저자는 기술 지원 소피아 튀김 감사합니다. 보조금 no.1659/08, 971 / 08, 1503년부터 1508년까지 및 10분의 491, 아니 보조금 보건 및 과학의 사역에 대한 이스라엘 과학 재단 : MBS는 자신의 연구 지원을 위해 다음과 같은 기관을 감사드립니다. 3-4114과 3-6540, 후반 알렉산더 Smidoda의 부동산을 통해 이스라엘 암 협회와 바이오 의약품의 우수성 부여에 대한 Taubenblatt 패밀리 재단.

1. T-세포의 형질 <ol><li> Nucleofector 솔루션 키트의 &quot;보충&quot;솔루션을 혼합하여 활성화 Amaxa Nucleofector 솔루션을 준비합니다. 활성화 된 솔루션은 3 개월까지에 대해 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 문화 매체 인 Jurkat T 세포를 증가 【10 % 소 태아 혈청 (FCS), 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션, 2 RPMI에서 mM의 L-글루타민]. 최적의 세포는 1-2주 해동 후 사용한다. 로그 성장 세포 배양을 사용하여 높은 형질 전환 효율과 세포의 생존을 위해 매우 중요합니다. 또는 약간의 수정과 함께,이 프로토콜은 기본 T 세포와 함께 사용할 수 있습니다, 앞에서 8을 설명했다. 그것은 기본 T 세포의 활성화 과정의 기간 더 긴 인 Jurkat T 세포 (~ 30 분)보다 것을 강조되어야한다, 현미경 단계 배양 시스템은 CO 2, 전역 습도와 온도를 유지하는 데 사용해야 장착 활성화 프로세스입니다. </li><li> 5 수집15 ML 튜브에 형질 전환 당 × 10 6 로그 상 T 세포. </li><li> 400 7 분 × g, 실온에서를위한 세포를 원심 분리기. </li><li> 원심 분리하는 동안 6 잘 플레이트를 준비합니다. 37 5 ML 문화 매체 및 사전 부화 각 형질에 대해 잘 하나를 채울 ° C. </li><li> 원심 분리기에서 튜브를 수집하고 상층 액을 버린다. 1 ML RPMI에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 400 7 분 × g, 실온에서를위한 세포를 원심 분리기. </li><li> 원심 분리하는 동안 형질 솔루션을 준비합니다. 96 - 웰 플레이트 잘 하나, 찬란 태그 단백질을 코딩 관심 플라스미드의 5 μg의 DNA와 1 단계에서 제조 된 활성화 100 μl의 Amaxa Nucleofector 솔루션을 섞는다. 최적의 DNA 농도는 형질 솔루션을 희석 방지하기 위해 1 ㎍ / ㎖보다 커야합니다. </li><li> 부드러운 피펫으로 잘 섞는다. </li><li> 세포 원심 분리 한 후,주의 깊게 상층 액을 제거 D되지 동안펠렛을 isturbing. </li><li> DNA / 형질 전환 솔루션 두번을 피펫. </li><li> 펠렛의 DNA / 형질 전환 솔루션을 추가합니다. </li><li> Amaxa 큐벳에 세포를 전송합니다. </li><li> Amaxa Nucleofector 장치에 큐벳을 삽입합니다. </li><li> electroporation을위한 H-10 Amaxa의 형질 설정 (인 Jurkat) 또는 T-23 (기본 T 세포)를 사용합니다. </li><li> 인큐베이터에서 6 잘 플레이트를 제거합니다. </li><li> electroporation에 따라주의 깊게 파스퇴르 피펫을 사용하여 6 잘 플레이트에 세포 현탁액에 뜨는을 전송합니다. 세포 파편으로 구성된 펠렛이 형성 될 수 있습니다. 펠렛을 전송하지 마십시오. </li><li> 37 24 시간 동안 세포를 품어 ° C. </li><li> 새로운 우물에 각 우물에서 세포 현탁액의 2.5 ML을 전송합니다. 각 well에 2.5 ML 따뜻한 문화 매체 (2 단계에서 설명)를 추가합니다. </li><li> 72 시간 후 400 7 분 × g, 실온에서 대한 멸균 튜브와 원심 분리기에 세포를 전송합니다. 뜨는을 취소하고이를 위스콘신 교체사용되는 플라스미드에 적합한 포유류 세포 선택 항생제 (, 우리는 각각 1.3 밀리그램 / ML 및 / 또는 0.2 밀리그램 / ML의 농도 G418 및 / 또는 그로 마이신을 사용하는 데 사용되는 항생제에 적합한 농도를 적용) 보충 번째 배지. 신선한 잘있는 문화 세포 현탁액. 또한, 세포는 일시적으로 형질 전환 및 형질 전환 후 48 시간을 이미지 할 수 있습니다. 일시적으로 형질 전환 된 세포를 준비하려면 20 단계로 일반적으로 계속 8 단계에서 동시에 두 개의 플라스미드와 세포를 공동 형질하고 23 단계로 없습니다. 이 시나리오에서, 세포가 즉시 사용되어야합니다, 일반적으로 자신의 형광 강도는 이기종 반드시 높지 않다. </li><li> 적절한 선택 항생제가 첨가 배지로 세포를 성장. 세포를 분리하고 필요에 따라 항생제 첨가 배지와 함께 그들을 보충합니다. </li><li> 이주 후 FACS의 사용 (독감 성공적으로 형질을 확인로 orescence - 활성화 된 셀 정렬은) 다음 : </li><li> 10 6 형질 전환 세포 10 6 모의 형질 세포 (대조군), 그리고 안정적으로 찬란 태그 단백질을 표현하는 것으로 알려져있다 10 6 세포를 수집합니다. 