Gli autori ringraziano Sophia fritto per l&#39;assistenza tecnica. MBS ringrazia i seguenti agenzie per il sostegno della ricerca: La Fondazione Israel Science per le sovvenzioni no.1659/08, 971/08 1503/08 e 491/10, i Ministeri della Salute e della Scienza per le sovvenzioni non. 3-4114 e 3-6540, la Israel Cancer Association attraverso la Tenuta del compianto Alexander Smidoda, e la Fondazione Famiglia Taubenblatt per la borsa di eccellenza Bio-medicina.

1. Trasfezione di cellule T <ol><li> Preparare la soluzione Nucleofector Amaxa attivato mescolando soluzione &quot;Supplemento&quot; del kit per la soluzione Nucleofector. La soluzione attivata può essere conservato a 4 ° C per tre mesi. </li><li> Coltivare le cellule Jurkat in mezzo di coltura [10% siero fetale di vitello (FCS), soluzione di penicillina-streptomicina 1%, e 2 mM L-glutammina in RPMI]. In modo ottimale, le cellule devono essere utilizzati 1-2 settimane dopo lo scongelamento. Utilizzando colture di cellule in crescita logaritmica è cruciale per alta efficienza di trasfezione e la sopravvivenza cellulare. Alternativamente, con piccole modifiche, questo protocollo può essere utilizzato con cellule T primarie, come descritto precedentemente 8. Va sottolineato che la durata del processo di attivazione delle cellule T primarie è più lunga di quella delle cellule T Jurkat (~ 30 min), una fase di microscopio montato sistema di incubazione deve essere utilizzato per mantenere livelli di umidità e temperatura durante la CO 2, processo di attivazione. </li><li> Raccogliere 5Cellule × 10 6 log-fase T per trasfezione in una provetta da 15 ml. </li><li> Centrifugare le cellule per 7 minuti a 400 xg a temperatura ambiente. </li><li> Durante la centrifugazione, preparare una piastra da 6 pozzetti. Riempire una cavità per ogni trasfezione con 5 ml di terreno di coltura, e pre-incubare a 37 ° C. </li><li> Raccogliere le provette dalla centrifuga e scartare il surnatante. Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di RPMI. </li><li> Centrifugare le cellule per 7 minuti a 400 xg a temperatura ambiente. </li><li> Durante la centrifugazione, preparare la soluzione di trasfezione. In un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, mescolare attivato 100 microlitri soluzione Nucleofector Amaxa preparata nel passaggio 1 con 5 pg di DNA del plasmide di interesse codificante una proteina fluorescente tag. In modo ottimale, la concentrazione di DNA dovrebbe essere maggiore di 1 pg / ml al fine di evitare di diluire la soluzione di trasfezione. </li><li> Mescolare bene pipettando dolce. </li><li> Dopo centrifugazione delle cellule, rimuovere con attenzione tutto il surnatante mentre non disturbing il pellet. </li><li> Pipettare la soluzione di DNA / trasfezione due volte. </li><li> Aggiungere la soluzione di DNA / trasfezione al pellet. </li><li> Trasferire le cellule alla Amaxa cuvetta. </li><li> Inserire la cuvetta nel dispositivo Amaxa Nucleofector. </li><li> Utilizzare l&#39;impostazione H-10 Amaxa trasfezione per elettroporazione (per Jurkat) o T-23 (per le cellule T primarie). </li><li> Rimuovere la piastra da 6 pozzetti dall&#39;incubatore. </li><li> Seguendo elettroporazione, trasferire accuratamente il surnatante con la sospensione cellulare alla piastra da 6 pozzetti con una pipetta Pasteur. Un pellet costituita da detriti cellulari può formare. Evitare di trasferire il pellet. </li><li> Incubare le cellule per 24 ore a 37 ° C. </li><li> Trasferire 2,5 ml di sospensione cellulare da ciascun pozzetto in un nuovo pozzo. Aggiungere 2,5 ml di terreno di coltura caldo (descritto nel passaggio 2) a ciascun pozzetto. </li><li> Dopo 72 ore, trasferire le cellule in una provetta sterile e centrifugare per 7 minuti a 400 xg a temperatura ambiente. Eliminare il supernatante e sostituirlo wicultura th mezzo supplementato con la cellula di mammifero selezione antibiotica appropriata per il plasmide usato (applicare una concentrazione adatta per gli antibiotici utilizzati; abbiamo usato G418 e / o Hygromycin in concentrazioni di 1,3 mg / ml e / o 0,2 mg / ml, rispettivamente). Coltura la sospensione cellulare in un pozzo fresco. In alternativa, le cellule possono essere trasfettate transitoriamente e ripreso 48 ore dopo la trasfezione. Per preparare le cellule trasfettate transitoriamente, co-trasfezione delle cellule con i due plasmidi contemporaneamente al passaggio 8, continuando normalmente al punto 20, e quindi passare direttamente al punto 23. Si noti che in questo scenario, le cellule devono essere utilizzati immediatamente, e in generale la loro intensità di fluorescenza è eterogeneo e non necessariamente elevato. </li><li> Crescere le cellule con terreno di coltura addizionato con l&#39;appropriato antibiotico selezione. Dividere le celle e di integrarle con terreno di coltura antibiotico-integrata, se necessario. </li><li> Dopo 2 settimane, verificare trasfezione successo con l&#39;impiego di FACS (influenzacell sorting orescence-attivato) come segue: </li><li> Raccogliere 10 6 cellule trasfettate, 10 6 cellule trasfettate fittizi (controllo negativo), e 10 6 cellule che sono noti per esprimere stabilmente la proteina fluorescente tag. Se le cellule vengono trasfettate con più di una proteina fluorescente (vedi passo 27), utilizzare più linee cellulari, singolarmente contrassegnati come controlli positivi. </li><li> Centrifugare le cellule per 7 minuti a 400 xg a temperatura ambiente. </li><li> Scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 500 microlitri tampone FACS (PBS w / o Ca 2 + e Mg 2 +, 5% FCS, 0,05% sodio azide). </li><li> Utilizzare un FACS analisi per verificare la fluorescenza cellulare. Confrontare fluorescenza delle cellule trasfettate a quella dei controlli negativi e positivi. </li><li> Trasfezione le cellule con un ulteriore, fluorescente con tag proteine, ripetere i passaggi 3-26 utilizzando le cellule transfettate. </li><li> Cellule che mostrano alti livelli di fluorescenza dovrebbero essere utilizzati. In modo ottimale, almeno il 50% deile cellule nella coltura dovrebbero essere altamente fluorescente. Cella di fluorescenza può essere aumentato di ordinamento delle cellule tramite FACS. </li></ol> Eventuali proteine ​​marcate aggiuntivi devono essere fusi a differenti fluorofori ed essere codificati su plasmidi codificanti per diversi antibiotici di selezione. Mezzo di selezione per le cellule trasfettate con più di un plasmide dovrebbe essere integrato con tutti gli antibiotici appropriati. 2. Cellule T Diffondere Assay Preparazione <ol><li> Utilizza Lab-Tek II tedesca sistema coverglass 4 diapositive da camera. Assicurarsi di non graffiare accidentalmente la superficie interna delle camere, ad esempio con una punta della pipetta, durante la preparazione o l&#39;uso. </li><li> Preparare 50 ml di soluzione di preparazione del vetrino: prendere 4,6 ml di 12 M (37%), HCl, aggiungere 38,5 ml di etanolo al 100%, e 6,9 ​​ml di acqua bidistillata. </li><li> Riempire ogni camera del vetrino con 500 microlitri soluzione preparazione del vetrino. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Aspirare la cameras, li asciugare completamente. </li><li> Incubare i vetrini scoperto per 1 ora a 45 ° C fino a completamente asciutto. </li><li> Preparare 0,01% soluzione di poli-L-lisina diluendo 0,1% di poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) in acqua bidistillata. </li><li> Applicare 500 microlitri di ciascuna camera. </li><li> Incubare il vetrino per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare le camere, li asciugare completamente. </li><li> Incubare per 3 ore a 45 ° C fino a completamente asciutto. </li><li> Vetrini rivestiti possono essere conservati a secco per parecchi mesi a temperatura ambiente. </li><li> Preparare una soluzione di anticorpi attivazione. Utilizzare un anticorpo anti-CD3: o HIT3a (BD Pharmingen, # 555.337) o UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 10 mg / ml in 400 microlitri di PBS, per ogni camera. Questa soluzione deve essere preparata poco prima della preparazione del vetrino. </li><li> Riempire ogni camera con 400 microlitri della soluzione di anticorpi attivazione. </li><li> Incubare il vetrino per 2 ore a 37 ° C o, preferibilmente, una notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere l&#39;attivazione di anticorpi solution e lavare immediatamente la camera due volte con 300 microlitri di PBS. Da questo punto, assicurarsi che le camere rimangono pieni di buffer. </li><li> Conservare il vetrino PBS-riempita a 4 ° C. Ti consigliamo di utilizzare le camere di diapositive preparate entro 1 settimana. </li></ol> 3. L&#39;attivazione delle cellule T e Imaging <ol><li> Preparare tampone di imaging [1,25 ml HEPES (1 M), 10 ml di FCS, 38,75 ml RPMI senza rosso fenolo]. Tampone di immagini può essere conservato a 4 ° C dopo filtrazione. </li><li> Attivare la Zeiss LSM 510 Meta microscopio. Scaldare il telaio di montaggio riscaldabile microscopio a 37 ° C. Selezionare &quot;Expert Mode&quot;. </li><li> Fare clic sulla scheda &quot;Acquisisci&quot; e aprire le seguenti schede: Laser, Microscopia, configurazione, scansione, Time Series. </li><li> Attivare i laser necessari. Per l&#39;eccitazione di MCFP e PFP, impostare l&#39;Argon / 2 del laser di &quot;stand-by&quot; per 5 minuti, poi su &quot;on&quot;. </li><li> Se avete eseguito questo test live-cell imaging prima, con gli stessi fluorofori, aprire il file LSM visualizzata fare clic sul &quot;riuso&quot; icon, e continuare dal punto 9. In caso contrario, continuare dal passaggio 6. </li><li> Definire i canali utilizzando filtri appropriati per l&#39;eccitazione ed emissione delle proteine ​​fluorescenti utilizzate. </li><li> Nella finestra &quot;Scansione di controllo&quot;, selezionare l&#39;opzione dello stack Z. </li><li> Inserire i seguenti parametri di scansione: Numero di fette: 5; intervallo: 0,5 micron; fetta