Planimetria digital para avaliar a cinética de fechamento de feridas em um modelo de camundongo

As feridas representam um desafio de saúde global. Este estudo desenvolveu uma cabine fotográfica padronizada utilizando planimetria digital para minimizar a variabilidade da medição da ferida. O monitoramento de feridas em camundongos ao longo de 14 dias revelou um aumento inicial na área e no perímetro da ferida, seguido de fechamento gradual. Essa metodologia pode auxiliar na avaliação da cinética de fechamento de feridas em modelos pré-clínicos.

As feridas crônicas, devido à sua alta prevalência, são um sério problema de saúde global. Estratégias terapêuticas eficazes podem acelerar significativamente a cicatrização, reduzindo assim o risco de complicações e aliviando a carga econômica sobre os sistemas de saúde. Embora numerosos estudos experimentais tenham investigado a cicatrização de feridas, a maioria depende de observações qualitativas ou medições diretas quantitativas. O objetivo deste estudo foi padronizar um método de medição indireta de feridas usando planimetria digital, incorporando escala e segmentação digitais. Essa abordagem aborda a falta de metodologias detalhadas e passo a passo para uma avaliação precisa da ferida. Uma cabine de fotodocumentação foi projetada e construída, e ferramentas de planimetria digital assistidas por computador foram empregadas para minimizar a variabilidade nas medições da área da ferida, perímetro e distância do centro da ferida às suas bordas. Uma ferida traumática circular (5 mm de diâmetro) foi criada na linha média dorsal ao nível da omoplata de camundongos CD1 machos (n = 4, 10 semanas de idade, 30-35 g). A evolução da ferida foi fotodocumentada por 14 dias usando a cabine de fotos personalizada, que controlava as condições de iluminação, distância focal e posicionamento do sujeito. As medidas de raspagem e ferida foram realizadas por meio de segmentação no software ImageJ, e a análise estatística foi realizada por meio de software de análise estatística. A cinética de fechamento da ferida mostrou um ligeiro aumento no tamanho e no perímetro da ferida entre o dia 0 e o dia 2, seguido por uma diminuição gradual até o fechamento completo no dia 14. A cabine de fotodocumentação e a planimetria digital assistida por computador permitiram medições quantitativas com variabilidade mínima. Em conclusão, essas ferramentas fornecem um método confiável e reprodutível para avaliar a cinética de fechamento de feridas em modelos pré-clínicos.

A cicatrização de feridas traumáticas leva aproximadamente 21 dias e tem uma sequência bem definida de quatro fases distintas: (1) hemostasia, (2) inflamação, (3) proliferação e (4) remodelação¹. Se alguma fase da cicatrização de feridas for prolongada, pode levar ao desenvolvimento de feridas crônicas¹. Devido à sua alta prevalência, complicações potenciais² e ônus econômico significativo, são considerados um problema de saúde global.

Os estudos pré-clínicos visam alcançar uma cicatrização mais rápida, promovendo a reepitelização abrangente da ferida ^3,4,5, prevenindo complicações e reduzindo os custos do tratamento. Esses estudos avaliam várias estratégias, incluindo o desenvolvimento de biomateriais, intervenções farmacológicas e outros procedimentos de medicina regenerativa 6,7,8,9.

Vários modelos experimentais foram desenvolvidos para o estudo de feridas traumáticas. Alguns se concentram em características qualitativas macroscopicamente visíveis, como tamanho, indicadores de inflamação, presença de tecido de granulação, secreções e formação de crostas⁵. Outros analisam dados quantitativos, incluindo área, perímetro, raio, diâmetro, cor, profundidade e distâncias do centro às bordas das feridas.

