Portanto, é difícil separar o papel das influências hormonais uterinas e ovarianas no estabelecimento da gravidez, pois ambas estão intimamente ligadas. Então, esse protocolo nos permite examinar diretamente as contribuições uterinas. Embora algumas dessas técnicas, como a ooforectomia, sejam bastante invasivas, elas são relativamente simples de executar após a prática e o treinamento, o que as torna adequadas para pesquisadores que são novos em modelos de camundongos.
Assim, este método pode ser utilizado para entender a regulação mais ampla do eixo HPG, uma vez que tanto os ovários quanto o útero desempenham um papel importante na regulação desse eixo. Se você nunca realizou essas técnicas antes, consulte a equipe de veterinários do seu instituto para treinamento e suporte. Para começar, aplique lubrificante ocular generosamente em um rato anestesiado, passando-o suavemente no olho depois de raspar uma pequena área abaixo do palpite da coluna.
Injete 0,1 mililitros de carprofeno por via subcutânea no pescoço. Teste se o animal está anestesiado apertando o dedo do pé e verificando se há reflexo. Em seguida, aplique Betadine no local cirúrgico.
Em seguida, cubra com um campo cirúrgico. Usando pinça dentada de rato, puxe a pele no palpite para cima e faça uma incisão longitudinal de cinco milímetros. Em seguida, usando pinças rombas, disseque a pele longe da camada muscular subjacente para um lado em direção ao rim.
Identifique o rim, ovário e coxim de gordura ovariana através da parede muscular. Agarre e levante a camada muscular com a pinça. Em seguida, com tesoura, faça uma incisão de 0,5 a um centímetro de comprimento e puxe o coxim ovariano através da incisão com um par de pinças rombas.
Em seguida, com um porta-agulhas curvo, pinça por baixo do ovário e do oviduto na extremidade distal do corno uterino e excise o ovário com tesoura. Após 30 segundos, retire a pinça e passe com gaze estéril. Para fechar a incisão da parede muscular, levante o topo da incisão usando pinças.
Em seguida, amarre a incisão com um nó do cirurgião usando suturas de seda. Aplicar topicamente algumas gotas de bupivacaína usando uma seringa de um mililitro sem fixação da agulha e esfregar o excesso com gaze estéril. Depois de realizar a ooforectomia do outro lado, feche a incisão da pele pressionando os dois lados da pele juntos e aplicando um par de clipes cirúrgicos de sete milímetros, deixando espaço para o inchaço da ferida.
Coloque todo o equipamento necessário em uma folha dentro de um fluxo laminar ou capa de biossegurança Classe II e esterilize UV por 20 minutos. Lave a tubulação de silastic em 100% desinol e deixe secar ao ar livre dentro da coifa. Depois de seco, corte a tubulação em segmentos de um centímetro de comprimento usando um bisturi.
Em seguida, esprema aproximadamente 200 microlitros de selante em uma seringa sem êmbolo. Substitua o êmbolo e empurre uma pequena quantidade de selante. Aplique o selante em uma das extremidades da tubulação, alisando-a com um dedo enluvado.
E deixe o selante secar durante a noite ou sob luz UV por 30 minutos no capô. Em seguida, despeje o pó de progesterona em uma placa de Petri esterilizada. Coloque o pó em pellets com a ajuda de pinças.
Bata a extremidade selada do pellet na superfície do exaustor para condensar o pó. Em seguida, sele a extremidade aberta com o selante. Embrulhe a placa de Petri que contém os pellets em papel alumínio para protegê-los da luz.
Cerca de 72 horas antes da inserção subcutânea, ativar os pellets incubando-os em FCS descascado de carvão. Quem demonstrará esse procedimento será a Dra. Fiona Cousins, pesquisadora em início de carreira do Hudson Institute of Medical Research. Após o priming hormonal dos animais com injeções subcutâneas de estradiol, os animais foram preparados com pastilhas subcutâneas de progesterona dois dias antes da decidualização artificial.
Antes da cirurgia, anestesiar o camundongo e testar a profundidade da anestesia verificando o reflexo de pinça do dedo. Em seguida, coloque o rato em decúbito ventral, levante a cauda e insira lentamente um espéculo de seis milímetros em sua vagina. Coloque a parte inferior do corpo do mouse entre os dois primeiros dedos da mão não dominante.
Em seguida, usando o dedo indicador, empurre suavemente a cauda para cima para permitir uma melhor acessibilidade vaginal. Transfira 20 microlitros de óleo de gergelim para uma ponta de transferência de embriões não cirúrgica e insira a ponta através da vagina e do colo do útero no corno uterino. Expulse lentamente o óleo.
Uma vez feito, remova o espéculo da vagina. Neste estudo, 80% dos camundongos foram submetidos à decidualização bem-sucedida, enquanto 20% não o fizeram. Por isso, é importante manter todos os seus equipamentos cirúrgicos e áreas de trabalho estéreis e ter pacientes ao inserir o dispositivo AINEs através do colo do útero no corno uterino do rato.
Após a indução da decidualização artificial, o palato de progesterona pode ser removido para mimetizar a menstruação e estudar a degradação endometrial. Usando este método, podemos estudar a biologia e regulação uterina independente da influência dos ovários. Isso é realmente empolgante na área de fertilidade e saúde da mulher em geral.
