Name: utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model
Uploaded: 2014-02-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
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이 작품은 BT에 대한 동물 및 조류 과학학과에서 기금에 의해 지원되었다.

모든 동물 실험은 USDA 동물 관리 및 사용 지침에 따라 벨트 스빌 지역 동물 관리 및 사용 Comittees (BAACUC 11-015)에 의해 승인되었다. 1. 마취 및 진통제 (외과 적 치료 모두에 공통) <ol><li> 마우스의 무게를 27 G 바늘로 두 1 ㎖ 주사기에 다음과 같은 마취제 및 진통제를로드 <ol><li> 케타민 (0.1 ㎎ / g : 0.01 ㎖ / 10 ㎎ / ㎖ 용액의 g)과 자일 라진 (0.01 ㎎ / g : 2 ㎎ / ㎖ 용액 0.005 ㎖ / g). </li><li> 부 프레 노르 핀 (0.1 ㎍ / g : 0.01 ㎎ / ㎖ 용액 0.01 ㎖). </li></ol></li><li> 엄지와 집게 손가락으로 가능한 한 턱에 가까운 목의 목덜미를 따기와 새끼와 약지 사이의 꼬리를 잡고 마우스를 고정시킨다. </li><li> 복강 케타민-자일 라진 혼합물을 주입. 내장 천공을 방지하기 위해,로 마우스를 길게약간의 엉덩이의 수준 이하의 머리 (그림 1A) </li><li> 엄지 손가락과 집게 손가락 (그림 1B) 사이에 목 홀드의 목덜미에 부 프레 놀핀의 피하 주사. </li><li> 따뜻한 무대에서 케이지 (깨끗하고 다른 동물 제외)에 마우스를 둡니다. </li><li> 의식하면, (발가락 핀치에 의해 확인) 후방 발 반사의 부재를 확인합니다. 눈의 건조를 방지하고 눈꺼풀 반사 (그림 1C)의 부재를 확인하기 위해 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 이 프로토콜은 아래에 설명 된 절차를 수행 할 정도로 30 분의 최소 수술 마취 평면 제공 (프로토콜 2 및 3). 긴 시간이 필요한 경우, 1.1.1에 기술 된 투여 량의 절반 케타민 + 자일 라진의 추가 주입을 30 분 후에 적용될 수있다. 빠르고 불규칙한 하나에 호흡 패턴의 변화는 이오를 나타냅니다적절한 마취 비행기의 SS. </li></ol> 2. 정관 수술 <ol><li> 검증 된 상대 성능을 남성을 사용합니다. </li><li> , 수술 도구를 소독 수술을 수행 할 것입니다 표면을 청소하고 70 % 에탄올로 닦아주십시오. </li><li> 이전 반사 손실에 대한 검사 (프로토콜 1) 설명 된대로 마취를 수행합니다. </li><li> 제거, 따뜻한 무대에 마우스를 놓고 두 개의 가상 횡단 선 사이의 복부 지역에서 전기 가위 모피는 0.5 ㎝, 성기 이상 2.5 cm (그림 2A)를 배치했다. </li><li> 10 % 포비돈 요오드 70 % 에탄올로 순차적으로 닦아 면도 영역을 소독합니다. </li><li> 면도 영역을 노출 구멍 멸균 수건으로 외과 의사 및 커버 향해 꼬리를 위로 향한 위치에 마우스를 놓습니다. 수술 영역을 조명. </li><li> 10-15mm 세로 피부 incisio를 수행N 약 1 ㎝의 음경 위 복부의 중간 라인. 톱니 모양의 집게를 드레싱 한 다음 (그림 2A와 2B) 가위로 잘라 피부를 잡습니다. </li><li> 원격 교육의 알바 5~10밀리미터 세로 절개를 수행합니다. 톱니 모양의 집게를 microdissecting와 근육을 잡고 가위 (그림 2C)로 잘라. </li><li> 톱니 모양의 집게를 해부 마이크로으로 한쪽 고환 지방 패드를 잡고 고환을 노출 잡아 당겨, 정관 및 부고환. 