Die Autoren danken Sophia Fried für die technische Unterstützung. MBS dankt den folgenden Organisationen für ihre Unterstützung der Forschung: Die Israel Science Foundation für Finanzhilfen no.1659/08, 971/08 1503/08 und 491/10, die Ministerien für Gesundheit &amp; Science Zuschüsse Nr. 3-4114 und 3-6540, die Israel Cancer Association durch das Anwesen des verstorbenen Alexander Smidoda und die Taubenblatt Family Foundation für die Bio-Medizin Exzellenz Zuschuss.

1. T-Zell-Transfektion <ol><li> Bereiten Sie die aktivierten Amaxa Nucleofector Lösung durch Mischen des Kits &quot;Nachtrag&quot; Lösung des Nucleofector Lösung. Die aktivierte Lösung kann bei 4 ° C für bis zu drei Monate gelagert werden. </li><li> Wachsen Jurkat-T-Zellen in Kulturmedium [10% fötalem Kälberserum (FCS), 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung und 2 mM L-Glutamin in RPMI]. Optimalerweise sollten die Zellen 1-2 Wochen nach dem Auftauen verwendet werden. Mit Zellkulturen in der logarithmischen Wachstum ist entscheidend für hohe Transfektionseffizienz und das Überleben der Zelle. Alternativ, mit geringfügigen Modifikationen, dieses Protokoll mit primären T-Zellen verwendet werden, wie zuvor 8 beschrieben. Es sollte betont werden, dass die Dauer der Aktivierung von primären T-Zellen ist länger als die von Jurkat-T-Zellen (~ 30 min), montiert ein Mikroskoptisch Inkubation zu verwenden ist, um CO 2, Feuchtigkeit und Temperatur während der gesamten, werden Aktivierung. </li><li> Sammeln Sie 510 × 6 log-Phasen-T-Zellen pro Transfektion in einer 15-ml-Tube. </li><li> Zentrifuge Zellen für 7 min bei 400 × g bei Raumtemperatur. </li><li> Bei der Zentrifugation Herstellung einer 6-Well-Platte. Füllen man gut für jede Transfektion mit 5 ml Kulturmedium und Pre-Inkubation bei 37 ° C. </li><li> Sammeln Sie die Rohre aus der Zentrifuge und den Überstand verwerfen. Zellpellet in 1 ml RPMI. </li><li> Zentrifuge Zellen für 7 min bei 400 × g bei Raumtemperatur. </li><li> Während des Laufs wird, bereiten Sie die Transfektion Lösung. In einer Vertiefung einer 96-Well-Platte, mischen aktiviert 100 ul Amaxa Nucleofector Lösung in Stufe 1 mit 5 ug DNA des Plasmids von Interesse Codieren eines fluoreszenzmarkierten Protein hergestellt. Optimalerweise sollte DNA-Konzentration größer als 1 g / ml, um zu vermeiden Verdünnen der Transfektion Lösung. </li><li> Gut mischen durch vorsichtiges Pipettieren. </li><li> Nach der Zentrifugation der Zellen, entfernen Sie vorsichtig den Überstand während alle nicht disturbing das Pellet. </li><li> Pipettieren Sie die DNA / Transfektionslösung zweimal. </li><li> Fügen Sie die DNA / Transfektionslösung dem Pellet. </li><li> Übertragen Sie die Zellen an die Amaxa Küvette. </li><li> Setzen Sie die Küvette in die Amaxa Nucleofector Gerät. </li><li> Verwenden Sie den H-10 Amaxa Transfektion Einstellung für die Elektroporation (für Jurkat) oder T-23 (für die primäre T-Zellen). </li><li> Entfernen Sie die 6-Well-Platte aus dem Inkubator. </li><li> Nach der Elektroporation wurden sorgfältig den Überstand mit der Zellsuspension in den 6-well-Platte mit einer Pasteurpipette. Ein Pellet aus Zelltrümmern bilden. Vermeiden Sie die Übertragung der Pellets. </li><li> Inkubieren der Zellen für 24 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Übertragen 2,5 ml Zellsuspension aus jeder Vertiefung in eine neue gut. Fügen Sie 2,5 ml warmem Kulturmedium (siehe Schritt 2) in jede Vertiefung. </li><li> Nach 72 h, übertragen die Zellen in ein steriles Röhrchen und zentrifugieren 7 min bei 400 × g bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und ersetzen Sie es with Kulturmedium mit der Säugetierzelle Selektionsantibiotikum die für das verwendete Plasmid (Anwendung einer geeigneten Konzentration der Antibiotika, verwendeten wir G418 und / oder Hygromycin in Konzentrationen von 1,3 mg / ml und / oder 0,2 mg / ml) ergänzt. Kultur die Zellsuspension in einem frischen gut. Alternativ können Zellen, die transient transfiziert und 48 abgebildet h nach der Transfektion. Transient transfizierte Zellen herzustellen, Co-Transfektion der Zellen mit den beiden Plasmiden gleichzeitig mit Schritt 8 fortgesetzt normalerweise zu Schritt 20, und fahren direkt mit Schritt 23 fort. Man beachte, dass in diesem Fall wird die Zellen sofort verwendet werden, und in der Regel ihre Fluoreszenzintensität ist heterogen und nicht notwendigerweise hoch. </li><li> Wachsen die Zellen mit Kulturmedium mit der entsprechenden Auswahl Antibiotikum ergänzt. Teilen Sie die Zellen und ergänzen sie mit Antibiotika ergänzt Kulturmedium nach Bedarf. </li><li> Nach 2 Wochen, ob erfolgreiche Transfektion mit dem Einsatz von FACS (Grippeorescence-activated cell sorting) wie folgt: </li><li> Sammeln 10 6 transfizierten Zellen 10 6 mock-transfizierten Zellen (negative Kontrolle) und 10 6 Zellen, die bekanntermaßen stabil exprimieren fluoreszenzmarkierten Proteins. Wenn Zellen mit mehr als einem fluoreszierenden Protein (siehe Schritt 27), transfiziert werden, verwenden mehrere, einzeln markierten Zelllinien als positive Kontrollen. </li><li> Zentrifuge Zellen für 7 min bei 400 × g bei Raumtemperatur. </li><li> Überstand verwerfen. Die Zellen in 500 ul FACS-Puffer (PBS w / o Ca 2 + und Mg 2 +, 5% FCS, 0,05% Natriumazid). </li><li> Mit einer analytischen FACS, um zelluläre Fluoreszenz überprüfen. Vergleichen der Fluoreszenz der transfizierten Zellen mit dem der negative und positive Kontrollen. </li><li> Um die Zellen mit einem zusätzlichen, fluoreszenzmarkierten Protein, wiederholen Sie die Schritte 3-26 mit den transfizierten Zellen transfiziert. </li><li> Zellen, die hohe Niveaus der Fluoreszenz verwendet werden. Optimalerweise mindestens 50%die Zellen in der Kultur sollte stark fluoreszierend. Handy Fluoreszenz kann durch Zellsortierung via FACS erhöht werden. </li></ol> Etwaige zusätzliche markierte Proteine ​​müssen unterschiedlichen Fluorophoren fusioniert werden und auf Plasmiden für verschiedene Selektionsantibiotika codiert werden. Selektionsmedium für Zellen mit mehr als einem Plasmid transfiziert ist mit allen geeigneten Antibiotika ergänzt werden. 2. T-Zell-Spreading Assay Vorbereitung <ol><li> Verwenden Sie Lab-Tek II Deutsch Deckglas System 4 Kammer-Objektträgern. Achten Sie darauf, nicht versehentlich zerkratzen die innere Oberfläche der Kammern, mit einer Pipettenspitze zB während der Herstellung oder Verwendung. </li><li> Bereiten 50-ml Objektträgervorbereitung Lösung: Nehmen Sie 4,6 ml 12 M (37%) HCl, fügen 38,5 ml 100% Ethanol und 6,9 ml doppelt destilliertes Wasser. </li><li> Füllen Sie jede Kammer der Rutsche mit 500 ul Objektträgervorbereitung Lösung. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Saugen Sie die Kammers, Trocknen sie vollständig. </li><li> Inkubieren Sie die unbedeckten Folien für 1 Stunde bei 45 ° C bis vollständig trocken. </li><li> Bereiten 0,01% Poly-L-Lysin-Lösung durch Verdünnen 0,1% Poly-L-Lysin (Sigma-Aldrich) in doppelt destilliertem Wasser. </li><li> Bewerben 500 ul zu jeder Kammer. </li><li> Den Objektträger für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Saugen Sie die Kammern, Trocknen sie vollständig. </li><li> Inkubationszeit von 3 h bei 45 ° C bis vollständig trocken. </li><li> Beschichtete Objektträger gespeichert für mehrere Monate bei Raumtemperatur trocken sein. </li><li> Bereiten Sie eine aktivierende Antikörper-Lösung. Verwenden Sie ein Anti-CD3-Antikörper: entweder HIT3a (BD Pharmingen, # 555337) oder UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 10 ug / ml in 400 ul PBS pro Kammer. Diese Lösung sollte kurz vor der Präparation der Objektträger hergestellt werden. </li><li> Füllen Sie jede Kammer mit 400 ul des aktivierenden Antikörper-Lösung. </li><li> Den Objektträger für 2 Stunden bei 37 ° C oder, vorzugsweise, über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie die aktivierende Antikörper solution und sofort abwaschen die Kammer zweimal mit 300 ul PBS. Ab diesem Zeitpunkt sicher, dass die Kammern mit Puffer gefüllt bleiben. </li><li> Bewahren Sie die PBS-gefüllten Folie bei 4 ° C. Wir empfehlen die Verwendung der vorbereiteten Objektträger Kammern innerhalb 1 Woche. </li></ol> 3. T-Zell-Aktivierung und Imaging <ol><li> Bereiten Bildgebung buffer [1,25 ml HEPES (1 M), 10 ml FCS, 38.75 ml RPMI ohne Phenolrot]. Imaging-Puffer bei 4 ° C nach der Filtration gespeichert werden. </li><li> Aktivieren Sie die Zeiss LSM 510 Meta Mikroskop. Halte das Mikroskop beheizbare Einbaurahmen bis 37 ° C. Wählen Sie &quot;Expert-Modus&quot;. </li><li> Klicken Sie auf den &quot;Acquire&quot; und öffnen Sie die folgenden Registerkarten: Laser; Mikroskopie; Konfiguration; Scan; Time Series. </li><li> Aktivieren Sie die benötigten Lasern. Zur Anregung von MCFP und mYFP setzte der Argon / 2 Laser auf &quot;Standby&quot; für 5 min, dann auf &quot;on&quot;. </li><li> Wenn Sie diesen Live-Cell-Imaging-Test vor durchgeführt haben, mit den gleichen Fluorophoren, öffnen Sie die resultierende LSM-Datei, klicken Sie auf die &quot;Wiederverwendung&quot; icon, und von Schritt 9 fort. Andernfalls mit Schritt 6 fort. </li><li> Definieren Kanäle mit Filter geeignet für die Anregung und Emission der fluoreszierenden Proteine ​​verwendet. </li><li> In der &quot;Scan Control&quot; Fenster wählen Sie die Option Z-Stack. </li><li> Geben Sie die folgenden Scan-Parameter: Anzahl der Scheiben: 5; Intervall: 0,5 um; Aktuelle Scheibe: 3. </li><li> Bereiten Sie eine Accublock Digitale Dry Bath (Labnet) bei 37 ° C in der Nähe des Mikroskops. </li><li> Wärmen Sie die Imaging-Puffer auf 37 ° C. </li><li> Bereiten Sie das gespeicherte Bild durch Absaugen des PBS, und ersetzt sie mit 600 ul Puffer warmen Bildgebung. </li><li> Den Objektträger bei 37 ° C Halten Sie die Folie in den Inkubator, bis Stufe 13, für mindestens 15 min. </li><li> Sammeln Sie 5 x 10 5 transfizierten T-Zellen. </li><li> Zentrifuge Zellen für 2 min bei 400 × g. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> Die Zellen in 1 ml warmen Imaging-Puffer, und übertragen Sie sie auf einer 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Legen Sie die test Rohr auf der Accublock Digitale Dry Bath. </li><li> Nehmen Sie die erwärmte Folie aus dem Inkubator und klebe sie auf die erwärmte Mikroskop Einbaurahmen. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;VIS&quot;-Symbol. </li><li> Mischen Sie die Zellsuspension und entfernen 1-2 ul. </li><li> Legen Sie die Spitze der Pipette in das abbildende Puffer über dem unteren Rand der Folie. Vermeiden Sie ein Verkratzen der Folie. </li><li> Seed die Zellen gegenüber dem Ziel der Öffnung. </li><li> Sofort beginnen visuell Verfolgung der fluoreszierenden Zellen, wie sie absteigen. Markieren Sie eine Zelle, die eine hohe Fluoreszenz zeigt in beiden Kanälen. </li><li> Bevor die Zelle erreicht die Oberfläche der Folie, aktivieren Sie die LSM-Modus. </li><li> Sehen nur ein Anregungslaser. Wählen Sie einen Laser, für die Sie eine DIC-Kanal. </li><li> Set Zoom auf 1 setzen. Klicken Sie auf die &quot;Fast XY&quot;-Symbol. Klicken Sie auf das Symbol &quot;Stop&quot;. Mit dem Crop-Werkzeug, wählen Sie eine ROI auf die Zelle zentriert. </li><li> Set Zoom bis 3. Klicken Sie auf die &quot;Fast XY&quot;-Symbol und dann manuell den Fokus optimal sehen die Zelle. Klicken Sie auf &quot;Stop&quot; icon. </li><li> Sehen alle benötigten Anregungslaser. </li><li> Starten Sie die Aufnahme, indem Sie auf das &quot;StartT&quot;-Symbol. Bild der Zelle für die Gesamtheit der Ausbreitung Verfahrens (üblicherweise 5 min). Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf das Symbol &quot;Stop&quot;. </li><li> Speichern Sie die Datei. </li><li> Um zusätzliche Zellen zu erwerben, klicken Sie auf &quot;VIS&quot;-Symbol. Wenn es Zellen, die noch nicht in Kontakt mit dem Schlitten hat die unten kommen, aus dem Schritt 23 fort. Vermeiden Bildgebung von Zellen, die bereits die Verbreitung Prozess begonnen haben. Ansonsten gehen Sie zu Schritt 32. </li><li> Wenn die beobachteten slide Bereich ist meist frei von Zellen, fügen Sie eine weitere Teilmenge von Zellen (weiter bei Schritt 20). Ansonsten gehen Sie zu Schritt 33. </li><li> Um zusätzliche Zellen erwerben, bewegen Sie den Schieber, so dass der Bereich oberhalb des Objektivs Öffnung frei von Zellen ist. </li><li> Einen weiteren hinzufügen Aliquot von Zellen (und fahren Sie mit Schritt 20). </li><li> Nach Durchführung aller die gewünschte Bildgebung, öffnen Sie eine gespeicherte Datei LSM. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Galerie&quot;, &quot;Zeit + Z&quot; und &quot;Subset&quot;. </li><li> Wählen Sie die Relevantent Zeitbereich und Z-Stack. </li><li> Speichern Sie die neue Datei. </li><li> Führen Sie die Schritte 35-38 für alle Imaging-Dateien. </li></ol> 4. Imaging Data Analysis <ol><li> Öffnen Sie die Dateien mit Imaris LSM Software (Bitplane AG, Zürich Schweiz). </li><li> Klicken Sie auf &quot;übertreffen&quot;. Klicken Sie auf &quot;Image Processing&quot;-Menü und wählen Sie &quot;Wechseln von Zeit und Z&quot;. Dies wird in den richtigen Beschneiden des Bildes zu unterstützen. </li><li> Klicken Sie auf den &quot;Bearbeiten&quot;-Symbolleiste, und wählen Sie die &quot;Crop 3D&quot;-Option aus dem Dropdown-Menü. Das Bild zuschneiden, um nur die Umgebung der Zelle gehören. Wir schlagen vor, Zuschneiden eines 300 × 300 Pixel Platz auf der Zelle zentriert. Beachten Sie, dass die Form und Lage der Zelle mit der Zeit ändern. Die Beobachtung der t-Achse, stellen Sie sicher, dass die Zelle in der Region zugeschnitten ist zu allen Zeitpunkten. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Image Processing&quot;-Menü und wählen Sie &quot;Wechseln von Zeit und Z&quot;, um die ursprüngliche zeitliche Trennung des Bildes wiederherzustellen. </li><li> Drücken Sie die &quot;Coloc&quot;-Taste auf der Haupt-Symbolleiste. Wählen Sie &quot;Bauzeit Dep. Coloc &quot;. Imaris berechnet automatisch Intensität Schwellenwerte für jeden Kanal zu jedem Zeitpunkt. </li><li> Sehen Sie sich die Ergebnisse der Kolokalisationsanalyse indem Sie &quot;Channel Statistics&quot;. Exportieren Sie die Daten, indem Sie auf &quot;Export&quot;. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 6 für jeden abgebildeten Zelle. Es empfiehlt sich, mindestens 50 Zellen in dieser Art und Weise analysiert werden. </li><li> Berechnen Sie den Mittelwert Pearson Kolokalisation Koeffizienten und deren Standardfehler oder Abweichung. </li></ol>