corrente: 3. </li><li> Preparare un AccuBlock Digital bagno a (Labnet) a 37 ° C in prossimità del microscopio. </li><li> Riscaldare il buffer di imaging a 37 ° C. </li><li> Preparare la diapositiva memorizzato aspirando la PBS, sostituendola con 600 ml di buffer di immagini caldo. </li><li> Incubare il vetrino a 37 ° C. Tenere la diapositiva in incubatrice fino al passaggio 13, per almeno 15 min. </li><li> Raccogliere 5 × 10 5 cellule T trasfettate. </li><li> Centrifugare le cellule per 2 minuti a 400 xg. </li><li> Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 1 ml di tampone di imaging caldo, e trasferirli in una provetta Eppendorf da 1,5 ml. </li><li> Posizionare il ttubo est sul bagno a Digital AccuBlock. </li><li> Prendere il vetrino riscaldato dal termostato, e montarlo sul telaio di montaggio microscopio riscaldata. </li><li> Fare clic sull&#39;icona &quot;VIS&quot;. </li><li> Mescolare la sospensione cellulare e togliere 1-2 microlitri. </li><li> Inserire la punta della pipetta nel buffer di imaging di sopra del fondo della diapositiva. Evitare di graffiare il vetrino. </li><li> Seed le cellule sopra dell&#39;apertura della oggettiva. </li><li> Immediatamente iniziare a tracciare visivamente le cellule fluorescenti mentre scendono. Selezionare una cella che mostra un&#39;elevata fluorescenza in entrambi i canali. </li><li> Prima che la cella raggiunge la superficie del vetrino, attivare la modalità LSM. </li><li> Alterna un solo laser di eccitazione. Selezionare un laser per il quale si dispone di un canale DIC. </li><li> Impostare zoom a 1. Fare clic sull&#39;icona &quot;Fast XY&quot;. Fare clic sull&#39;icona &quot;Stop&quot;. Utilizzando lo strumento Ritaglia, selezionare un ROI centrata sulla cella. </li><li> Impostare zoom a 3. Fare clic sull&#39;icona &quot;Fast XY&quot;, quindi impostare manualmente la messa a fuoco per visualizzare in modo ottimale la cella. Fare clic su &quot;Stop&quot; icon. </li><li> Alternare tutti i laser di eccitazione necessari. </li><li> Avviare la registrazione facendo clic sull&#39;icona &quot;stARTT&quot;. Immagine della cella per la totalità del processo di spalmatura (comunemente 5 min). Al termine, fare clic sull&#39;icona &quot;Stop&quot;. </li><li> Salvare il file. </li><li> Per acquisire ulteriori celle, fare clic sull&#39;icona &quot;VIS&quot;. Se ci sono cellule che ancora non entrano in contatto con la parte inferiore della diapositiva, continuare dal punto 23. Evitare le cellule di imaging che hanno già iniziato il processo di diffusione. In caso contrario, passare al punto 32. </li><li> Se l&#39;area diapositiva osservata è parte privi di cellule, aggiungere un&#39;altra aliquota di cellule (continuare dal passo 20). In caso contrario, passare al punto 33. </li><li> Per acquisire ulteriori celle, spostare la slitta in modo che l&#39;area al di sopra dell&#39;apertura del obiettivo è privo di cellule. </li><li> Aggiungere un&#39;altra aliquota di cellule (e continuare dal punto 20). </li><li> Dopo aver eseguito tutte le immagini desiderato, aprire un file salvato LSM. </li><li> Fare clic su &quot;Galleria&quot;, &quot;Time + Z&quot; e &quot;sottoinsieme&quot;. </li><li> Selezionare il relevant periodo e Z stack. </li><li> Salvare il nuovo file. </li><li> Eseguire i passaggi 35-38 per tutti i file di imaging. </li></ol> 4. Imaging Data Analysis <ol><li> Aprire i file con il software LSM Imaris (Bitplane AG, Zurigo, Svizzera). </li><li> Fare clic su &quot;Superare&quot;. Fare clic sul menu &quot;Image Processing&quot;, e selezionare &quot;Swap Tempo e Z&quot;. Questo aiuterà nella corretta ritaglio dell&#39;immagine. </li><li> Fare clic su &quot;Modifica&quot; barra degli strumenti e selezionare l&#39;opzione &quot;3D Crop&quot; nel menu a discesa. Ritagliare l&#39;immagine per includere solo l&#39;area che circonda la cellula. Ti consigliamo di ritagliare un quadrato di 300 × 300 pixel centrata sulla cella. Si noti che la forma e la posizione della cella possono cambiare nel tempo. Osservando l&#39;asse t, assicurarsi che la cella è all&#39;interno della regione ritagliata a tutti i tempi. </li><li> Fare clic sul menu &quot;Image Processing&quot;, e selezionare &quot;Swap Tempo e Z&quot; per ripristinare la separazione temporale originale dell&#39;immagine. </li><li> Premere il pulsante &quot;Coloc&quot; sulla barra degli strumenti principale. Selezionare &quot;Tempo di costruzione Dep. Coloc &quot;. Imaris calcola automaticamente le soglie di intensità per ogni canale ad ogni tempo. </li><li> Guarda i risultati dell&#39;analisi colocalizzazione selezionando &quot;Channel Statistiche&quot;. Esportare i dati facendo clic su &quot;Esporta&quot;. </li><li> Ripetere i passaggi da 1 a 6 per ogni cella creata l&#39;immagine. Si consiglia di almeno 50 cellule analizzate in questo modo. </li><li> Calcolare la media coefficiente di colocalizzazione di Pearson e il suo errore standard o scarto. </li></ol>