정관은 고환에 중간에 위치하고 있습니다 그것은 같은 고환 벽에 부착하지 명확하게 구별 할 수있는 무료 관 (이다 혈관 한쪽 (그림 2D)을 따라 실행과 부고환). </li><li> 그들은 빨간색으로까지 마이크로 해부 톱니 모양의 집게, 불꽃 드레싱 포셉으로 정관을 잡고 (그림 2E </st)&gt; 룽, 다음 (그림 2 층) 한 번에 두 지점에서 정관을 잘라 소작하기 위해 그들을 사용합니다. 컷은 약 5 ㎜의 일부를 제거하고 두 개의 분명히 구분 소작 끝 (그림 2G)를 남겨 두어야한다. </li><li> 다시 복강에 고환, 부고환과 정관을 이동합니다. </li><li> 다른 고환의 9 단계에서 진행합니다. </li><li> 5 / 0 흡수성 봉합사 (그림 2H)으로 만든 하나 또는 두 개의 수평 매트리스 바늘로 근육을 봉합. </li><li> 하나 또는 두 개의 상처 가위 (그림 2I)로 피부를 봉합. </li><li> , vasectomised 남성 (귀 반지, 문신을 ...) 확인 그것을 따뜻한 스테이지에 배치 케이지를 이동하고 마취에서 회복 될 때까지 관찰 (의식과 흉골 드러 누움을 유지). 따뜻한 식염수 0.5 ㎖를 피하 주사는 재 향상covery. , 정관 전송시 발생 가능한 그런 일을 기록 식수에 항생제를 추가합니다. </li><li> 상처 클립 10 일 상처 어선 제거 또는 치아 포셉 한 쌍의 정관 수술 후 제거 할 수 있습니다. 과 vasectomized 남성은 수술 후 2 주 동안 짝짓기를 할 준비가 될 것입니다. </li><li> 받는 사람을 얻기 위해 그것을 사용하기 전에 비옥 한 여성과 짝짓기하여과 vasectomized 남성의 불임을 테스트합니다. </li></ol> 3. 자궁 - 난관 배아 전송 <ol><li> 마우스 morulae 또는 배반 2.5 DPC에서 pseudopregnant받는 여성이 기술에 의해 전송 될 수 있습니다. </li><li> 배아 조작 유리 피펫을 준비한다 : <ol><li> 피펫 홀더의 손상을 방지하기 위하여 유리 모세관의 끝을 연마하고 있습니다. </li><li> 약간 회전하면서 미세 화염으로 가열하여 유리 모세관의 중간 부분을 연화기적으로 두 손으로 모세관. 모세관 부분은 부드럽고 (밝은 붉은 색) 전성 상태가되면 불에서 빨리 철회하고 130 ~ 150 μm의 외부 직경을 축소하기 위해 양쪽 끝을 잡아 당깁니다. </li><li> 유리가 냉각 한 후 가볍게 다이아몬드 점, 색연필, 연마 돌 또는 네일 파일과 좁은 부분을 처치하고 양쪽에서 잡아 당겨 잘라 때까지 기다립니다. 휴식은 깨끗하고 수직이어야한다 </li></ol></li><li> 100 ~ 130 ㎛의 구멍을 떠나, 매우 신속하게 타오르는로 끝을 연마하고 있습니다. 피펫은 나중에 사용하기 위해 저장할 수 있습니다. </li><li> 따뜻한 배아 조작 미디어 (CZBH 또는 M2는 설명을 참조). </li><li> , 수술 도구를 소독 수술을 수행 할 것입니다 표면을 청소하고 70 % 에탄올로 닦아주십시오. </li><li> 이전 반사 손실에 대한 검사 (프로토콜 1) 설명 된대로 마취를 수행합니다. </li><li> T를 유지그는 따뜻한 무대에서 마우스, 무릎 및 말초 리브 (그림 3a 및 3b) 사이의 등의 지역에서 전기 가위와 모피를 제거합니다. </li><li> 10 % 포비돈 요오드 70 % 에탄올로 순차적으로 닦아 면도 영역을 소독합니다. </li><li> 데워진 배아 조작 미디어 인큐베이터에서 배아를 이동합니다. </li><li> 실체 현미경 따뜻한 무대에받는 사람을 이동하고 (머리가 ​​오른쪽 또는 외과 의사의 왼쪽 측면을 찾고있는) 의사에 횡 방향으로 발생하기 쉬운 위치에 배치합니다. </li><li> 면도 영역을 노출 구멍 멸균 수건으로 영역을 커버하고 수술 영역을 조명. </li><li> 마지막 갈비뼈와 엉덩이와 허리와 복부 (그림 3A의 사이의 라인의 지느러미 ⅓ 사이의 라인의 두개골 ⅓에 위치한 자리에 피부에 1cm 횡단 (세로) 절개를 수행차 3B). 