Este trabalho foi apoiado por fundos do Departamento de Animais e Avian Sciences para BT.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Animal Care e Use Comittees Beltsville Área (BAACUC 11-015), de acordo com o USDA Animal Care e Use Guidelines. 1. Anestesia e Analgesia (comum para ambos os procedimentos cirúrgicos) <ol><li> Pesar o mouse e colocar os seguintes anestésicos e analgésicos em duas seringas de 1 ml com 27 agulhas L: <ol><li> A cetamina (0,1 mg / g: 0,01 ml / g de uma solução a 10 mg / ml) e xilazina (0,01 mg / g: 0,005 ml / g de uma solução a 2 mg / ml). </li><li> A buprenorfina (0,1 mg / g: 0,01 ml de uma solução 0,01 mg / ml). </li></ol></li><li> Imobilizar o mouse por pegar a nuca de seu pescoço, como perto das mandíbulas quanto possível, com o polegar eo dedo indicador e segurando a cauda entre os dedos mínimo e anular. </li><li> Injetar mistura cetamina-xilazina por via intraperitoneal. A fim de evitar a perfuração de órgãos internos, segure o mouse comsua cabeça um pouco abaixo do nível dos seus quadris (Figura 1A) </li><li> Injetar buprenorfina subcutânea na nuca do pescoço espera entre o polegar eo dedo indicador (Figura 1B). </li><li> Deixe o rato na gaiola (limpo e sem qualquer outro animal) em um palco quente. </li><li> Uma vez que inconsciente, para verificar a ausência de reflexo pé traseiro (marcado por toe pitada). Aplicar pomada para evitar o ressecamento do olho e para verificar a ausência de reflexo palpebral (Figura 1C). </li><li> Este protocolo fornece um plano de anestesia cirúrgica para um mínimo de 30 minutos, suficiente para realizar os procedimentos descritos abaixo (Protocolos 2 e 3). Se forem necessários tempos mais longos, uma injeção adicional de cetamina + xilazina com a metade da dose descrita na 1.1.1 pode ser aplicado depois de 30 min. A mudança no padrão de respiração para uma mais rápida e irregular um indica o loss do plano de anestesia adequada. </li></ol> 2. Vasectomia <ol><li> Use um macho com uma performance de acasalamento comprovado. </li><li> Esterilizar instrumentos cirúrgicos, limpar as superfícies onde a cirurgia será realizada e limpe-os com álcool 70%. </li><li> Realizar anestesia como anteriormente descrito (Protocolo 1), verificando se há perda de reflexos. </li><li> Posicione o mouse em uma fase quente, retire a pele com tosquiadeiras elétricas da área ventral entre duas linhas imaginárias transversais colocados 0,5 centímetros e 2,5 cm acima do pênis (Figura 2A). </li><li> Higienizar a área raspada, limpando seqüencial com 10% de iodo povidona e 70% de etanol. </li><li> Posicione o mouse na posição supina, com a cauda em direção ao cirurgião e cubra com uma toalha estéril com um buraco de expor a área depilada. Iluminar a área cirúrgica. </li><li> Realize a 10-15 mm incisio pele longitudinaln na linha média do abdome, a cerca de 1 cm acima do pênis. Segure a pele com fórceps vestir serrilhados e depois cortar com uma tesoura (Figuras 2A e 2B). </li><li> Realizar uma incisão longitudinal 5-10 mm na linha alba. Segurar o músculo com microdissecting fórceps serrilhados e cortados com tesouras (Figura 2C). </li><li> Agarre o bloco adiposo testicular de um lado com micro dissecação fórceps serrilhados e puxe-o para expor testículo, canal deferente e epidídimo. Canal deferente está localizado medial para o testículo e é um tubo livre claramente distinguíveis (não ligado à parede do testículo como o epidídimo) com um vaso sanguíneo que corre ao longo de um lado (Figura 2D). </li><li> Segurando o canal deferente com dissecação serrilhada micro fórceps, fórceps vestir chama até que eles ficam vermelhos (Figura 2E </strong&gt;), e então usá-los para cortar e cauterizar os vasos deferentes, em