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Noi non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

La regolazione e la funzione di molteplici processi cellulari dipendono la formazione e la terminazione di interazioni proteina-proteina. L&#39;imaging microscopico consente il tracciamento in tempo reale delle proteine ​​fluorescenti tag nelle cellule viventi. Colocalizzazione di proteine ​​marcate può suggerire una interazione diretta o indiretta tra le proteine, e può essere utilizzato per rafforzare i risultati ottenuti con metodi biochimici, come la immunoprecipitazione. A differenza dei metodi biochimici...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagent/Material&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Amaxa human T Cell nucleofector kit</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Anti CD3 (UCHT1 clone) </td><td>BioLegend</td><td>300432</td><td></td></tr><tr><td>Falcon FACS Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Calbiochem</td><td>345810</td><td></td></tr><tr><td>German coverglass system 4 chamber slides </td><td>Lab-Tek II</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Bio Lab</td><td>8410501</td><td></td></tr><tr><td>Hepes </td><td>Biological Industries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Hygomycin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-306</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine </td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin </td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R87589</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>Accublock digital dry bath</td><td>Labnet</td><td>D1105A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta</td><td></td></tr><tr><td>Heatable mounting frame - Heating Insert P S </td><td>PeCon</td><td>130-800-031</td><td></td></tr><tr><td>TempModule S (required for the heatable mounting frame)</td><td>Zeiss</td><td>411860-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation device</td><td>Amaxa</td><td>Nucleofector I</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence activated cell sorter</td><td>Becton Dickinson</td><td>FACSVantage SE</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Bitplane</td><td>7.0.0</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time live imaging of t-cell signaling complex formation