톱니 모양의 집게를 드레싱으로 피부를 잡고 가위 (그림 3C)으로 잘라. </li><li> 피부가 절단되면, 난소 (레드 / 오렌지) 또는 난소 (흰색)를 둘러싼 지방 패드는 신체의 벽을 시각화 할 수 있습니다. 절개가 어떤 큰 혈관을 절단하지 않는 자리에 난소 또는 지방 패드에 몸 벽에 0.3 ~ 0.5 센티미터 횡단 (세로) 절개를 수행합니다. 마이크로 해부 톱니 모양의 집게로 근육을 잡고 가위 (그림 3D)으로 잘라. </li><li> 머리가 외과 의사를 향하도록 마우스를 이동합니다. </li><li> 배아 조작 피펫 (그림 3E)을로드합니다 : <ol><li> CZBH 미디어 넓은 부분의 약 5 ㎜까지 조작 피펫의 좁은 부분을 통해 모세관 현상에 의해 상승 할 수 있습니다. </li><li> 작은 기포 (0.2 ~ 0.5 mm)를 채택한다. </li><li> 에서 배아 (5-10) 소개미디어의 최소량 (2-4 ㎜). </li><li> 또 다른 작은 기포 (0.2 ~ 0.5 mm) 및 미디어 소량 (0.5 mm)를 채택한다. </li><li> 입 흡인기 홀더 또는 단계 3.17에 대한 준비가 수동 장치에 부착 된 유리 피펫을 남겨주세요. </li></ol></li><li> 마이크로 해부 톱니 모양의 집게로 난소를 둘러싼 지방 패드를 잡고 난소, 난관 및 복강 중 상부 자궁의 작은 부분 (그림 3 층 및 3 세대)에 노출 마우스의 머리를 잡아 당깁니다. </li><li> 난관을 이동하고 (난관 자궁을 충족 예) 자궁 - 난관 접합을 폭로 마이크로 해부 톱니 모양의 집게로 지방 패드를 잡고, 사용할 준비가 입에 흡입기 마우스 피스를 들고. </li><li> 접근 자궁 - 난관 접합을 유지, (오른쪽 손으로하는 경우) 왼손으로 약간의 곡선 마이크로 해부 집게를 가지고 아래 사항들을 배치그 부분 위의 2mm에 대한 난관을 잡는 자궁 - 난관 접합. </li><li> 약간의 곡선 마이크로 해부 집게로 자궁 - 난관 접합부를 잡고, 27 G 바늘 (그림 3H)와 집게에 가까운 난관 부분에 구멍을. </li><li> 자궁 - 난관 접합을 통해 자궁에 바늘과 사전에 수행 된 구멍에 ​​배아 조작 피펫을 삽입 (3I 및 3J 피규어). 피펫은 자궁 - 난관 접합부 (그림 3K)을 통과하면 쉽게 미끄러진다. 파편에 의한 자궁 내막의 손상 (더 이상 3 mm 이상) 및 피펫 차단을 방지하기 위해 자궁에 아주 멀리 진행하지 마십시오. </li><li> 부드럽게 (그림 3 L)를 불어 자궁에 배아를 놓습니다. 두 기포가 자궁을 통과해야합니다. 첫 번째 거품 위의 미디어 중 일부또한 자궁 내로 방출 만 주입을 방해 할 수 있으므로, 더 많은 공기를 유입 방지 될 수있다. </li><li> 배아가 자궁에 출시 된 직후 피펫을 제거합니다. </li><li> 난관을 이동하고 지방 패드를 잡아서 다시 복강에 난소. </li><li> 5 / 0 흡수성 봉합사 (그림 3M)와 수평 매트리스 스티치 근육을 봉합. </li><li> 상처 깎기 (그림 3N)로 피부를 봉합. </li><li> 필요한 경우 다른 쪽의 10 단계에서 진행합니다. </li><li> 받는 사람 (귀 반지, 문신을 ...) 확인 (따뜻한 스테이지에 배치) 케이지로 이동하고 마취에서 회복 될 때까지 관찰 (의식과 흉골 드러 누움을 유지). </li><li> 배아 전송 중에 발생 가능한 그런 일을 주석 및 식수에 항생제를 추가합니다. 따뜻한 SalI으로의 0.5 ~ 1 ㎖를 피하 주사NE 솔루션은 복구를 향상시킵니다. </li><li> 상처 클립 10 일 상처 어선 제거 또는 집게 (그림 -30) 두 쌍의 배아 전송 후 제거 할 수 있습니다. 받는 사람이 임신을 평가하고 새끼의 수를 추정하는 그 날에 무게를 할 수 있습니다. 십오일 배아 전송 후받는 사람에게 새끼 자료를 제공합니다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