Nesse sentido, a maioria das investigações in vivo mede diretamente o raio e a profundidade da ferida. No entanto, o delineamento manual das bordas da ferida em uma imagem macroscópica pode introduzir vieses na medição¹⁰. Outros estudos utilizam planimetria mecânica, utilizando folhas plásticas quadriculadas transparentes, onde as bordas da ferida são previamente delineadas; Em ambos os casos, a obtenção da área ou perímetro requer instrumentos manuais, como réguas ou planímetros digitais. Atualmente, a planimetria digital assistida por computador permite a análise computadorizada de imagens macroscópicas de feridas ou folhas plásticas. A manipulação in situ e a qualidade da imagem macroscópica são uma limitação, no entanto, essa ferramenta 11,12,13,14 reduz consideravelmente a variabilidade entre as medidas de área e perímetro.

Esta metodologia proposta oferece vantagens significativas sobre as técnicas existentes para avaliar o fechamento de feridas em camundongos^{15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} . Embora a documentação fotográfica tenha sido considerada uma ferramenta precisa e consistente para avaliar a cinética de fechamento da ferida, estudos anteriores^21,22 destacaram as limitações da medição manual da ferida, como viés do observador e variabilidade devido à iluminação e posicionamento inconsistentes da câmera. A abordagem atual aborda esses problemas padronizando as condições de imagem por meio de uma cabine personalizada, melhorando a reprodutibilidade e a precisão. Além disso, a planimetria digital computadorizada permite avaliações quantitativas mais precisas, aprimorando a avaliação das intervenções terapêuticas e minimizando os erros de medição, como evidenciado em outros estudos comparando técnicas manuais e^{digitais12,22}, tornando-a particularmente adequada para estudos da cinética de fechamento de feridas em modelos murinos, permitindo a avaliação precisa dos tratamentos, mantendo um controle rigoroso sobre as condições de aquisição de imagens.

Todos os procedimentos experimentais envolvendo ratos de laboratório foram conduzidos de acordo com os padrões éticos e regulamentos estabelecidos na Norma Oficial Mexicana (NOM-062-ZOO-1999) para o manuseio e cuidado de animais de laboratório. O protocolo foi revisado e aprovado pelo Comitê Interno para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (CICUAL) do Instituto Nacional de Pesquisa Nuclear (ININ) sob o número de referência CICUAL-01-23. Foram utilizados camundongos CD1 machos (n = 4), com 10 semanas de idade, peso corporal variando de 28 a 32 g. Todos os animais foram selecionados para garantir uniformidade na cepa, idade, sexo e peso corporal, minimizando a variabilidade nos resultados experimentais. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Construção de cabine fotográfica para aquisição de imagens macroscópicas

NOTA: O software SolidWorks licenciado (versão 2015) foi usado para projetar uma cabine de fotos para eliminar fontes de iluminação externas. Um cubo de 40 cm × 40 cm foi construído usando um perfil de alumínio branco de uma polegada de espessura. O cubo consistia em três seções, montadas sequencialmente: teto, paredes laterais e piso (Figura 1A).