dois pontos de uma só vez (Figura 2F). O corte deve remover uma porção de cerca de 5 mm e deixar duas extremidades cauterizados claramente separadas (Figura 2G). </li><li> Mova o testículo, epidídimo e ducto deferente de volta para a cavidade abdominal. </li><li> Continuar a partir do passo 9 na outra testículo. </li><li> Suturar o músculo com um ou dois pontos de colchão horizontais feitas com 5/0 sutura absorvível (Figura 2H). </li><li> Sutura da pele com um ou dois cortadores de ferida (Figura 2I). </li><li> Identificar o vasectomizado (brinco, tatuagem dedo ...), mova-o da gaiola colocada em uma fase quente e observar até que ele se recupera da anestesia (consciente e manter decúbito esternal). A injeção subcutânea 0,5-1 ml de solução salina quente melhora a reperação. Anote as possíveis incidências ocorridas durante a transferência de vasectomia, adicionar antibióticos para a água potável. </li><li> Clips ferida pode ser removido 10 dias após a vasectomia com um removedor ferida clipper ou um par de fórceps de dentes. O macho vasectomizado estará pronto para acasalar 2 semanas após a cirurgia. </li><li> Teste a infertilidade do homem vasectomizado por acasalamento com fêmeas férteis antes de usá-lo para obter os destinatários. </li></ol> 3. Transferência de Embrião Utero-tubária <ol><li> Rato mórula ou de blastocisto pode ser transferido por esta técnica a uma fêmea receptora pseudogrï de 2,5 dpc. </li><li> Prepare embrião pipeta de vidro manipulação: <ol><li> Polir as pontas dos capilares de vidro, a fim de evitar danificar o suporte da pipeta. </li><li> Suavizar uma porção média do capilar de vidro por aquecimento com uma multa chama enquanto um pouco de rotaçãoo capilar com ambas as mãos de forma sincronizada. Uma vez que a secção capilar torna-se macia e maleável (cor vermelho claro), retirá-lo rapidamente do fogo e retire as duas extremidades para reduzir o seu diâmetro externo de 130-150 m. </li><li> Aguarde até que o vidro esfriar e depois corte-o levemente marcando a parte estreita com um lápis com ponta de diamante-, pedra abrasiva ou lixa de unha e puxando a partir de ambos os lados. A pausa deve ser limpo e perpendicular </li></ol></li><li> Polir a ponta por muito rapidamente em chamas, deixando uma abertura de 100-130 m. Pipetas pode ser armazenado para uso posterior. </li><li> Quente mídia manipulação de embriões (CZBH ou M2, ver discussão). </li><li> Esterilizar instrumentos cirúrgicos, limpar as superfícies onde a cirurgia será realizada e limpe-os com álcool 70%. </li><li> Realizar anestesia como anteriormente descrito (Protocolo 1), verificando se há perda de reflexos. </li><li> Manter tele mouse em uma fase quente, retire a pele com tosquiadeiras elétricas da área dorsal entre os joelhos e as costelas distal (Figuras 3A e 3B). </li><li> Higienizar a área raspada, limpando seqüencial com 10% de iodo povidona e 70% de etanol. </li><li> Mova os embriões da incubadora para a mídia manipulação de embriões pré-aquecido. </li><li> Mova o destinatário a um estágio quente sob o microscópio estereoscópico e colocá-lo em posição prona lateralmente para o cirurgião (com a cabeça olhando para o lado direito ou esquerdo do cirurgião). </li><li> Cobrir a área com uma toalha estéril com um furo expondo a área raspada e iluminar a área cirúrgica. </li><li> Executar de 1 cm transversal incisão (vertical) na pele em um ponto localizado na craniano ⅓ da linha entre a última costela e os quadris eo ⅓ dorsal da linha entre as costas eo abdômen (Figuras 3A and 3B). Segure a pele com fórceps vestir serrilhadas e corte com tesoura (Figura 3C). </li><li> Uma vez que a pele tenha sido cortado, ovário (vermelho / laranja) ou a almofada adiposa em