wie Schutzbrille und Laborkittel ist kritisch. Darüber hinaus, da viele Menschen leiden, oder haben das Potenzial, sich zu entwickeln, Ei Allergien, immer Handschuhe beim Umgang mit Eiern. Mit diesen Vorsichtsmaßnahmen beachten, die Wachtel-Ente chimären System isa sichere, effiziente und relativ zugängliche Methode, die viele zukünftige Anwendungen hat.

Der Gesichtsschädel entwickelt sich aus dem Wachstum und der Fusion von mehreren Gesichts Prozesse, die der Neuralleiste und mesodermalen Mesenchym von ektodermalen und endodermalen Epithelschichten 1-11 umgeben zusammengesetzt sind. Morphogenetischen Ereignisse innerhalb jedes Prozesses werden durch unterschiedliche Signal Wechselwirkungen zwischen dem Mesenchym und Umgebung Epithelien 12-16 geregelt. Änderungen dieser Signal Wechselwirkungen und / oder ihre Effektoren beitragen, Krankheitsphänotypen und kann auch relevant Entwicklung des kraniofazialen Skeletts 17, 18 sein. Daher Aufklärung der Zeitpunkt und die Art von Gewebe-Wechselwirkungen hat großes Potenzial, unser Verständnis von der Entwicklungs-und Evolutionsbiologie des Gesichtsschädels zu erhöhen. Die Verwendung von chimären Embryonen, Gewebe-Wechselwirkungen hat eine lange Geschichte in der Entwicklungsbiologie. Dieser Ansatz wurde von Hans Spemann und sein Labor Pionierdie embryonalen &quot;Organisatoren&quot; entdeckt durch die Transplantation von Gewebe zwischen Embryonen verschiedener Amphibienarten. Spemann war ein Meister der mikrochirurgischen Techniken, dessen Hand-Fähigkeiten wurden durch seine Entwicklung von Spezialwerkzeugen, insbesondere des Spemann-Pipette ergänzt. Viktor Hamburger war ein Doktorand im Labor von Hans Spemann in Freiburg in den 1920er Jahren, die, wenn die ursprünglichen Transplantation Experimente, die zu Spemann Nobelpreis geführt wurden durchgeführt ist. Beim Hamburger zog nach Washington University in St. Louis im Jahr 1935 detailliert er den Prozess der Herstellung eines Mikropipette Spemann in seinem Handbuch für Experimentelle Embryologie 19. Drew Noden war ein Student der Hamburger Labor an der Washington University, bis 1972. Nachdem er an die University of Massachusetts, Amherst und dann an der Cornell University, Noden weiterhin die Herstellung und Verwendung von Spemann Mikropipetten für seine chirurgische Transplantationen mit Wachtel-Küken Chimären. &amp;# 160;. Während ein Student, einer der Autoren (Rich Schneider) mit Drew Noden 1995-1998 Ausbildung an der Cornell Das folgende Protokoll für die Herstellung einer Mikropipette Spemann auf Beschreibungen von Hamburger und Noden geschrieben wurde, und schließt spätere Änderungen vorgenommen von Schneider. Die Verwendung von Wachtel-Küken Chimären für die Untersuchung der kraniofazialen Entwicklung und vor allem für das Verständnis der Beiträge der Neuralleistenzellen wurde von Noden und Le Douarin in den frühen 1970er Jahren Pionierarbeit geleistet, in Le Douarin et al 20 prüft. Dieser Ansatz wurde im Großen und Ganzen in vielen Studien und von zahlreichen anderen Forschern 1, 4, 5, 21-38 angenommen. Die entsprechenden Wachstumsraten und Morphologie von der Wachtel und Küken machen Transplantationen innerhalb sie ideal für die Untersuchung von Zellschicksals und Abstammung Verfolgung. Wegen der Ähnlichkeiten zwischen Wachtel und Küken, ind jedoch morphologische Veränderungenvon Spenderzellen uced sind schwer zu entziffern. Im Gegensatz dazu haben andere Vogel chimären Systeme Hausente als eine Möglichkeit, Mechanismen, die Embryonen anatomisch unterschiedliche 39-50 zu studieren enthalten. Genauer gesagt, bietet die Wachtel-Ente chimären System mehrere Vorteile für gehobene Ansprüche, die Auswirkungen des Spenders auf dem Host, und umgekehrt. Erstens sind die Wachtel und Entenembryonen in unterschiedlichen Körpergröße und-form, die einen direkten Weg, um Donor-oder Host-spezifische Mechanismen der Musterbildung durch Testen auf Differenz Domänen der Genexpression (Fig. 1 A und B) zu erkunden bietet. Zweitens, Wachtel-und Entenembryonen haben deutlich unterschiedliche Raten der Reifung mit Wachtelbrut in 17 Tagen und Entenbrut in 28 Tagen. Transplantierte Neuralleiste behält seine innere Reifung Rate innerhalb der Host-Umgebung, und somit ist die Identifikation der zeitlichen Veränderungen in der Genexpression, Gewebe-Wechselwirkungen, Histogenese und Morphogenese möglich51-57. Schließlich erlaubt die anti-Wachtelkern Antikörper (Q ¢ PN) Donor und zellulären Wirts Beiträge dauerhaft unterschieden werden voneinander durch Erkennen eines Proteins, die ubiquitär in Wachtel-Zellen exprimiert wird, aber außerhalb des Entenzellen.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>TEK</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s BSS w/o phenol red</td><td>Invitrogen</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Red</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4638-5G</td><td>0.22 &amp;micro;m filter-sterilized</td></tr><tr><td>18 G Needles</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>5 ml syringe</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Dumont forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Straight Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Curved Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Spemann Pipette</td><td></td><td></td><td>Hand-made in lab</td></tr><tr><td>Egg Holder</td><td></td><td></td><td>Glass ashtray and modeling clay</td></tr><tr><td>Alcohol Burner</td><td>Fisher</td><td>04-245-1</td><td></td></tr><tr><td>Transparent Tape</td><td>3M Scotch</td><td>600</td><td></td></tr><tr><td>Glass Stirring Rod</td><td>Fisher</td><td>11-380C</td><td>Tip is narrowed and rounded using a flame</td></tr><tr><td>Tungston wire (0.004 x 3 inches)</td><td>A-M Systems</td><td>7190</td><td>Tip is flame-sharpened in a propane torch</td></tr><tr><td>Bunsun Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>S49117</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>22-183-632</td><td>9-inch (229 mm)</td></tr><tr><td>Rubber Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-178C</td><td>amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 in/1.6 mm; O.D.: 0.375 in/9.5 mm; I.D.: 0.25 in/6.4 mm</td></tr><tr><td>Propane Fuel Cylinder</td><td>BernzOmatic</td><td>UL2317</td><td>TX-9 with torch style &quot;A&quot; with a screw-on brass &quot;pencil flame&quot; torch</td></tr><tr><td>Diamond Point Pencil</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-268912</td><td></td></tr><tr><td>Rubber Bulbs</td><td>Fisherbrand</td><td>S32325</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras

Die Erzeugung von Chimären-Embryonen ist eine weit verbreitete und leistungsfähige Ansatz zur Zellschicksale, Gewebe-Wechselwirkungen und Spezies-spezifische Beiträge zur histologischen und morphologischen Entwicklung von Wirbeltierembryonen zu studieren. Insbesondere ist die Verwendung von chimären Embryonen die Bedeutung Neuralleiste in die Leitung der artspezifischen Morphologie des kraniofazialen Komplex hergestellt. Das hier beschriebene Verfahren nutzt zwei Vogelarten, Enten und Wachteln, mit bemerkenswert unterschiedlichen Gesichtsschädelmorphologie. Dieses Verfahren erleichtert die Untersuchung von molekularen und zellulären Regulation der Spezies-spezifische Muster in der kraniofazialen Komplexes. Experimente in der Wachtel-und Enten chimären Embryonen bereits Neuralleiste-vermittelte Wechselwirkungen Gewebe und Zell-autonome Verhaltensweisen, die Spezies-spezifische Muster in der kraniofazialen Skelett, Muskulatur und Hautdecke regulieren enthüllt. Die große Vielfalt der Neuralleiste Derivate schlägt erhebliches Potenzialfür zukünftige Anwendungen der Wachtel-Ente chimären System zum Verständnis der Wirbeltierentwicklung, Krankheit und Evolution.