세포가 하나 이상의 형광 단백질 (27 단계 참조) 형질 전환되는 경우에, 긍정적 인 컨트롤 등 여러 단독 태그 세포 라인을 사용합니다. </li><li> 400 7 분 × g, 실온에서를위한 세포를 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 버린다. 500 μL FACS 버퍼 (PBS W / O 칼슘 2 +와 마그네슘 2 + 5 % FCS, 0.05 % 나트륨 아 지드)에있는 세포를 resuspend. </li><li> 세포의 형광을 확인 분석 FACS를 사용합니다. 부정과 긍정적 인 컨트롤의로 형질 전환 된 세포의 형광을 비교합니다. </li><li> 형질 전환 된 세포를 사용하여 추가, 찬란 태그 단백질의 단계를 반복 3-26과 세포를 형질합니다. </li><li> 형광의 높은 수준을 표시하는 셀이 사용되어야한다. 의 최적, 최소 50 %문화의 세포가 높은 형광해야한다. 세포의 형광 FACS를 통해 세포 분류에 의해 증가 될 수있다. </li></ol> 모든 추가 태그 단백질은 서로 다른 형광 물질에 융합되어야하며, 다른 선택의 항생제 인코딩 플라스미드에 인코딩. 하나 이상의 플라스미드로 형질 전환 된 세포를 선택하는 매체는 모든 적절한 항생제로 보충해야한다. 2. T 세포 확산 분석 준비 <ol><li> 실험실 테크 II 독일어 커버 글라스 시스템 4 챔버 슬라이드를 사용합니다. 실수로 준비 또는 사용 중 피펫 팁 예를 들어 챔버의 내부 표면, 스크래치하지 않도록합니다. </li><li> 50-ML 슬라이드 준비 솔루션을 준비 : 12 M (37 %), 염산 4.6 mL를 취하여, 38.5 ML 100 % 에탄올 6.9 ML 이중 증류수를 추가합니다. </li><li> 500 μL 슬라이드 준비 솔루션 슬라이드의 각 챔버를 채우십시오. </li><li> 10 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 챔버 흡입의, 완전히 건조. </li><li> ° C까지 완전히 건조 45 1 시간 동안 폭로 슬라이드를 품어. </li><li> 이중 증류수에 0.1 % 폴리-L-라이신 (시그마 - 알드리치)을 희석하여 0.01 % 폴리-L-라이신 솔루션을 준비합니다. </li><li> 각 챔버에 500 μl를 적용합니다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 슬라이드를 품어. </li><li> 그들을 완전히 건조 챔버를 대기음. </li><li> ° C까지 완전히 건조 45 3 시간 동안 품어. </li><li> 코팅 된 슬라이드는 실온에서 몇 달 동안 건조 저장할 수 있습니다. </li><li> 활성화 항체 솔루션을 준비합니다. HIT3a (BD Pharmingen, # 555337) 또는 UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 챔버 당 400 ㎕의 PBS에서 10 ㎍ / ㎖ 하나 : 항 CD3 항체를 사용합니다. 이 솔루션은 곧 슬라이드 준비하기 전에 준비를해야합니다. </li><li> 활성화 항체 용액 400 μL 각 챔버를 채우십시오. </li><li> 4에서 하룻밤, 바람직하게는 37 ° C 또는에서 2 시간 동안 슬라이드를 품어 ° C. </li><li> 활성화 항체 졸 제거ution 즉시 300 μL PBS로 두 번 실을 씻는다. 이 시점에서, 실이 버퍼로 가득 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 4 ℃에서 PBS - 채워진 슬라이드를 저장 우리는 1 주 안에 준비된 슬라이드 챔버를 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol> 3. T 세포 활성화 및 이미징 <ol><li> [1.25 ML의 HEPES (1 M) 10 ㎖ FCS, 38.75 ML RPMI 페놀 레드없이] 이미지 버퍼를 준비합니다. 이미지 버퍼는 4 ° C 후 여과에 저장할 수 있습니다. </li><li> 자이스 혈구 LSM 510 메타 현미경을 활성화합니다. 37 현미경 가열이 장착 프레임을 따뜻하게 ° C. &quot;전문가 모드&quot;를 선택합니다. </li><li> &quot;취득&quot;탭을 클릭하고 다음 탭을 엽니 레이저, 현미경, 구성, 검사, 시간 시리즈. </li><li> 필요한 레이저를 활성화합니다. MCFP 및 mYFP의 자극에 대한 다음 &quot;의&quot;5 분 &quot;대기&quot;로 아르곤 / 2 레이저가 설정합니다. </li><li> 당신은 같은 형광체를 사용하기 전에이 라이브 세포 이미징 분석을 수행 한 경우, 결과 LSM 파일을 열고, 나는 &quot;재사용&quot;을 클릭사기꾼, 9 단계에서 계속합니다. 그렇지 않으면 6 단계에서 계속합니다. </li><li> 사용 된 형광 단백질의 여기 및 방출에 대한 적절한 필터를 사용하여 채널을 정의합니다. </li><li> &quot;스캔 제어&quot;창에서, Z 스택 옵션을 선택합니다. </li><li> 0.5 μm의, 현재 조각 : 3; 슬라이스 번호 : 간격 5 다음 검색 매개 변수를 입력합니다. </li><li> 현미경 근처에 37 Accublock 디지털 건조한 목욕 (Labnet) ° C를 준비합니다. </li><li> 37 ° C.