<ol>
	<li>Viret, C., Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+and+T+cell+development.">MHC and T cell development.</a> Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).</li><li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+antimicrobial+peptides:+multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity.">Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).</li><li>Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+cell+effector+and+memory+function+in+viral+immunity.">Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).</li><li>Jager, D., Jager, E., Knuth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+tumour+antigens:+implications+for+antigen+specific+immunotherapy+of+cancer.">Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer.</a> J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).</li><li>Davis, M. M., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+antigen+receptor+genes+and+T-cell+recognition.">T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.</a> Nature. 334, 395-402 (1988).</li><li>Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+cytoskeleton+in+T+cell+activation.">The actin cytoskeleton in T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).</li><li>Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+leading+from+the+T-cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton+network.">Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network.</a> FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).</li><li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+interactions+linking+the+T+cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton.">Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton.</a> Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading:+a+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT.">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander's+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry A. 77, 733-742 (2010).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).</li><li>Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosines+113,+128,+and+145+of+SLP-76+are+required+for+optimal+augmentation+of+NFAT+promoter+activity.">Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity.</a> J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).</li><li>Wunderlich, L., Farag&#243;, A., Downward, J., Buday, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Nck+with+tyrosine-phosphorylated+SLP-76+in+activated+T+lymphocytes.">Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes.</a> Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).</li><li>Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cooperation+between+the+proteins+Nck+and+ADAP+is+fundamental+for+actin+reorganization.">Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization.</a> Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).</li><li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+at+the+SLP-76+complex+are+critical+for+actin+polymerization.">Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization.</a> EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).</li><li>Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).</li></ol>