Vor der weiteren Auswertung muss die Effizienz der Transplantation untersucht werden. Für histologische Analysen morphologische, oder Gen-Expression auf Gewebeproben sollten Wachtelzellen durch Immunhistochemie mit Q ¢ PN Antikörper wie beschrieben 36 erkannt werden. Für die RNA-Analyse kann artspezifischen Beiträge Gewebe von Interesse unter Verwendung einer PCR-basierten Strategie 58 berechnet werden. Nachdem die Wirksamkeit der Transplantation bestätigt wurde, können weitere morphologische oder molekulare Endpunkte in Chimären ausgewertet werden. Wechselwirkungen zwischen den Geber Neuralleistenzellen und Umgebung Wirt stamm Gewebe, die richtige Histogenese und Morphogenese des kraniofazialen Komplex zugrunde liegen zuvor eingehend untersucht worden. Insbesondere Neuralleiste Mesenchym leitet Spezies-spezifische Morphologie des Gesichts 7, 13, 51, 59, 52 Feder-Muster-, Muskel-Muster 56 </s<html> bis&gt; und Knorpel 53, 57 durch die Regulierung der Genexpression Host. Zum Beispiel schreibt Neuralleiste Mesenchym wenn die Knochenformen im Unterkiefer durch zeitliche Regulierung Bmp4 Ausdruck 55. Kürzlich haben Untersuchungen an Gewebe-Wechselwirkungen sehr früh in der Entwicklung auftritt craniofacial zentriert. In diesem Zusammenhang Experimente nutzen Wachtel-Ente Chimären haben gezeigt, Host-Embryonen beeinflussen Neuralleiste Migration durch die Bestimmung morphologische Grenzen. Das heißt, in chimären quck Embryonen, in die Wirtsentenunterkiefer in eine Ente artiges Muster (Abbildung 1D) migrieren Spender Wachtel Neuralleistenzellen. Trotz dieser Host-Beitrag auf die Größe der Neuralleiste Bevölkerung, setzt der Spender Neuralleiste, eine Unterkiefer Skelett, Wachtel-wie in Größe und Form (1E) ist zu generieren. e 1 &quot;fo: content-width =&quot; 6in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Wachtel, Ente Chimäre-System. (A) und Wachtel (B) Ente Schädel zeigen erhebliche Unterschiede in Größe und Form, und somit ideal für die Verwendung eines chimären System kraniofazialen Entwicklung zu studieren geeignet (von Tokia et al. 56 modifiziert). (C) Experimentelles Design zur Erzeugung einseitige chimären quck Embryonen von Stufe abgestimmt HH9.5 Wachtel-und Entenembryonen. Das neuronale Falte von einer Seite der Wachtelembryos entnommen und in Entenembryonen transplantiert nach einem gleichwertigen Teil des neuronalen Falte entfernt wurde. (D) Quail Spenderzellen (grün) in Chimären unter Verwendung eines Anti-Antikörpers Wachtel (Q folgen ¢ PN), wie in der Bauchansicht HH12 chimären Embryo gezeigt. (F) In quck Mandibeln an HH38, die Wachtel Spender abgeleiteten Meckel7, s Knorpel kürzer und gerader als die kontralaterale Ente Wirt stamm Meckel-Knorpel, der größer und gekrümmte beobachtet. Nachdruck Tokita et al., Dev. Bio. 306, 377 (2007) mit Genehmigung von Elsevier.