에 이미지 버퍼를 따뜻하게 </li><li> 따뜻한 이미지 버퍼 600 μL로 대체, PBS를 흡입하여 저장된 슬라이드를 준비합니다. </li><li> 37 슬라이드를 품어 ° C. 13 단계까지 적어도 15 분 동안 인큐베이터에서 슬라이드를 유지합니다. </li><li> 5를 수집 × 10 5 형질 전환 된 T 세포를. </li><li> 400 × g에서 2 분간 세포를 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 버린다. </li><li> 1 ML 따뜻한 이미지 버퍼에있는 세포를 resuspend하고, 1.5 ML 에펜 도르프 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> t를 놓고Accublock 디지털 건조한 목욕에 동부 표준시 관. </li><li> 인큐베이터에서 따뜻하게 슬라이드를 가지고, 예열 현미경 장착 프레임에 마운트합니다. </li><li> &quot;VIS&quot;아이콘을 클릭합니다. </li><li> 세포 현탁액을 혼합하고 1-2 μl를 제거합니다. </li><li> 슬라이드의 하단에 위의 이미지 버퍼에 피펫의 팁을 삽입합니다. 슬라이드가 긁히지 않도록. </li><li> 목표의 구멍에 씨앗 세포를. </li><li> 그들이 내려 가면 즉시 시각적으로 형광 세포를 추적을 시작합니다. 두 채널에서 높은 형광을 표시하는 셀을 선택합니다. </li><li> 셀이 슬라이드의 표면에 도달하기 전에, LSM 모드를 활성화합니다. </li><li> 단 하나의 여기 레이저를 전환합니다. 당신은 DIC 채널을 가지고있는 레이저를 선택합니다. </li><li> 1로 줌을 설정합니다. &quot;빠른 XY&quot;아이콘을 클릭합니다. &quot;정지&quot;아이콘을 클릭합니다. 자르기 도구를 사용하여 셀을 중심으로 투자 수익 (ROI)을 선택합니다. </li><li> 3 줌을 설정합니다. &quot;빠른 XY&quot;아이콘을 클릭 한 다음 수동으로 최적의 셀을 볼 포커스를 설정합니다. &quot;정지&quot;ICO을 클릭N. </li><li> 모든 필요한 여기 레이저를 전환합니다. </li><li> &quot;StartT&quot;아이콘을 클릭하여 녹음을 시작합니다. 이미지 확산 과정 (일반적으로 5 분)의 전체 셀을. 완료되면, &quot;정지&quot;아이콘을 클릭합니다. </li><li> 파일을 저장합니다. </li><li> 추가 세포를 획득하려면 &quot;VIS&quot;아이콘을 클릭합니다. 아직 슬라이드의 바닥에 접촉하지 않은 세포가있는 경우, 23 단계에서 계속합니다. 이미 확산 과정을 시작했습니다 이미징 세포를 피할 수 있습니다. 그렇지 않으면 32 단계로 진행합니다. </li><li> 관찰 슬라이드 영역이 세포의 대부분이없는 경우, 셀 (20 단계부터 계속합니다)의 또 다른 나누어지는을 추가합니다. 그렇지 않으면 33 단계로 진행합니다. </li><li> 추가 세포를 얻으려면 목적의 구멍 위의 영역이 세포의 결여되도록 슬라이드를 이동합니다. </li><li> 세포 (및 20 단계에서 계속) 다른 나누어지는을 추가합니다. </li><li> 원하는 모든 이미지를 수행 한 후, 저장된 LSM 파일을 엽니 다. </li><li> &quot;갤러리&quot;, &quot;시간 + Z&quot;와 &quot;부분&quot;을 클릭합니다. </li><li> relevan을 선택t 시간 범위와 Z 스택. </li><li> 새 파일을 저장합니다. </li><li> 모든 이미지 파일에 대한 단계 35-38를 수행합니다. </li></ol> 4. 영상 데이터 분석 <ol><li> Imaris 소프트웨어 (비트 플레인 AG, 취리히 스위스)를 사용하여 LSM 파일을 엽니 다. </li><li> &quot;능가&quot;을 클릭합니다. &quot;이미지 프로세싱&quot;메뉴를 클릭하고 &quot;시간과 Z 스왑&quot;를 선택합니다. 이 이미지의 정확한 자르기에 도움이 될 것입니다. </li><li> &quot;편집&quot;도구 모음을 클릭하고 드롭 메뉴에서 &quot;자르기 3D&quot;옵션을 선택합니다. 세포를 둘러싸고있는 영역 만 포함하도록 이미지를 자르. 우리는 셀을 중심으로 300 × 300 픽셀의 사각형을 자르기 좋습니다. 세포의 모양과 위치가 시간이 지남에 따라 변경 될 수 있습니다. t 축을 관찰하면 세포가 모든 시간 지점에서 자른 영역 내에 있는지 확인합니다. </li><li> &quot;이미지 프로세싱&quot;메뉴를 클릭하고 이미지의 원래 시간적 분리를 복원하는 &quot;시간과 Z 스왑&quot;를 선택합니다. </li><li> 기본 도구 모음에서 &quot;Coloc&quot;버튼을 누르십시오. &quot;데 시간 빌드를 선택P. Coloc. &quot;Imaris는 각 시점에서 각 채널에 대한 강도 임계 값을 계산합니다. </li><li> &quot;채널 통계&quot;를 선택하여 colocalization을 분석의 결과를 볼 수 있습니다. &quot;내보내기&quot;를 클릭하여 데이터를 내 보냅니다. </li><li> 각 군데 셀에 대해 6 단계를 반복합니다. 우리는 적어도 50 세포가 이러한 방식으로 분석하는 것이 좋습니다. </li><li> 평균 피어슨의 colocalization을 계수 및 표준 오류 또는 편차를 계산합니다. </li></ol>