torno do ovário (branco) pode ser visualizada através da parede do corpo. Realize uma 0,3-0,5 cm transversal (vertical) incisão na parede do corpo sobre o ovário ou almofada adiposo em um local onde a incisão não cortar qualquer grande vaso sanguíneo. Segure o músculo com micro dissecação fórceps serrilhada e corte com tesoura (Figura 3D). </li><li> Mova o rato para ter a sua cabeça virada para o cirurgião. </li><li> Carregar a manipulação de embriões pipeta (Figura 3E): <ol><li> A mídia CZBH subir por capilaridade através da porção estreita da pipeta manipulação até cerca de 5 mm da parte mais larga. </li><li> Tome-se uma pequena bolha de ar (0,2-0,5 mm). </li><li> Introduzir os embriões (5-10) emuma quantidade mínima de meio (2-4 mm). </li><li> Tome-se outra bolha de ar pequeno (0,2-0,5 mm) e uma pequena quantidade de mídia (0,5-1 mm). </li><li> Deixe a pipeta de vidro preso no suporte aspirador na boca ou ao dispositivo operado manualmente, pronto para a etapa 3.17. </li></ol></li><li> Agarre o bloco adiposo em torno do ovário com micro dissecação fórceps serrilhados e puxe-o para a cabeça do rato para expor o ovário, oviduto, e uma pequena porção superior do útero fora da cavidade abdominal (Figuras 3F e 3G). </li><li> Segurando o bocal do aspirador na boca, pronto para ser usado, pegue a almofada de tecido adiposo com micro dissecação fórceps serrilhada para mover o oviduto e expor a junção útero-tubária (ou seja, onde o oviduto encontra o útero). </li><li> Mantendo a junção útero-tubária acessível, tomar pequenas pinças de dissecação micro curvas com a mão esquerda (se destro) e colocá-los logo abaixoa junção útero-tubária agarrando oviduto cerca de 2 mm acima a parte. </li><li> Segurando a junção útero-tubária com as pequenas pinças de dissecação micro curvas, perfure a seção oviduto perto das pinças com uma agulha de 27 G (Figura 3H). </li><li> Inserir a manipulação pipeta embrião dentro do orifício efectuada com a agulha e avançar para o útero através da junção útero-tubária (Figuras 3I e 3J). Uma vez que a pipeta passou a junção útero-tubária (figura 3K) que desliza facilmente. Não progredir muito longe dentro do útero para evitar danos endometrial (não mais de 3 mm) e bloqueio pipeta pelos destroços. </li><li> Solte os embriões no útero, soprando suavemente (Figura 3E). Ambas as bolhas de ar deve passar pelo útero. Alguns meios de comunicação acima da primeira bolhatambém pode ser liberado para o útero, mas evitar a introdução de mais ar, pois pode impedir a implantação. </li><li> Remova a pipeta logo após embriões foram lançados para dentro do útero. </li><li> Mova o oviduto e ovário de volta para a cavidade abdominal, agarrando a almofada adiposo. </li><li> Suturar o músculo com um ponto de colchão horizontal com 5/0 sutura absorvível (Figura 3M). </li><li> Sutura da pele com um cortador de ferida (Figura 3 N). </li><li> Continuar a partir do passo 10 no outro lado, se necessário. </li><li> Identificar o destinatário (brinco, tatuagem dedo ...), mova-o para a sua gaiola (colocado em uma fase quente) e observar até que ele se recupera da anestesia (consciente e manter decúbito esternal). </li><li> Anotar os possíveis incidentes que ocorrem durante a transferência de embriões e adicionar antibióticos para a água potável. A injeção subcutânea 0,5-1 ml de sali quentesolução ne melhora a recuperação. </li><li> Clips ferida pode ser removido 10 dias após a transferência de embriões com um removedor ferida clipper ou dois pares de fórceps (Figura 3O). O destinatário pode ser pesado naquele dia para avaliar a gravidez e estimar o número de filhotes. Fornecer material de aninhada ao destinatário 15 dias após a transferência de embriões. </li></ol>