Protezione contro le malattie infettive è mediato dal sistema immunitario 1,2. Linfociti T sono coordinatori del master del sistema immunitario, regolando l&#39;attivazione e risposte di molteplici cellule immunitarie 3,4. Attivazione delle cellule T dipende dal riconoscimento di antigeni specifici mostrata dalle cellule presentanti l&#39;antigene (APC). Il recettore dell&#39;antigene delle cellule T (TCR) è specifico per ogni clone di cellule T e determina specificità antigenica 5. Il legame del TCR all&#39;antigene induce la fosforilazione di componenti del complesso TCR. Al fine di promuovere l&#39;attivazione delle cellule T, questo segnale deve essere trasdotte dalla membrana al citoplasma e il nucleo, avviando varie risposte cruciali quali l&#39;assunzione di proteine ​​di segnalazione al TCR; sito APC (sinapsi immune), la loro attivazione molecolare, riarrangiamento del citoscheletro, elevazione della concentrazione intracellulare di calcio, e cambiamenti nell&#39;espressione genica 6,7. La corretta initiation e la cessazione dei segnali di attivazione è di fondamentale importanza per le risposte delle cellule T del caso. L&#39;attività delle proteine ​​di segnalazione dipende la formazione e la terminazione di interazioni proteina-proteina, post traduzionali come fosforilazione proteica, formazione di complessi proteici, ubiquitinazione proteica e l&#39;assunzione di proteine ​​a vari siti cellulari 8. Comprendere il funzionamento interno del processo di attivazione delle cellule T è fondamentale sia per la ricerca immunologica e applicazioni cliniche. Vari test sono stati sviluppati al fine di indagare le interazioni proteina-proteina, tuttavia, saggi biochimici, come ad esempio il metodo di co-immunoprecipitazione ampiamente utilizzato, non consentono posizione proteina di essere discerne, precludendo così l&#39;osservazione di preziose informazioni sulla dinamica del cellulare meccanismi. Inoltre, questi test di massa di solito si combinano proteine ​​da molte cellule diverse che potrebbero essere in diverse fasi di tindagò processo cellulare. Questo può avere un effetto negativo sulla risoluzione temporale. L&#39;uso di immagini in tempo reale delle cellule vive permette sia il tracking spaziale delle proteine ​​e la capacità di distinguere temporalmente tra eventi di segnalazione, che perde così in luce la dinamica del processo di 9,10. Presentiamo un metodo di imaging in tempo reale della formazione di segnalazione-complesso durante l&#39;attivazione delle cellule T. T-cellule primarie o linee di cellule T, come Jurkat, vengono trasfettate con plasmidi codificanti per proteine ​​di interesse fuse ad proteine ​​fluorescenti monomeriche, impedendo oligomerizzazione non fisiologico 11. Diretta cellule T sono sceso sopra un coprioggetto pre-rivestite con cellule T attivante 8,9 anticorpo, che si lega al complesso CD3/TCR, indurre l&#39;attivazione delle cellule T superando la necessità di antigeni attivatori specifici. Cellule attivate sono costantemente ripreso con l&#39;uso della microscopia confocale. Dati di imaging vengono analizzati per produrre risultati quantitativi, quali il collecoefficiente ocalization delle proteine ​​di segnalazione.