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우리는 공개 할 관심 없음 충돌이 없습니다.

여러 세포 프로세스의 규제 기능은 단백질 - 단백질 상호 작용의 형성 및 종료에 따라 달라집니다. 현미경 영상은 살아있는 세포에서 찬란 태그 단백질의 실시간 추적을 할 수 있습니다. 태그 단백질의 colocalization을이 단백질 사이의 직접 또는 간접적으로 상호 작용을 제안 할 수 있습니다, 그리고 면역 침전 등의 생화학 적 방법에 의해 얻어진 결과를 강화하는 데 사용할 수 있습니다. 생화학 적 ?...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagent/Material&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Amaxa human T Cell nucleofector kit</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Anti CD3 (UCHT1 clone) </td><td>BioLegend</td><td>300432</td><td></td></tr><tr><td>Falcon FACS Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Calbiochem</td><td>345810</td><td></td></tr><tr><td>German coverglass system 4 chamber slides </td><td>Lab-Tek II</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Bio Lab</td><td>8410501</td><td></td></tr><tr><td>Hepes </td><td>Biological Industries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Hygomycin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-306</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine </td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin </td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R87589</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>Accublock digital dry bath</td><td>Labnet</td><td>D1105A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta</td><td></td></tr><tr><td>Heatable mounting frame - Heating Insert P S </td><td>PeCon</td><td>130-800-031</td><td></td></tr><tr><td>TempModule S (required for the heatable mounting frame)</td><td>Zeiss</td><td>411860-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation device</td><td>Amaxa</td><td>Nucleofector I</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence activated cell sorter</td><td>Becton Dickinson</td><td>FACSVantage SE</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Bitplane</td><td>7.0.0</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time live imaging of t-cell signaling complex formation