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	<li>Fernandez-Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effect+of+in+vitro+culture+of+mouse+embryos+with+serum+on+mRNA+expression+of+imprinting+genes,+development,+and+behavior.">Long-term effect of in vitro culture of mouse embryos with serum on mRNA expression of imprinting genes, development, and behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci USA. 101, 5880-5885 (2004).</li><li>Bermejo-Alvarez, P., Roberts, R. M., Rosenfeld, C. 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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

A vasectomia é um procedimento cirúrgico relativamente simples que não envolve grandes dificuldades. Quando saneantes com iodo povidona e etanol ter certeza de que a última lavagem (com etanol) remove iodopovidona, pois pode irritar o peritônio. O acesso ao canal deferente também pode ser alcançado por executar o escroto ou uma incisão no abdómen 8. Incisão escrotal tem sido recomendado para transversal incisão abdominal devido a incisão menor comparativamente necessário e um pouco melho...

A transferência de embriões é provavelmente o procedimento cirúrgico mais realizado no modelo de mouse. Esta técnica é essencial para a obtenção de descendentes de embriões sujeitos a técnicas de manipulação in vitro e, por conseguinte, constitui um passo necessário para o desenvolvimento de modelos geneticamente modificadas através de injecção pronuclear, a transdução lentiviral, ou a formação de quimeras. Além disso, a técnica permite o estudo dos efeitos sobre o desenvolvimento de diversos insultos que ocorrem durante o desenvolvimento pré-implantação. O uso de técnicas de reprodução artificial 1 ou a exposição a concentrações anormais de diferentes substâncias ou metabólitos 02 de maio afetar o desenvolvimento do embrião, resultando em falhas de implantação ou de placentação e efeitos a longo prazo na prole. A técnica de transferência de embriões confiável e reprodutível é crucial para testar os possíveis efeitos negativos do tratamento experimental na implantação e desenvolvimento fetal em um homem consistentener. Embriões de pré-implantação de murino pode ser transferido para uma fêmea receptora, quer para o oviduto através da ampola de 0,5 dias post coitum (DPC) destinatários pseudográvidas (transferência oviduto 3,4) ou no útero de 2,5 dpc pseudo-destinatário (transferência uterina) 5,6 dependendo do seu estágio de desenvolvimento. Os embriões na fase de blastocisto, tal como aqueles utilizados para gerar ratinhos quiméricos através da injecção de células estaminais embrionárias pluripotentes ou induzidos, são usualmente transferidas por transferência uterina. Blastocistos pode também ser transferido para o oviducto de um recipiente de 0,5 dpc, mas constitui um teste menos fisiológico para disruptores de desenvolvimento, porque o embrião sofre diapausa e tem 2 dias para se recuperar a partir do insulto antes da implantação ocorra. Transferência uterina envolve perfurar a parede uterina com uma agulha fina, a fim de gerar uma abertura que permite o acesso de uma pipeta de manipulação do embrião no lúmen uterino. Ambora esta técnica pode produzir bons resultados, a sobrevivência a prazo (ou seja, a percentagem de embriões transferidos que se desenvolvem a um filhote de cachorro) é geralmente baixa e imprevisível 7,8. O punção da parede uterina implica alguns efeitos secundários prejudiciais. Em primeiro lugar, o miométrio é um tecido altamente vascularizado e seu punção muitas vezes resulta em uma pequena hemorragia. O sangue pode bloquear a pipeta de transferência de embriões ou invadir o lúmen do útero causando a morte embrionária e / ou falhas de implantação. Isto é particularmente relevante quando os embriões são transferidos sem zona, como as células do sangue e detritos pode anexar os blastômeros. Em segundo lugar, a abertura realizada não vedar depois os embriões foram transferidos, de modo que possa fluir para trás através do orifício e ser expulso para a cavidade abdominal, quando uma muito grande volume foi introduzir no útero. A transferência do embrião útero-tubária aqui descritas tomar vantagem da junção útero-tubária para entregar o embryos no útero, sem a necessidade de perfurar a parede uterina e assim evitar as suas consequências adversas 9. As fêmeas receptoras pseudográvidas utilizados para transferência de embriões são obtidos por monta natural com machos vasectomizados 8. As secreções seminais produzidos por um macho estéril, que são necessários para o útero para se tornar receptivo para os embriões transferidos. Para obter um recipiente, um máximo de duas fêmeas de 8 semanas a 6 meses de idade, são colocados com um macho vasectomizado na parte da tarde. Na manhã seguinte, as fêmeas são verificadas quanto a presença de um tampão de cópula vaginal, um grupo de proteínas coaguladas do fluido seminal masculino. Como acasalamento ocorre geralmente durante a meia-noite, o dia de detecção do conector vaginal é considerado 0,5 dpc. Embora machos vasectomizados podem ser adquiridos a partir de alguns vendedores, o procedimento cirúrgico aqui descrito é relativamente fácil e não necessita de quaisquer instrumentos adicionais do que o necessário para a transferência de embriões.