정관 수술은 큰 어려움을 포함하지 않는 비교적 똑 바른 앞으로 수술 기법이다. 포비돈 요오드와 에탄올로 소독하는 경우는 복막을 자극 할 수 있으므로 (에탄올) 마지막 세척, 포비돈 요오드를 제거해야합니다. 정관에 프리 또한 음낭 또는 복부 8 횡 절개를 수행함으로써 달성 될 수있다. 음낭 절개로 인해 필요한 비교적 작은 절개를하고 조금 더 나은 수술 후 행동 (11) 복?...

배아 전송 아마 마우스 모델에서 수행되는 가장 흔한 수술입니다. 이 기술은 시험 관내 조작 기술을 실시 배아에서 자손을 구하는 것이 필수적이며, 따라서, 전핵 주입, 렌티 바이러스 형질 도입, 또는 키메라 형성에 의해 유전자 변형 된 모델의 개발에 필요한 단계를 구성한다. 또한,이 기술은 착상 전 개발 과정에서 발생하는 다양한 모욕의 개발 효과에 대한 연구를 할 수 있습니다. 인공 재생 기술 한 또는 상이한 물질 또는 대사 2의 비정상적인 농도에 노출의 사용은 주입 또는 태반 장애 및 자손 장기 효과의 결과 배아 발달에 영향을 미칠 수있다. 신뢰성 및 재현성 배아 전송 기술은 일관된 남자 주입 및 태아 발달에 실험적 치료 가능한 부정적 영향을 시험하는 데있어 매우 중요NER. 쥐의 착상 전 배아는 0.5 일 포스트 교미의 ampullae (DPC) pseudopregnant받는 사람 (난관 전송) 3.4 또는 2.5의 DPC pseudopregnant받는 사람의 자궁 (자궁 전송) 5,6를 통해 난관에 하나를받는 여성에 전송 될 수 자신의 발달 단계에 따라 달라집니다. 예컨대 배아 또는 유도 된 다 능성 줄기 세포를 주입하여 키메라 생쥐를 생성하기 위해 사용되는 것과 같은 포배기 배아에서는, 보통 자궁 전송함으로써 전송된다. 배반포는 0.5 DPC받는 사람의 난관에 전송 될 수 있지만, 배아 주입이 발생하기 전에 모욕 복구에 2 일이 휴면을 거치고 있기 때문에 그것은, 발달 장애 물질에 대한 덜 생리적 테스트를 구성한다. 자궁 입금 자궁 내강으로 배아 조작 피펫의 액세스를 허용하는 개구를 생성하기 위해 좁은 바늘 자궁벽을 천공 포함한다.lthough이 기술은 좋은 결과를 얻을 수 있습니다, 용어 생존 (즉, 강아지에 개발 이전 배아의 비율)는 종종 낮은 7,8 예측할 수있다. 자궁 벽의 구멍은 어떤 해로운 부작용을 수반한다. 먼저, 근육층은 매우 혈관 조직이며 천자 종종 작은 출혈 초래한다. 혈액은 배아 전송 피펫을 차단하거나 배아 사망 및 / 또는 주입 실패의 원인이되는 자궁 내강에 침입 할 수 있습니다. 혈액 세포와 파편이 할구에 연결할 수 소나없이 배아가 전송되는 경우에 특히 적합합니다. 배아가 전송 된 이후에 두 번째로, 수행 개구는 밀봉되지 않기 때문에, 그들은 오리피스를 역류하고 너무 큰 부피 자궁에 도입되었을 때 복강으로 추방 될 수있다. 설명 자궁 - 난관 배아 전송이 여기에 EMBR을 제공하기 위해 자궁 - 난관 접합을 활용자궁벽을 천공함으로써 그 불리한 결과 구를 피할 필요없이 자궁 YOS. 배아 전송에 사용되는 pseudopregnant받는 여성은 남성과 vasectomized 8 자연 교배에 의해 얻을 수있다. 불임 남성에 의해 생성 된 정액 분비는 전송 된 배아를 수용하게됩니다 자궁 필요합니다. 받는 사람을 얻으려면 세 6 개월 8 주 2 여성의 최대 값은 오후에과 vasectomized 남성으로 배치됩니다. 다음 날 아침, 여성은 질 성교 마개, 남성의 정액에서 응고 단백질의 덩어리의 존재를 확인합니다. 정합은 보통 자정 중에 발생할 때, 질 플러그 검출의 일 0.5 DPC 것으로 간주된다. 과 vasectomized 남성은 일부 업체에서 구입 할 수 있지만, 여기에 기술 된 수술은 비교적 간단하고 배아 전송에 필요 이상으로 추가 장비가 필요하지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>Ketamine</td><td>VEDCO</td><td>Ketaved ANADA 200-257</td><td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>Anased NADA #139-236</td><td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Generic</td><td>NDC 400-42-010-01</td><td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td></tr><tr><td>Eye ointment</td><td>Novartis</td><td>Genteal</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic</td><td>Pfizer</td><td>Clavamox NADA #55-101.</td><td>Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.</td></tr><tr><td>Dressing serrated forceps</td><td>ROBOZ</td><td>RS-8120</td><td>Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.