Vi presentiamo un esempio di immagini di cellule T in diretta e analisi. Prima dell&#39;esperimento di imaging, SLP76 cellule T deficienti (J14) sono stati analizzati con l&#39;uso di FACS per determinare l&#39;espressione delle proteine ​​fluorescenti (Figura 1). Cellule T trasfettate con le proteine ​​di segnalazione con tag MCFP-NCK e SLP76-PFP sono stati depositati su vetrini Attivazione e ripreso durante cellule T spreading (Figura 2). Immagini raccolte mostrano le dinamich...

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Imaging dal vivo in tempo reale della formazione complessa di segnalazione delle cellule T | Immunologia e infezione | Video

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Si descrive un metodo live-cell imaging che permette di comprendere dinamica della proteina durante il processo di attivazione delle cellule T. Dimostriamo l&#39;utilizzo combinato della cellula T diffusione saggio, microscopia confocale e analisi di imaging per produrre risultati quantitativi di seguire segnalamento formazione di complessi durante l&#39;attivazione delle cellule T.

Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

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13.6K Views.  Bar-Ilan University. Si descrive un metodo live-cell imaging che permette di comprendere dinamica della proteina durante il processo di attivazione delle cellule T. Dimostriamo l'utilizzo combinato della cellula T diffusione saggio, microscopia confocale e analisi di imaging per produrre risultati quantitativi di seguire segnalamento formazione di complessi durante l'attivazione delle cellule T.

Video: Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the structure-function relationship of these receptors in situ, we need to visualize and track them on the live cell surface with enough spatiotemporal resolution. Here we show how to use recently developed Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) to image T-cell receptors (TCRs) four-dimensionally (4D, space and time) at the live cell membrane. T cells are one of the main effector cells of the adaptive immune system, and here we used T cells as an example to show that the signaling and function of these cells are driven by the dynamics and interactions of the TCRs. LLSM allows for 4D imaging with unprecedented spatiotemporal resolution. This microscopy technique therefore can be generally applied to a wide array of surface or intracellular molecules of different cells in biology.

The goal of this protocol is to show how to use Lattice Light-Sheet Microscopy to four-dimensionally visualize surface receptor dynamics in live cells. Here T cell receptors on CD4+ primary T cells are shown.

Visualizzazione delle dinamiche del recettore a cellule T di superficie in modo quad-dimensionale utilizzando la microscopia A fogli di luce a reticolo

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Biochimica

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological synapse, a stereotyped cell-cell junction that regulates T cell activation and directionally targets effector responses. To study these processes effectively, an imaging approach that is tailored to capturing fast, polarized responses is necessary. This protocol describes such a system, which is based on a photoactivatable peptide-major histocompatibility complex (pMHC) that is non-stimulatory until it is exposed to ultraviolet light. Targeted decaging of this reagent during videomicroscopy experiments enables precise spatiotemporal control of TCR activation and high-resolution monitoring of subsequent cellular responses by total internal reflection (TIRF) imaging. This approach is also compatible with genetic and pharmacological perturbation strategies. This allows for the assembly of well-defined molecular pathways that link TCR signaling to the formation of the polarized cytoskeletal structures that underlie the immunological synapse.