1. Construção do telhado
   NOTA: O telhado foi regionalizado como borda frontal (A), borda traseira (B) e bordas laterais (C e D) para orientar (Figura 1B).
   1. Fixe na área interna da borda lateral do telhado (C e D) um perfil de alumínio com fenda (projetado para segurar vidro) com 1,5 cm de largura, 2,51 cm de espessura e 34,9 cm de comprimento (Figura 1B).
   2. Coloque duas placas retangulares de alumínio de 34,5 cm de comprimento x 13 cm de largura com polietileno no centro da ranhura de cada perfil de telhado (Placa 1 e 2 na Figura 1C) para permitir o deslizamento pela ranhura de ambos os perfis.
   3. Instale uma lâmpada tubular LED RGB de 20 cm com uma faixa de temperatura de cor de 2500-9000 K (Figura 1C) em um ângulo de 45° na borda inferior do painel 1 usando fita dupla-face.
   4. Monte nos painéis de cobertura 1 e 2 um painel retangular de placa de espuma de 32 cm x 12 cm com um recorte circular central de 7,82 cm de diâmetro para permitir a instalação da lente da câmera (Figura 1C).
2. Construção do piso
   1. Coloque um pedaço quadrado de 40 cm x 40 cm de placa de espuma branca em cima dos perfis da área do piso. Corte quadrados com um comprimento lateral de 2,54 cm de cada canto da placa de espuma (Figura 1E).
3. Construção de paredes laterais
   1. Corte quatro painéis de placa de espuma quadrangular de 40 cm x 40 cm.
   2. Cole dois painéis com silicone nos lados C e D para formar as paredes laterais esquerda e direita (Figura 1F).
   3. Prenda tiras de velcro nos perfis de alumínio A e B para facilitar a manipulação dos elementos internos da cabine de fotos. Além disso, prenda 1 cm da borda de uma linha de fixadores adesivos a dois quadrados de espuma de papelão de um lado e coloque-os nas paredes frontal e traseira (Figura 1F).
4. Construção da base de referência
   NOTA: Uma base de referência foi necessária para manter o camundongo em decúbito ventral durante a anestesia e durante toda a documentação da evolução da ferida. Os componentes 3D foram projetados e fabricados usando a técnica de Modelagem por Deposição Fundida (FDM) com material PLA e uma impressora 3D^23,24.
   1. Imprima em 3D a máscara com uma base de 2 cm de largura, comprimento e altura e coloque-a a 11,5 cm da borda de um retângulo de placa de espuma branca pré-cortado de 40 cm x 28 cm para manter os camundongos sob anestesia inalatória (Figura 1D, cor vermelha).
   2. Imprima em 3D a plataforma retangular (9 cm de comprimento, 5 cm de largura, 2,5 cm de altura) com quatro áreas extrudadas para alinhar o dorso do mouse durante a aquisição da imagem. Essas áreas apoiavam a cabeça, os membros e a região abdominal para manter a posição prona. Cole esta plataforma no centro da base de referência (Figura 1D, cor verde).
   3. Imprima em 3D o bloco da régua (2 cm de largura, 8 cm de comprimento, 2,5 cm de altura) e fixe-o a 1 cm do lado esquerdo da base do mouse para colocar o elemento de referência de medição necessário para o processamento digital da imagem (Figura 1D, cor azul).
   4. Conecte uma régua graduada de aço inoxidável de 15 cm ao bloco da régua e instale toda a base de referência dentro da cabine para dimensionamento de imagem (Figura 1D).

Figura 1: Diagrama para a construção do gabinete de aquisição de imagens macroscópicas. (A) Seções da cabine (teto, paredes laterais, piso). (B)Orientação dos perfis que formam a cobertura; frente (A), traseira (B) e laterais (lado interno dos perfis em vermelho "C,D"). (C) Painéis de telhado 1 e 2, instalação do tubo de luz LED, placa da lente da câmera e instalação no piso. (D) Instalação da máscara de anestesia (VERMELHO), plataforma do mouse (VERDE) e plataforma retangular para posicionamento da régua de medição (AZUL) na base de referência. (E) Localização final da base de referência. (F) Instalação de paredes laterais, frontais e traseiras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Manutenção animal

1. Obter autorização do comitê de bioética da instituição para testes em animais. Use camundongos CD1 (n = 4), com 10 semanas de idade, pesando 28-32 g.
2. Alojar os ratos em condições padrão: manter uma temperatura de 21 °C, ciclos claro/escuro de 12/12 h, 45% de umidade e fornecer acesso ad libitum a água e comida, exceto durante sessões de fotodocumentação.