</td></tr><tr><td>Microdissecting serrated forceps</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5137</td><td>These ones are curved at a 90&amp;ordm; angle. Straight forceps can be used if preferred.</td></tr><tr><td>Slight curved micro dissection forceps</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5136</td><td>This model is particularly useful to hold the oviduct.</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5880</td><td>Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.</td></tr><tr><td>27 G needles</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>305136</td><td>Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big.</td></tr><tr><td>Clip applier</td><td>MiKRon</td><td>42763</td><td></td></tr><tr><td>9 mm Clips</td><td>MiKRon</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>Clip remover</td><td>MiKRon</td><td>7637</td><td>Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.</td></tr><tr><td>Suture needle holder</td><td>ROBOZ</td><td>RS-7820</td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Dowist Gell</td><td>5-0 Dexon S 7204-21</td><td>Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.</td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>VWR</td><td>100 ul calibrated pipettes 53432-921</td><td>It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 &amp;#181;m filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy &lt;em&gt;et al&lt;/em&gt;.&lt;sup&gt;8&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Burner</td><td>KISAG AG</td><td>Typ 2002</td><td>Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZFLIII</td><td>This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fiber optics ilumination</td><td>Dolan Jenner</td><td>Fiber lite</td><td>To iluminate the surgical area. There are different systems available.</td></tr><tr><td>Warm stages</td><td>American scope</td><td>&lt;a href=&quot;https://exch.mail.umd.edu/owa/redir.aspx?C=1qTJKejamUSfudeYG_MlZHvTY3dsJM9Iaqr2SnwGD4ECWGzB8e8Rpg--_L7u0vJmyatXQJzGQ0k.&amp;amp;URL=http%3a%2f%2fstore.amscope.com%2ftcs-100.html&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://store.amscope.com/tcs-100.html&lt;/a&gt;</td><td>These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.</td></tr><tr><td>Culture dishes for embryo manipulation</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>351008 may be also used; they made narrower drops.</td></tr></tbody></table>

utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model

대리 여성에게 착상 전 배아의 전송은 성적인 변경의 효과는 이후의 태아 발달과 성인의 건강에 착상 전 개발 과정에서 발생한 연구하는 유전자 변형 마우스 또는 생산을위한 필수 단계입니다. 효과적이고 일관된 배아 전송 기술의 사용은 유전자 변형 동물의 생성을 향상시키고 주입 속도와 용어 생존에 다른 치료의 효과를 결정하기 위하여 중요하다. 배반포 단계의 배아는 일반적으로 배아 조작 피펫을 소개하는 자궁 벽에 구멍을 수행, 자궁 전송에 의해 전송됩니다. 피펫이 철회 된 후 자궁에서 수행 구멍이 닫히지 않습니다, 인해 자궁의 긍정적 인 압력에 복강에 배아 수 유출. 천자는 또한 주입을 손상 출혈을 생성 블록 전송 피펫 및 배아 D에 영향을 미칠 수 있습니다조나없이 배아가 전송 특히 evelopment. 따라서,이 기술은 종종 매우 변수 및 전반적인 낮은 배아 생존율가 발생합니다. 이러한 부정적인 효과를 방지, 자궁 - 난관 배아 전송 배아의 유출을 막는 자연 장벽 자궁 - 난관 접합을 활용하여 자궁 벽의 구멍을 피하십시오. 과 vasectomized 남성은 pseudopregnant받는 사람을 얻기 위해 필요합니다. 정관 수술을 수행 할 수있는 기술은 자궁 - 난관 배아 전송에 대한 보완 설명되어 있습니다.

자궁 - 난관 배아 전송은 자궁 배아 전송 2,9,10에 관련된 합병증을 방지 자궁에 배아를 전송하는 평균을 제공한다. 표 1에서 우리는 우리가 기술하는 프로토콜 다음 CD1받는 사람에게 조작의 종류를 실시 CD1의 배반포를 전송 얻은 몇 가지 대표적인 결과를 보여줍니다. 기간 (강아지의 결과로 태아의 %) 또는 (렌티 바이러스 노출의 경우) E15에 생존 생존은 수정란 단계 (IVC)에서 <em...

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Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model

자궁 - 난관 배아 입금 자궁 전송을 수행 할 때 발생할 수있는 배아 유출을 방지하는 장벽으로 자궁 - 난관 접합부를 사용한다. 과 vasectomized 남성은 배아 전송 pseudopregnant받는 사람을 얻기 위해 필요합니다. 두 가지 기술을 설명합니다.

마우스 모델에서 자궁 - 난관 배아 전송 및 정관

The transfer of preimplantation embryos to a surrogate female is a required step for the production of genetically modified mice or to study the effects ...

utero-tubal-embryo-transfer-and-vasectomy-in-the-mouse-model

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

47.6K 조회수.  United States Department of Agriculture.  자궁 - 난관 배아 입금 자궁 전송을 수행 할 때 발생할 수있는 배아 유출을 방지하는 장벽으로 자궁 - 난관 접합부를 사용한다. 과 vasectomized 남성은 배아 전송 pseudopregnant받는 사람을 얻기 위해 필요합니다. 두 가지 기술을 설명합니다. 

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

의 마우스 모델 Utero에 이식

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

연구

의학

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

마우스 Forebrain에 초음파 유도 Microinjection Utero에서 E9.5에서

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

신경과학

Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of lesions, and/or chronic pharmaceutical management of pain and infertility symptoms. The cost associated with endometriosis has been estimated at 22 billion dollars per year in the United States1. To further our understanding of mechanisms underlying this enigmatic disease, animal models have been employed. Primates spontaneously develop endometriosis and therefore primate models most closely resemble the disease in women. Rodent models, however, are more cost effective and readily available2. The model that we describe here involves an autologous transfer of uterine tissue to the intestinal mesentery (Figure 1) and was first developed in the rat3 and later transferred to the mouse4. The goal of the autologous rodent model of surgically-induced endometriosis is to mimic the disease in women. We and others have previously shown that the altered gene expression pattern observed in endometriotic lesions from mice or rats mirrors that observed in women with the disease5,6. One advantage of performing the surgery in the mouse is that the abundance of transgenic mouse strains available can aid researchers in determining the role of specific components important in the establishment and growth of endometriosis. An alternative model in which excised human endometrial fragments are introduced to the peritoneum of immunocompromised mice is also widely used but is limited by the lack of a normal immune system which is thought to be important in endometriosis2,7. Importantly, the mouse model of surgically induced endometriosis is a versatile model that has been used to study how the immune system8, hormones9,10 and environmental factors11,12 affect endometriosis as well as the effects of endometriosis on fertility13 and pain14.

A description of the surgical induction of endometriosis in mice and rats by auto-transplantation of uterine tissue to the arterial cascade of the intestinal mesentery.

자궁의 자동 이식하여 수술 유발 Endometriosis의 마우스 모델

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of ...