Wir haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Die Regulation und Funktion von mehreren zellulären Prozessen abhängig von der Bildung und Auflösung von Protein-Protein-Interaktionen. Mikroskopische Bildgebung ermöglicht die Echtzeit-Tracking von fluoreszierend markierten Proteinen in lebenden Zellen. Kolokalisation markierter Proteine ​​deuten auf eine direkte oder indirekte Wechselwirkung zwischen den Proteinen und kann verwendet werden, um Erkenntnisse durch biochemische Methoden wie Immunpräzipitation erhalten verstärken. Im Gegensatz zu biochemischen M...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagent/Material&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Amaxa human T Cell nucleofector kit</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Anti CD3 (UCHT1 clone) </td><td>BioLegend</td><td>300432</td><td></td></tr><tr><td>Falcon FACS Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Calbiochem</td><td>345810</td><td></td></tr><tr><td>German coverglass system 4 chamber slides </td><td>Lab-Tek II</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Bio Lab</td><td>8410501</td><td></td></tr><tr><td>Hepes </td><td>Biological Industries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Hygomycin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-306</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine </td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin </td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R87589</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>Accublock digital dry bath</td><td>Labnet</td><td>D1105A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta</td><td></td></tr><tr><td>Heatable mounting frame - Heating Insert P S </td><td>PeCon</td><td>130-800-031</td><td></td></tr><tr><td>TempModule S (required for the heatable mounting frame)</td><td>Zeiss</td><td>411860-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation device</td><td>Amaxa</td><td>Nucleofector I</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence activated cell sorter</td><td>Becton Dickinson</td><td>FACSVantage SE</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Bitplane</td><td>7.0.0</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time live imaging of t-cell signaling complex formation