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Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Chimären-Embryonen, die entworfen sind, um die Spezies-spezifische Beiträge der Neuralleiste und / oder anderen Geweben zu testen kraniofazialen Entwicklung zu generieren.

Die Beurteilung artspezifische Um Beiträge Craniofacial Entwicklung mit Wachtel-Ente Chimären

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

assessing-species-specific-contributions-to-craniofacial-development

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Aufrufe.  University of California at San Francisco.  Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Chimären-Embryonen, die entworfen sind, um die Spezies-spezifische Beiträge der Neuralleiste und / oder anderen Geweben zu testen kraniofazialen Entwicklung zu generieren. 

Serie: Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. Patterning of the Meckel&#39;s cartilage, a first pharyngeal arch derivative, involves the migration of cranial neural crest (CNC) cells and the progressive partitioning, proliferation and organization of differentiated chondrocytes. Several studies have described CNC migration during lower jaw&#160;morphogenesis, but the details of how the chondrocytes achieve organization in the growth and extension of Meckel&#8217;s cartilage remains unclear. The sox10 restricted and chemically induced Cre recombinase-mediated recombination generates permutations of distinct fluorescent proteins (RFP, YFP and CFP), thereby creating a multi-spectral labeling of progenitor cells and their progeny, reflecting distinct clonal populations. Using confocal time-lapse photography, it is possible to observe the chondrocytes behavior during the development of the zebrafish Meckel&#8217;s cartilage.
Multispectral cell labeling enables scientists to demonstrate extension of the Meckel&#8217;s chondrocytes.&#160;During extension phase of the Meckel&#8217;s cartilage, which prefigures the mandible, chondrocytes intercalate to effect extension as they stack in an organized single-cell layered row. Failure of this organized intercalating process to mediate cell extension provides the cellular mechanistic explanation for hypoplastic mandible that we observe in mandibular malformations.

Cell organization of craniofacial bones has long been hypothesized but never directly visualized. Multi-spectral cell labeling and in vivo live imaging allows visualization of dynamic cell behavior in zebrafish lower jaw. Here, we detail the protocol to manipulate Zebrabow transgenic fish and directly observe cell intercalation and morphological changes of chondrocytes in the Meckel&#8217;s cartilage.

Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. Chimeric avian embryos, in which quail donor tissue is transplanted into a chick embryo in ovo, combine the power of indelible genetic labeling of cell populations with the ease of manipulation presented by the avian embryo.
Quail-chick chimeras are a classical tool for tracing migratory neural crest cells (NCCs)1-3. NCCs are a transient migratory population of cells in the embryo, which originate in the dorsal region of the developing neural tube4. They undergo an epithelial to mesenchymal transition and subsequently migrate to other regions of the embryo, where they differentiate into various cell types including cartilage5-13, melanocytes11,14-20, neurons and glia21-32. NCCs are multipotent, and their ultimate fate is influenced by 1) the region of the neural tube in which they originate along the rostro-caudal axis of the embryo11,33-37, 2) signals from neighboring cells as they migrate38-44, and 3) the microenvironment of their ultimate destination within the embryo45,46. Tracing these cells from their point of origin at the neural tube, to their final position and fate within the embryo, provides important insight into the developmental processes that regulate patterning and organogenesis.
Transplantation of complementary regions of donor neural tube (homotopic grafting) or different regions of donor neural tube (heterotopic grafting) can reveal differences in pre-specification of NCCs along the rostro-caudal axis2,47. This technique can be further adapted to transplant a unilateral compartment of the neural tube, such that one side is derived from donor tissue, and the contralateral side remains unperturbed in the host embryo, yielding an internal control within the same sample2,47. It can also be adapted for transplantation of brain segments in later embryos, after HH10, when the anterior neural tube has closed47.
Here we report techniques for generating quail-chick chimeras via neural tube transplantation, which allow for tracing of migratory NCCs derived from a discrete segment of the neural tube. Species-specific labeling of the donor-derived cells with the quail-specific QCPN antibody48-56 allows the researcher to distinguish donor and host cells at the experimental end point. This technique is straightforward, inexpensive, and has many applications, including fate-mapping, cell lineage tracing, and identifying pre-patterning events along the rostro-caudal axis45. Because of the ease of access to the avian embryo, the quail-chick graft technique may be combined with other manipulations, including but not limited to lens ablation40, injection of inhibitory molecules57,58, or genetic manipulation via electroporation of expression plasmids59-61, to identify the response of particular migratory streams of NCCs to perturbations in the embryo's developmental program. Furthermore, this grafting technique may also be used to generate other interspecific chimeric embryos such as quail-duck chimeras to study NCC contribution to craniofacial morphogenesis, or mouse-chick chimeras to combine the power of mouse genetics with the ease of manipulation of the avian embryo.62