<table><tbody><tr><td>Ketamine</td><td>VEDCO</td><td>Ketaved ANADA 200-257</td><td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>Anased NADA #139-236</td><td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Generic</td><td>NDC 400-42-010-01</td><td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td></tr><tr><td>Eye ointment</td><td>Novartis</td><td>Genteal</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic</td><td>Pfizer</td><td>Clavamox NADA #55-101.</td><td>Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.</td></tr><tr><td>Dressing serrated forceps</td><td>ROBOZ</td><td>RS-8120</td><td>Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.</td></tr><tr><td>Microdissecting serrated forceps</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5137</td><td>These ones are curved at a 90&amp;ordm; angle. Straight forceps can be used if preferred.</td></tr><tr><td>Slight curved micro dissection forceps</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5136</td><td>This model is particularly useful to hold the oviduct.</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5880</td><td>Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.</td></tr><tr><td>27 G needles</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>305136</td><td>Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big.</td></tr><tr><td>Clip applier</td><td>MiKRon</td><td>42763</td><td></td></tr><tr><td>9 mm Clips</td><td>MiKRon</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>Clip remover</td><td>MiKRon</td><td>7637</td><td>Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.</td></tr><tr><td>Suture needle holder</td><td>ROBOZ</td><td>RS-7820</td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Dowist Gell</td><td>5-0 Dexon S 7204-21</td><td>Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.</td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>VWR</td><td>100 ul calibrated pipettes 53432-921</td><td>It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 &amp;#181;m filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy &lt;em&gt;et al&lt;/em&gt;.&lt;sup&gt;8&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Burner</td><td>KISAG AG</td><td>Typ 2002</td><td>Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZFLIII</td><td>This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fiber optics ilumination</td><td>Dolan Jenner</td><td>Fiber lite</td><td>To iluminate the surgical area. There are different systems available.</td></tr><tr><td>Warm stages</td><td>American scope</td><td>&lt;a href=&quot;https://exch.mail.umd.edu/owa/redir.aspx?C=1qTJKejamUSfudeYG_MlZHvTY3dsJM9Iaqr2SnwGD4ECWGzB8e8Rpg--_L7u0vJmyatXQJzGQ0k.&amp;amp;URL=http%3a%2f%2fstore.amscope.com%2ftcs-100.html&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://store.amscope.com/tcs-100.html&lt;/a&gt;</td><td>These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.</td></tr><tr><td>Culture dishes for embryo manipulation</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>351008 may be also used; they made narrower drops.</td></tr></tbody></table>

utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model

A transferência de embriões pré-implantação de uma fêmea de aluguel é um passo necessário para a produção de ratos geneticamente modificados ou para estudar os efeitos das alterações epigenéticas originou durante o desenvolvimento pré-implantação em desenvolvimento e adulto fetal subseqüente saúde. A utilização de uma técnica de transferência de embriões eficaz e consistente é importante para aumentar a geração de animais geneticamente modificados e para determinar o efeito de diferentes tratamentos sobre as taxas de implantação e sobrevivência a termo. Embriões no estádio de blastocisto são normalmente transferidos por transferência uterina, realizando um furo na parede uterina para introduzir a pipeta de manipulação de embriões. O orifício realizado no útero não fechar após a pipeta foi retirada, e os embriões podem saída para a cavidade abdominal devido à pressão positiva do útero. A punção também pode produzir uma hemorragia que prejudica a implantação, bloqueia a pipeta de transferência e pode afetar o embrião development, especialmente quando os embriões são transferidos sem zona. Consequentemente, esta técnica muitas vezes resulta em taxas de sobrevivência de embriões de baixa muito variáveis, e em geral. Evitar estes efeitos negativos, transferência de embrião tubário utero-aproveitar a junção útero-tubária como uma barreira natural que impede a saída do embrião e evitar a perfuração da parede uterina. Machos vasectomizados são necessários para a obtenção de destinatários pseudográvidas. Uma técnica para realizar a vasectomia é descrito como um complemento para a transferência de embriões útero-tubária.

Transferência de embriões útero-tubária fornece um meio para transferir os embriões para o útero evitar algumas das complicações associadas à transferência de embriões uterino 2,9,10. Na Tabela 1 mostram algum resultado representante obtivemos transferindo blastocistos CD1 submetidos a diferentes tipos de manipulações para destinatários CD1 seguindo o protocolo descrito. A sobrevivência a termo (% dos embriões resultantes em um cão) ou sobrevivência de E15 (no caso de lentiv...

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Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model

Transferência de embrião tubário utero-usa a junção útero-tubária como uma barreira para impedir a saída de embriões que podem ocorrer quando se realiza a transferência uterina. Machos vasectomizados são obrigados a obter destinatários pseudográvidas para transferência de embriões. Ambas as técnicas são discutidas.

Transferência de Embrião Utero-tubária e vasectomia no Rato Modelo

The transfer of preimplantation embryos to a surrogate female is a required step for the production of genetically modified mice or to study the effects ...

utero-tubal-embryo-transfer-and-vasectomy-in-the-mouse-model

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

47.7K visualizações.  United States Department of Agriculture.  Transferência de embrião tubário utero-usa a junção útero-tubária como uma barreira para impedir a saída de embriões que podem ocorrer quando se realiza a transferência uterina. Machos vasectomizados são obrigados a obter destinatários pseudográvidas para transferência de embriões. Ambas as técnicas são discutidas. 

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Um modelo do rato de No Utero Transplante

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Medicina

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

Ultra-som guiada microinjeção em parte frontal do cérebro do rato In Utero Em E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Neurociência

Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of lesions, and/or chronic pharmaceutical management of pain and infertility symptoms. The cost associated with endometriosis has been estimated at 22 billion dollars per year in the United States1. To further our understanding of mechanisms underlying this enigmatic disease, animal models have been employed. Primates spontaneously develop endometriosis and therefore primate models most closely resemble the disease in women. Rodent models, however, are more cost effective and readily available2. The model that we describe here involves an autologous transfer of uterine tissue to the intestinal mesentery (Figure 1) and was first developed in the rat3 and later transferred to the mouse4. The goal of the autologous rodent model of surgically-induced endometriosis is to mimic the disease in women. We and others have previously shown that the altered gene expression pattern observed in endometriotic lesions from mice or rats mirrors that observed in women with the disease5,6. One advantage of performing the surgery in the mouse is that the abundance of transgenic mouse strains available can aid researchers in determining the role of specific components important in the establishment and growth of endometriosis. An alternative model in which excised human endometrial fragments are introduced to the peritoneum of immunocompromised mice is also widely used but is limited by the lack of a normal immune system which is thought to be important in endometriosis2,7. Importantly, the mouse model of surgically induced endometriosis is a versatile model that has been used to study how the immune system8, hormones9,10 and environmental factors11,12 affect endometriosis as well as the effects of endometriosis on fertility13 and pain14.

A description of the surgical induction of endometriosis in mice and rats by auto-transplantation of uterine tissue to the arterial cascade of the intestinal mesentery.