Schutz gegen Infektionskrankheiten durch das Immunsystem vermittelt 1,2. T-Lymphozyten sind die Master Koordinatoren des Immunsystems, der Regulierung der Aktivierung und Antworten mehrerer Immunzellen 3,4. T-Zell-Aktivierung ist abhängig von der Erkennung von Antigenen durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) angezeigt. Die T-Zell-Antigen-Rezeptor (TCR) ist spezifisch für jedes T-Zell-Klon und bestimmt Antigenspezifität 5. Die Bindung des TCR auf das Antigen induziert die Phosphorylierung von Komponenten des TCR-Komplexes. Um den T-Zell-Aktivierung zu fördern, müssen dieses Signal von der Membran in das Zytoplasma und den Zellkern transduziert Einleiten verschiedenen entscheidenden Reaktionen wie Einstellung der Signal-Proteinen an die TCR; APC Website (Immunsynapse), deren molekulare Aktivierung Zytoskelett-Umlagerung Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration, und Veränderungen in der Genexpression 6,7. Die richtige initiation und Beendigung der Aktivierungssignale ist entscheidend für die entsprechenden T-Zell-Reaktionen. Die Aktivität der Signalproteine ​​ist abhängig von der Bildung und Auflösung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, posttranslationale Modifikationen wie Protein-Phosphorylierung die Bildung von Protein-Komplexe, Protein Ubiquitin und die Rekrutierung von Proteinen an verschiedenen zellulären Seiten 8. Das Verständnis, das Innenleben des T-Zell-Aktivierung ist entscheidend sowohl für die immunologische Forschung und klinische Anwendungen. Verschiedene Tests wurden entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, aber biochemische Assays, wie dem weit verbreiteten Co-Immunopräzipitation Methode nicht zulassen Protein Lage zu sein, erkannt und somit auch keine Beobachtung wertvolle Einblicke in die Dynamik zellulärer Mechanismen. Zusätzlich können diese Masse Assays kombinieren üblicherweise Proteine ​​aus verschiedenen Zellen, die möglicherweise in verschiedenen Stadien der ter untersucht zellulären Prozess. Dies kann sich nachteilig auf die zeitliche Auflösung. Die Verwendung von Echtzeit-Bildgebung lebender Zellen ermöglicht sowohl die räumliche Verfolgung von Proteinen und die Fähigkeit, zeitlich zwischen Signalwege zu unterscheiden, damit Licht auf die Dynamik des Prozesses 9,10. Wir stellen ein Verfahren zur Echtzeit-Bildgebung von Signalisierungs-Komplexbildung bei T-Zell-Aktivierung. Primären T-Zellen oder T-Zell-Linien, wie Jurkat sind mit Plasmiden, die für Proteine ​​von Interesse fusioniert an monomeren fluoreszierenden Proteine ​​transfiziert verhindert unphysiologische Oligomerisierung 11. Live-T-Zellen werden in einem Deckglas vorbeschichtet mit T-Zell-aktivierende Antikörper 8,9, die dem CD3/TCR Komplex bindet und induziert T-Zell-Aktivierung unter Überwindung der Bedarf an speziellen aktivierende Antigene fallen gelassen. Aktivierten Zellen werden ständig mit der Verwendung der konfokalen Mikroskopie abgebildet. Imaging Daten werden analysiert, um quantitative Ergebnisse, wie die Ausbeute colocalization Koeffizient der Signal-Proteinen.