An approach for analyzing migration and eventual fate of avian neural crest cells in quail-chick chimeric embryos is described. This method is a simple and straightforward technique for tracing neural crest cells during migration and differentiation that are otherwise difficult to distinguish within an unmanipulated chick embryo.

Die Analyse der Neuralleiste Migration und Differenzierung von Cross-Spezies Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

Neurowissenschaften

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the formation of quail-chicken chimeras and the use of the chorioallantoic membrane (CAM) to sustain the development of ectopic tissues date back to the last century. Nowadays, the combination of these classical techniques with recent in vitro methodologies offers novel prospects to further explore organ formation.
Here we describe a two-step approach to study early- and late-stages of organogenesis. Briefly, the embryonic region containing the presumptive territory of the organ is isolated from quail embryos and grown in vitro in an organotypic system (up to 48 h). Cultured tissues are subsequently grafted onto the CAM of a chicken embryo. After 10 days of in ovo development, fully formed organs are obtained from grafted tissues. This method also allows the modulation of signaling pathways by the regular administration of pharmacological agents and tissue genetic manipulation throughout in vitro and in ovo developmental steps. Additionally, developing tissues can be collected at any time-window to analyze their gene-expression profile (using quantitative PCR (qPCR), microarrays, etc.) and morphology (assessed with conventional histology and immunochemistry).
The described experimental procedure can be used as a tool to follow organ formation outside the avian embryo, from the early stages of organogenesis to fully formed and functional organs.

This article provides an updated approach to the classical quail-chicken chimera system to study organ formation, by combining novel in vitro and in ovo experimental procedures.

Zweistufigen Ansatz - und Ende-Frühstadium der Orgel Formation im Vogelgrippe-Modell zu erkunden: die Thymusdrüse und Nebenschilddrüsen Organogenese Paradigma

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed contributions to unveiling key processes in developmental biology.
Herein is described an optimized method to isolate embryonic tissues from quail and chickens by microsurgery and enzymatic digestion while preserving its biological properties. After isolation, tissues from both species are associated in an in vitro organotypic assay for 48 h. Quail and chicken tissues can be discriminated by distinct nuclear features and molecular markers allowing the study of the cellular cross-talk between heterospecific association of tissues. This approach is, therefore, a useful tool for studying complex tissue interactions in developmental processes with highly dynamic spatial modifications, such as those occurring during pharyngeal morphogenesis and the formation of the foregut endoderm-derived organs. This experimental approach was first developed to study the epithelial-mesenchymal interactions during early-stages of thymus formation. In this, the endoderm-derived prospective thymic rudiment and mesoderm-derived mesenchyme, were isolated from quail and chicken embryos, respectively.
The capacity of the associated tissues to generate organs can be further tested by grafting them onto the chorioallantoic membrane (CAM) of a chicken embryo. The CAM provides nutrients and allows gas exchanges to the explanted tissues. After 10 days of in ovo development, the chimeric organs can be analyzed in the harvested explants by conventional morphological methods. This procedure also allows studying tissue-specific contributions during organ formation, from its initial development (in vitro development) to the final stages of organogenesis (in ovo development).
Finally, the improved isolation method also provides three-dimensionally (3D) preserved embryonic tissues, that can also be used for high-resolution topographical analysis of tissue-specific gene-expression patterns.