전염성 질병에 대한 보호는 면역 시스템 1,2에 의해 중재된다. T 림프구는 여러 면역 세포 3,4의 활성화와 반응을 조절, 면역 시스템의 마스터 코디네이터입니다. T-세포의 활성화는 항원 제시 세포 (APC를)에 의해 표시되는 특정 항원의 인식에 따라 달라집니다. T 세포 항원 수용체 (TCR)는 각 T 세포 클론에 특정한 항원 특이성 5를 결정합니다. 항원에 TCR의 바인딩은 TCR 복합 구성 요소의 인산화를 유도합니다. T 세포 활성화를 촉진하기 위해이 신호는 같은 TCR에 신호 단백질의 모집 등 다양한 중요한 응답을 시작, 막의 세포질과 핵 형질해야하며 APC 사이트 (면역 시냅스), 자신의 분자 활성화, 골격 재 배열, 세포 내 칼슘 농도의 상승, 유전자 발현 6,7의 변화. 에서 올바른활성화 신호의 itiation 및 종료 적절한 T 세포 반응을 위해 매우 중요합니다. 신호 단백질의 활동은 단백질 - 단백질 상호 작용의 형성과 종료에 따라 달라집니다, 이러한 단백질 인산화 단백질 복합체, 단백질의 ubiquitylation 다양한 휴대 사이트 8 단백질의 모집 형성으로 번역 수정을 게시 할 수 있습니다. T-세포 활성화 과정의 내부 동작을 이해하는 것은 면역 학적 연구와 임상 응용 프로그램 모두에 매우 중요합니다. 다양한 분석은 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하기 위해 개발되었습니다, 그러나, 널리 사용되는 공동 immunoprecipitation의 방법으로 생화학 적 분석은, 따라서 세포의 역학에 대한 귀중한 통찰력의 관찰을 배제, 단백질의 위치가 식별 될 수 없습니다 메커니즘. 또한 이러한 대량 분석은 일반적으로 t의 다른 단계에있을 수있는 많은 다른 세포에서 단백질을 결합그는 세포 프로세스를 조사 하였다. 이 시간 해상도에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 살아있는 세포의 실시간 영상의 사용은 따라서 공정 9,10의 역학에 빛을 흘리는, 단백질의 공간적 추적 및 시간적 신호 이벤트를 구별 할 수있는 능력을 모두 할 수 있습니다. 우리는 T 세포 활성화 중에 신호 복잡한 형성의 실시간 영상의 방법을 제시한다. 기본 T 세포 또는 인 Jurkat 같은 T - 세포 라인, 비 생리적 인 올리고머 11을 방지 단량체 형광 단백질에 융합 관심의 단백질에 대한 인코딩 플라스미드 형질 전환됩니다. 라이브 T 세포는 특정 활성화 항원에 대한 필요성을 극복하면서 T 세포의 활성화를 유도 CD3/TCR 복합체에 결합 T-세포 활성화 항체 8,9와 coverslip을 미리 코팅을 통해 삭제됩니다. 활성화 된 세포는 지속적으로 공 촛점 현미경의 사용으로 몇 군데 있습니다. 영상 데이터는 COL과 같은 정량적 인 결과를 산출하기 위해 분석신호 단백질의 ocalization 계수.