Wir präsentieren ein Beispiel für Live-T-Zell-Bildgebung und Analyse. Vor dem Imaging Experiment wurden SLP76 defizienten T-Zellen (J14) mit der Verwendung von FACS auf die Expression der fluoreszierenden Proteine ​​(Abbildung 1) zu bestimmen, analysiert. T-Zellen mit den markierten Signalproteine ​​MCFP-Nck und SLP76-mYFP transfiziert wurden Aktivieren Folien aufgebracht und abgebildet während T-Zell-Spreizung (Abbildung 2). Gesammelte Bilder zeigen die Dynamik von Protein-L...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation at JoVE.com

Echtzeit-Live-Bildgebung der Bildung von T-Zell-Signalkomplexen | Immunologie und Infektion | Video

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Wir beschreiben eine Live-Cell-Imaging-Verfahren, das einen Einblick in die Dynamik Protein während der T-Zell-Aktivierung. Wir zeigen die kombinierte Nutzung des T-Zell-Ausbreitung Assay, konfokale Mikroskopie und Bildanalyse zu liefern quantitative Ergebnisse zu folgen Signalisierung Komplexbildung während T-Zell-Aktivierung.

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

real-time-live-imaging-of-t-cell-signaling-complex-formation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Cellular Processes

Cell Signaling

SCIENTISTS IN ACTION

13.6K Aufrufe.  Bar-Ilan University. Wir beschreiben eine Live-Cell-Imaging-Verfahren, das einen Einblick in die Dynamik Protein während der T-Zell-Aktivierung. Wir zeigen die kombinierte Nutzung des T-Zell-Ausbreitung Assay, konfokale Mikroskopie und Bildanalyse zu liefern quantitative Ergebnisse zu folgen Signalisierung Komplexbildung während T-Zell-Aktivierung.