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

유전학

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances early in the gestation. The rationale behind IUT for therapeutic purposes is based on the small size of the fetus, the fetal immunologic immaturity, the accessibility and proliferative nature of the fetal stem or progenitor cells, and the potential to treat a disease or the onset of symptoms prior to birth. Taking advantage of these normal developmental properties of the fetus, the delivery of hematopoietic stem cells (HSC) via an IUT has the potential to treat congenital hematologic disorders such as sickle cell disease, without the required myeloablative or immunosuppressive conditioning required for postnatal HSC transplants. Similarly, the accessibility of progenitor cells in multiple organs during development potentially allows for a more efficient targeting of stem/progenitor cells following an IUT of viral vectors for gene therapy or genome editing. Additionally, IUT can be used to study normal developmental processes including, but not limited to, the development of immunologic tolerance. The murine model provides a valuable and affordable means to understanding the potential and limitations of IUT prior to pre-clinical large animal studies and an eventual clinical application. Here, we describe a protocol for performing an IUT in the murine fetus through intravenous and intra-amniotic routes. This protocol has been used successfully to elucidate the necessary conditions and mechanisms behind in utero hematopoietic stem cell transplantation, tolerance induction, and in utero gene therapy.

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

We describe a protocol for performing an in utero transplantation (IUT) through intravenous and intra-amniotic routes of injection in the murine model. This protocol can be used to introduce cells, viral vectors, and other substances into the unique immune-tolerant fetal environment.

정 맥 및 양수 내 Utero Murine 모델에 이식

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

발생학

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

토끼 모형에 있는 최적 배아 단계에서 최소 침 습 배아 이식 및 배아 확산

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Methods for Studying Uterine Contributions to Pregnancy Establishment in an Ovariectomized Mouse Model

For pregnancy to be established, a viable blastocyst must successfully interact with a receptive uterine lining (endometrium) to facilitate implantation and placenta formation and enable ongoing pregnancy. The limitations to pregnancy success caused by embryonic defects are well known and have been largely overcome in recent decades with the rise of in vitro fertilization (IVF) and assisted reproductive technologies. As yet, however, the field has not overcome the limitations caused by an inadequately receptive endometrium, thus resulting in stagnating IVF success rates. Ovarian and endometrial functions are closely intertwined, as hormones produced by the ovary are responsible for the endometrium's menstrual cyclicity. As such, when using rodent models of pregnancy, it can be difficult to ascertain whether an observed result is due to an ovarian or uterine deficit. To overcome this, an ovariectomized mouse model was developed with embryo transfer or artificial decidualization to allow the study of uterine-specific contributions to pregnancy. This article will provide instructions on how to perform ovariectomy and offer insights into various techniques for supplying exogenous hormones to support successful artificial decidualization or pregnancy following embryo transfer from healthy donors. These techniques include subcutaneous injection, slow-release pellets, and osmotic mini pumps. The key advantages and disadvantages of each method will be discussed, enabling researchers to choose the best study design for their specific research question.

Pregnancy establishment is a dynamic process involving complex embryo and uterine crosstalk. The precise contributions of the maternal uterine environment to these processes remain an active area of investigation. Here, detailed protocols are provided to aid in designing in vivo animal models to address these research questions.

난소 절제된 마우스 모델에서 임신 확립에 대한 자궁 기여도를 연구하는 방법

For pregnancy to be established, a viable blastocyst must successfully interact with a receptive uterine lining (endometrium) to facilitate implantation ...

<meta charset="utf8"></head><body>배아 발달을 연구하기 위한 Murine Round Spermatid Injection Procedure

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>마우스 라운드 Spermatid 주입

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

마우스 라운드 Spermatid 주입

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

마우스 모델에서 자궁 - 난관 배아 전송 및 정관

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의 마우스 모델 Utero에 이식

마우스 Forebrain에 초음파 유도 Microinjection Utero에서 E9.5에서

자궁의 자동 이식하여 수술 유발 Endometriosis의 마우스 모델

유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

정 맥 및 양수 내 Utero Murine 모델에 이식

토끼 모형에 있는 최적 배아 단계에서 최소 침 습 배아 이식 및 배아 확산

난소 절제된 마우스 모델에서 임신 확립에 대한 자궁 기여도를 연구하는 방법

마우스 라운드 Spermatid 주입

마우스 라운드 Spermatid 주입

마우스 라운드 Spermatid 주입