우리는 살아있는 T 세포 이미징 및 분석의 예를 제시한다. 영상 실험에 앞서, SLP76 결핍 T 세포 (J14)는 형광 단백질 (그림 1)의 발현을 결정하는 FACS의 사용으로 분석 하였다. 태그 신호 단백질 MCFP - NCK와 SLP76-mYFP로 형질 전환 된 T 세포는 활성화 슬라이드를 통해 입금 및 T 세포의 확산 (그림 2) 중 몇 군데 있었다. 수집 된 이미지 활성화 및 (그림 3) 확산을 통해 단...

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Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

우리는 T 세포 활성화 과정 중에 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공하는 라이브 세포 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 정량적 인 결과는 T 세포 활성화에 걸쳐 복잡한 형성 신호를 따라 열매를 산출하는 T 세포의 확산 분석, 공 촛점 현미경 및 이미징 분석의 결합 사용을 보여줍니다.

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

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13.6K 조회수.  Bar-Ilan University. 우리는 T 세포 활성화 과정 중에 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공하는 라이브 세포 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 정량적 인 결과는 T 세포 활성화에 걸쳐 복잡한 형성 신호를 따라 열매를 산출하는 T 세포의 확산 분석, 공 촛점 현미경 및 이미징 분석의 결합 사용을 보여줍니다.