Modelo do rato de endometriose cirurgicamente induzida pela Auto-transplante de tecido uterino

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of ...

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

Uso de embriões congelados para produção de ratos geneticamente modificados

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Genética

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances early in the gestation. The rationale behind IUT for therapeutic purposes is based on the small size of the fetus, the fetal immunologic immaturity, the accessibility and proliferative nature of the fetal stem or progenitor cells, and the potential to treat a disease or the onset of symptoms prior to birth. Taking advantage of these normal developmental properties of the fetus, the delivery of hematopoietic stem cells (HSC) via an IUT has the potential to treat congenital hematologic disorders such as sickle cell disease, without the required myeloablative or immunosuppressive conditioning required for postnatal HSC transplants. Similarly, the accessibility of progenitor cells in multiple organs during development potentially allows for a more efficient targeting of stem/progenitor cells following an IUT of viral vectors for gene therapy or genome editing. Additionally, IUT can be used to study normal developmental processes including, but not limited to, the development of immunologic tolerance. The murine model provides a valuable and affordable means to understanding the potential and limitations of IUT prior to pre-clinical large animal studies and an eventual clinical application. Here, we describe a protocol for performing an IUT in the murine fetus through intravenous and intra-amniotic routes. This protocol has been used successfully to elucidate the necessary conditions and mechanisms behind in utero hematopoietic stem cell transplantation, tolerance induction, and in utero gene therapy.

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

We describe a protocol for performing an in utero transplantation (IUT) through intravenous and intra-amniotic routes of injection in the murine model. This protocol can be used to introduce cells, viral vectors, and other substances into the unique immune-tolerant fetal environment.

Intravenosa e Intra-amniótica no Utero transplante no modelo murino

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Biologia do Desenvolvimento

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

Transferência de embriões minimamente invasivos e vitrificação embrionária na fase de embrião ideal em modelo de coelho

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Methods for Studying Uterine Contributions to Pregnancy Establishment in an Ovariectomized Mouse Model

For pregnancy to be established, a viable blastocyst must successfully interact with a receptive uterine lining (endometrium) to facilitate implantation and placenta formation and enable ongoing pregnancy. The limitations to pregnancy success caused by embryonic defects are well known and have been largely overcome in recent decades with the rise of in vitro fertilization (IVF) and assisted reproductive technologies. As yet, however, the field has not overcome the limitations caused by an inadequately receptive endometrium, thus resulting in stagnating IVF success rates. Ovarian and endometrial functions are closely intertwined, as hormones produced by the ovary are responsible for the endometrium's menstrual cyclicity. As such, when using rodent models of pregnancy, it can be difficult to ascertain whether an observed result is due to an ovarian or uterine deficit. To overcome this, an ovariectomized mouse model was developed with embryo transfer or artificial decidualization to allow the study of uterine-specific contributions to pregnancy. This article will provide instructions on how to perform ovariectomy and offer insights into various techniques for supplying exogenous hormones to support successful artificial decidualization or pregnancy following embryo transfer from healthy donors. These techniques include subcutaneous injection, slow-release pellets, and osmotic mini pumps. The key advantages and disadvantages of each method will be discussed, enabling researchers to choose the best study design for their specific research question.

Pregnancy establishment is a dynamic process involving complex embryo and uterine crosstalk. The precise contributions of the maternal uterine environment to these processes remain an active area of investigation. Here, detailed protocols are provided to aid in designing in vivo animal models to address these research questions.

Métodos para o Estudo das Contribuições Uterinas para o Estabelecimento da Gestação em Modelo de Camundongo Ovariectomizado

For pregnancy to be established, a viable blastocyst must successfully interact with a receptive uterine lining (endometrium) to facilitate implantation ...

<meta charset="utf8"></head><body>Procedimento de injeção de espermátides redondas murinas para estudar o desenvolvimento embrionário

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Injeção de espermátide redonda em camundongo

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Transferência de Embrião Utero-tubária e vasectomia no Rato Modelo

Resumo

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Injeção de espermátide redonda em camundongo

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Injeção de espermátide redonda em camundongo