This article provides a method to isolate pure embryonic tissues from quail and chicken embryos that can be combined to form ex vivo chimeric organs.

Isolierung der embryonalen Gewebe und die Bildung von Wachteln-Huhn Chimären Organe Thymus am Beispiel

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the strengths of this model system is that the effect of, and interaction among, tissues can be directly assessed in chimeric embryos. We have previously shown that signals from the forebrain contribute to facial morphogenesis by regulating the shape of the expression domain of Sonic hedgehog (SHH) in the Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ). In this article, the method of generating the forebrain chimeras and provide illustrations of the outcomes of these experiments is described.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of basal forebrain&#160;during craniofacial development.

Erstellung von Vogel-Vorderhirn-Chimären zur Beurteilung der Gesichtsentwicklung

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

A Label-free Xenograft Model for Investigating the Behavior of Human Stem Cell Spheroids in Chick Embryos

Xenografts are valuable methods to investigate the behavior of human cells in vivo. In particular, the embryonic environment provides cues for cell migration, differentiation, and morphogenesis, with unique instructive signals and germ layer identity that are often absent from adult xenograft models. In addition, embryonic models cannot discriminate self versus non-self tissues, eliminating the risk of rejection of the graft and the need for immune suppression of the host. This paper presents a methodology for transplantation of spheroids of human cells into chicken embryos, which are accessible, amenable to manipulation, and develop at 37 &#176;C. 
Spheroids allow the selection of a specific region of the embryo for transplantation. After being grafted, the cells become integrated into the host tissue, allowing the follow-up of their migration, growth, and differentiation. This model is flexible enough to allow the utilization of different adherent populations, including heterogeneous primary cell populations and cancer cells. To circumvent the need for prior cell labeling, a protocol for the identification of donor cells through hybridization of human-specific Alu probes is also described, which is particularly important when investigating heterogeneous cell populations. Furthermore, DNA probes can be easily adapted to identify other donor species. This protocol will describe the general methods for preparing spheroids, grafting into chicken embryos, fixing and processing tissue for paraffin sectioning, and finally identifying the human cells using DNA in situ hybridization. Suggested controls, examples of interpretation of results and various cell behaviors that can be assayed will be discussed in addition to the limitations of this method.

Here, we describe a method to transplant and identify human cell spheroids into chick embryos. This xenograft model uses the embryonic microenvironment as a source of instructive signals to assay cell migration, differentiation, and tropism and is especially suited for the study of primary and/or heterogeneous cell populations.

Xenografts are valuable methods to investigate the behavior of human cells in vivo. In particular, the embryonic environment provides cues for cell ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Die Beurteilung Signaling Eigenschaften von ektodermale Epithel Während Craniofacial Entwicklung

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Biologie

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Gesichtstransplantation in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and memory and learning4,5,6. As the only songbird with a sequenced genome, the zebra finch has great potential for use in developmental studies; however, the early stages of zebra finch development have not been well studied. Lack of research in zebra finch development can be attributed to the difficulty of dissecting the small egg and embryo. The following dissection method minimizes embryonic tissue damage, which allows for investigation of morphology and gene expression at all stages of embryonic development. This permits both bright field and fluorescence quality imaging of embryos, use in molecular procedures such as in situ hybridization (ISH), cell proliferation assays, and RNA extraction for quantitative assays such as quantitative real-time PCR (qtRT-PCR).&#160;This technique allows investigators to study early stages of development that were previously difficult to access.

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.

Dissection und Downstream-Analyse von Zebra Finch Embryos in frühen Stadien der Entwicklung

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...