비디오: Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

연구

면역학 및 감염병학

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the structure-function relationship of these receptors in situ, we need to visualize and track them on the live cell surface with enough spatiotemporal resolution. Here we show how to use recently developed Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) to image T-cell receptors (TCRs) four-dimensionally (4D, space and time) at the live cell membrane. T cells are one of the main effector cells of the adaptive immune system, and here we used T cells as an example to show that the signaling and function of these cells are driven by the dynamics and interactions of the TCRs. LLSM allows for 4D imaging with unprecedented spatiotemporal resolution. This microscopy technique therefore can be generally applied to a wide array of surface or intracellular molecules of different cells in biology.

The goal of this protocol is to show how to use Lattice Light-Sheet Microscopy to four-dimensionally visualize surface receptor dynamics in live cells. Here T cell receptors on CD4+ primary T cells are shown.

격자 광 시트 현미경을 사용하여 표면 T 세포 수용체 역학 4 차원 시각화

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

생화학

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological synapse, a stereotyped cell-cell junction that regulates T cell activation and directionally targets effector responses. To study these processes effectively, an imaging approach that is tailored to capturing fast, polarized responses is necessary. This protocol describes such a system, which is based on a photoactivatable peptide-major histocompatibility complex (pMHC) that is non-stimulatory until it is exposed to ultraviolet light. Targeted decaging of this reagent during videomicroscopy experiments enables precise spatiotemporal control of TCR activation and high-resolution monitoring of subsequent cellular responses by total internal reflection (TIRF) imaging. This approach is also compatible with genetic and pharmacological perturbation strategies. This allows for the assembly of well-defined molecular pathways that link TCR signaling to the formation of the polarized cytoskeletal structures that underlie the immunological synapse.

This protocol describes an imaging-based method to activate T lymphocytes using photoactivatable peptide-MHC, enabling precise spatiotemporal control of T cell activation.

Photoactivatable 길 항 제를 사용 하 여 T 세포 활성화의 공간 및 시간 제어

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시 냅 스 인터페이스의 평가

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Imaging the Human Immunological Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) and an effector helper T lymphocyte (Th) cell, and to record the images corresponding to the first stages of the IS formation and the subsequent trafficking events (occurring both in the APC and in the Th cell). These events will eventually lead to polarized secretion at the IS. In this protocol, Jurkat cells challenged with Staphylococcus enterotoxin E (SEE)-pulsed Raji cells as a cell synapse model was used, because of the closeness of this experimental system to the biological reality (Th cell-APC synaptic conjugates). The approach presented here involves cell-to-cell conjugation, time-lapse acquisition, wide-field fluorescence microscopy (WFFM) followed by image processing (post-acquisition deconvolution). This improves the signal-to-noise ratio (SNR) of the images, enhances the temporal resolution, allows the synchronized acquisition of several fluorochromes in emerging synaptic conjugates and decreases fluorescence bleaching. In addition, the protocol is well matched with the end point cell fixation protocols (paraformaldehyde, acetone or methanol), which would allow further immunofluorescence staining and analyses. This protocol is also compatible with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and other state-of-the-art microscopy techniques. As a main caveat, only those T cell-APC boundaries (called IS interfaces) that were at the right 90&#176; angle to the focus plane along the Z-axis could be properly imaged and analyzed. Other experimental models exist that simplify imaging in the Z dimension and the following image analyses, but these approaches do not emulate the complex, irregular surface of an APC, and may promote non-physiological interactions in the IS. Thus, the experimental approach used here is suitable to reproduce and to confront some biological complexities occurring at the IS.

This protocol images both the immunological synapse formation and the subsequent polarized secretory traffic towards the immunological synapse. Cellular conjugates were formed between a superantigen-pulsed Raji cell (acting as an antigen-presenting cell) and a Jurkat clone (acting as an effector helper T lymphocyte).

인간 면역학적 시냅스 이미징

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

<meta charset="utf8"></head><body>T 세포에서 Ca2+ 마이크로도메인을 검출하기 위한 고분해능 이미징 기법

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Unraveling the Initial Activation of the Adaptive Immune Response for Therapeutic Intervention

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

일차 T 세포에서 초기 Ca2+ 마이크로도메인 이미징

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...