Serie: Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the structure-function relationship of these receptors in situ, we need to visualize and track them on the live cell surface with enough spatiotemporal resolution. Here we show how to use recently developed Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) to image T-cell receptors (TCRs) four-dimensionally (4D, space and time) at the live cell membrane. T cells are one of the main effector cells of the adaptive immune system, and here we used T cells as an example to show that the signaling and function of these cells are driven by the dynamics and interactions of the TCRs. LLSM allows for 4D imaging with unprecedented spatiotemporal resolution. This microscopy technique therefore can be generally applied to a wide array of surface or intracellular molecules of different cells in biology.

The goal of this protocol is to show how to use Lattice Light-Sheet Microscopy to four-dimensionally visualize surface receptor dynamics in live cells. Here T cell receptors on CD4+ primary T cells are shown.

Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Biochemie

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Ein Endothelial Planar Zellmodell für Imaging immunologischen Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological synapse, a stereotyped cell-cell junction that regulates T cell activation and directionally targets effector responses. To study these processes effectively, an imaging approach that is tailored to capturing fast, polarized responses is necessary. This protocol describes such a system, which is based on a photoactivatable peptide-major histocompatibility complex (pMHC) that is non-stimulatory until it is exposed to ultraviolet light. Targeted decaging of this reagent during videomicroscopy experiments enables precise spatiotemporal control of TCR activation and high-resolution monitoring of subsequent cellular responses by total internal reflection (TIRF) imaging. This approach is also compatible with genetic and pharmacological perturbation strategies. This allows for the assembly of well-defined molecular pathways that link TCR signaling to the formation of the polarized cytoskeletal structures that underlie the immunological synapse.

This protocol describes an imaging-based method to activate T lymphocytes using photoactivatable peptide-MHC, enabling precise spatiotemporal control of T cell activation.

Räumliche und zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung mit Hilfe einer Photoactivatable-Agonist

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Bewertung der synaptischen Schnittstelle der primären menschlichen T-Zellen aus peripherem Blut und Lymphgewebe

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Imaging the Human Immunological Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) and an effector helper T lymphocyte (Th) cell, and to record the images corresponding to the first stages of the IS formation and the subsequent trafficking events (occurring both in the APC and in the Th cell). These events will eventually lead to polarized secretion at the IS. In this protocol, Jurkat cells challenged with Staphylococcus enterotoxin E (SEE)-pulsed Raji cells as a cell synapse model was used, because of the closeness of this experimental system to the biological reality (Th cell-APC synaptic conjugates). The approach presented here involves cell-to-cell conjugation, time-lapse acquisition, wide-field fluorescence microscopy (WFFM) followed by image processing (post-acquisition deconvolution). This improves the signal-to-noise ratio (SNR) of the images, enhances the temporal resolution, allows the synchronized acquisition of several fluorochromes in emerging synaptic conjugates and decreases fluorescence bleaching. In addition, the protocol is well matched with the end point cell fixation protocols (paraformaldehyde, acetone or methanol), which would allow further immunofluorescence staining and analyses. This protocol is also compatible with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and other state-of-the-art microscopy techniques. As a main caveat, only those T cell-APC boundaries (called IS interfaces) that were at the right 90&#176; angle to the focus plane along the Z-axis could be properly imaged and analyzed. Other experimental models exist that simplify imaging in the Z dimension and the following image analyses, but these approaches do not emulate the complex, irregular surface of an APC, and may promote non-physiological interactions in the IS. Thus, the experimental approach used here is suitable to reproduce and to confront some biological complexities occurring at the IS.

This protocol images both the immunological synapse formation and the subsequent polarized secretory traffic towards the immunological synapse. Cellular conjugates were formed between a superantigen-pulsed Raji cell (acting as an antigen-presenting cell) and a Jurkat clone (acting as an effector helper T lymphocyte).

Bildgebung der humanen immunologischen Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

<meta charset="utf8"></head><body>Hochauflösendes bildgebendes Verfahren zum Nachweis von Ca2+ -Mikrodomänen in T-Zellen

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der anfänglichen Aktivierung der adaptiven Immunantwort für therapeutische Interventionen

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

Bildgebung von anfänglichen Ca2+ -Mikrodomänen in primären T-Zellen

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...