This protocol describes an imaging-based method to activate T lymphocytes using photoactivatable peptide-MHC, enabling precise spatiotemporal control of T cell activation.

Controllo spaziale e temporale di attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fuse

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Valutazione dell'interfaccia sinaptica primaria umana delle cellule di T dal sangue periferico e tessuto linfoide

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Imaging the Human Immunological Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) and an effector helper T lymphocyte (Th) cell, and to record the images corresponding to the first stages of the IS formation and the subsequent trafficking events (occurring both in the APC and in the Th cell). These events will eventually lead to polarized secretion at the IS. In this protocol, Jurkat cells challenged with Staphylococcus enterotoxin E (SEE)-pulsed Raji cells as a cell synapse model was used, because of the closeness of this experimental system to the biological reality (Th cell-APC synaptic conjugates). The approach presented here involves cell-to-cell conjugation, time-lapse acquisition, wide-field fluorescence microscopy (WFFM) followed by image processing (post-acquisition deconvolution). This improves the signal-to-noise ratio (SNR) of the images, enhances the temporal resolution, allows the synchronized acquisition of several fluorochromes in emerging synaptic conjugates and decreases fluorescence bleaching. In addition, the protocol is well matched with the end point cell fixation protocols (paraformaldehyde, acetone or methanol), which would allow further immunofluorescence staining and analyses. This protocol is also compatible with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and other state-of-the-art microscopy techniques. As a main caveat, only those T cell-APC boundaries (called IS interfaces) that were at the right 90&#176; angle to the focus plane along the Z-axis could be properly imaged and analyzed. Other experimental models exist that simplify imaging in the Z dimension and the following image analyses, but these approaches do not emulate the complex, irregular surface of an APC, and may promote non-physiological interactions in the IS. Thus, the experimental approach used here is suitable to reproduce and to confront some biological complexities occurring at the IS.

This protocol images both the immunological synapse formation and the subsequent polarized secretory traffic towards the immunological synapse. Cellular conjugates were formed between a superantigen-pulsed Raji cell (acting as an antigen-presenting cell) and a Jurkat clone (acting as an effector helper T lymphocyte).

Immaginare la sinapsi immunologica umana

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

<meta charset="utf8"></head><body>Tecnica di imaging ad alta risoluzione per la rilevazione di microdomini Ca2+ nelle cellule T

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Svelare l'attivazione iniziale della risposta immunitaria adattativa per l'intervento terapeutico

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

Imaging iniziale di microdomini Ca2+ in cellule T primarie

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

Riepilogo

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Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine associate segnalazione

Visualizzazione delle dinamiche del recettore a cellule T di superficie in modo quad-dimensionale utilizzando la microscopia A fogli di luce a reticolo

Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

Controllo spaziale e temporale di attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fuse

Valutazione dell'interfaccia sinaptica primaria umana delle cellule di T dal sangue periferico e tessuto linfoide

Immaginare la sinapsi immunologica umana

Imaging iniziale di microdomini Ca²⁺ in cellule T primarie

Imaging iniziale di microdomini Ca²⁺ in cellule T primarie

Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

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Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

Visualizzazione delle dinamiche del recettore a cellule T di superficie in modo quad-dimensionale utilizzando la microscopia A fogli di luce a reticolo

Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

Controllo spaziale e temporale di attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fuse

Valutazione dell'interfaccia sinaptica primaria umana delle cellule di T dal sangue periferico e tessuto linfoide

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Imaging iniziale di microdomini Ca2+ in cellule T primarie

Imaging iniziale di microdomini Ca2+ in cellule T primarie

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine associate segnalazione

Imaging iniziale di microdomini Ca²⁺ in cellule T primarie

Imaging iniziale di microdomini Ca²⁺ in cellule T primarie