3. Geração de feridas traumáticas

1. Jejue os camundongos por 8 h antes do procedimento. Anestesiar os camundongos com pentobarbital sódico intraperitoneal a 65 mg / kg²⁵ (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
   1. Confirme a profundidade da anestesia verificando se há falta de reflexo de abstinência durante uma pinça interdigital. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia. Mantenha os camundongos a uma temperatura estável de 37 °C durante a cirurgia e recuperação (20 min).
2. Coloque o camundongo em decúbito ventral e depile uma área de 2,5 cm x 3 cm da região cervical caudalmente usando lâminas cirúrgicas. Estique a pele para evitar lacerações. Realize assepsia e antissepsia usando iodopovidona alternada e enxágues com água estéril.
3. Use um punção de biópsia estéril de 5 mm e aplique pressão com movimentos circulares para criar uma incisão dermoepidérmica no nível da omoplata. Remova a aba com pinça serrilhada e corte com tesoura de ponta de íris (Figura 2A).
4. Em caso de presença de pontos de sangramento na ferida, aplique um choque eletricista com um dispositivo de eletrocautério para obter hemostasia.
5. Coloque uma película dérmica circular de 1 cm de diâmetro sobre a ferida usando uma pinça de joalheiro para evitar contaminação e contração.
6. Realize todas as cirurgias de sobrevivência em condições estéreis. Prepare o local da cirurgia com desinfetantes como iodopovidona. Use luvas estéreis e máscara e mantenha a esterilidade durante todo o procedimento usando instrumentos estéreis e minimizando o contato com superfícies não estéreis.
   1. Após a cirurgia, coloque os camundongos em gaiolas individuais a 24 ° C e monitore-os até que recuperem a consciência suficiente para manter a posição esternal. Certifique-se de que a temperatura corporal seja controlada durante e após a cirurgia para evitar hipotermia usando fontes externas de calor.
7. Administrar analgesia até o dia 4 diluindo o cetorolaco em água potável a 5 mg/kg²⁶.
8. Após 14 dias, quando as feridas em roedores saudáveis normalmente atingem estágios avançados de cicatrização, eutanasiar os camundongos por substituição de O₂ em uma câmara de CO₂ seguindo os padrões internacionais. Isso marca o ponto final do estudo.

4. Aquisição de imagens macroscópicas

1. Capture imagens das feridas diariamente por 14 dias consecutivos para monitorar a cinética contínua de fechamento da ferida. Use uma câmera semiprofissional ou profissional; Posicione a lente através da abertura circular no teto da cabine de fotos.
   NOTA: Ajuste o cronograma conforme necessário com base nas condições experimentais.
2. Use um tubo de luz LED RGB no modo de temperatura de cor correlacionada (CCT), definido para 9000 K e 100% de brilho para iluminação.
3. Posicione a base de referência no centro do piso da cabine de fotos.
4. Coloque o camundongo na câmara de anestesia inalada por 3 min (Figura 2B).
5. Após a indução da anestesia, coloque o mouse em decúbito ventral na plataforma do mouse. Prenda o focinho dentro da máscara de anestesia com sevoflurano, fornecendo sevoflurano a 5% a uma taxa de fluxo de oxigênio de 1,5 L/min (Figura 2C).
6. Antes de capturar imagens, remova o filme dérmico da ferida usando uma pinça de joalheiro e alinhe a base de referência com a lente da câmera.
7. Instale a parede frontal da cabine de fotos e capture imagens macroscópicas com as seguintes configurações: abertura f/3.2, tempo de exposição 1/200s, velocidade ISO 80, distância focal 4mm.
8. Usando uma pinça de joalheiro, coloque um filme dérmico de 1 cm de diâmetro na ferida antes de remover a máscara de anestesia. Transfira os camundongos para gaiolas individuais e observe até a recuperação motora.

5. Processamento de imagem

1. Gere uma cópia de backup das imagens macroscópicas. Processe as imagens usando o software ImageJ.
2. Abra a imagem de backup no ImageJ seguindo o caminho: Arquivo > Abrir > Pesquisar nas imagens e clique em Abrir.
3. Dimensione a imagem por referência: Maximize a imagem, selecione a ferramenta de linha reta , amplie a régua ao lado do mouse usando a tecla +, desenhe uma linha reta de 10 mm na imagem da régua e vá para Analisar > Definir escala > Digite " 10" para Distância conhecida > Defina a unidade de comprimento como mm e clique em Ok. Isso determina a proporção de pixels para distância para a imagem macroscópica (Figura 2D).
4. Separe a área da ferida da imagem: Use a ferramenta retângulo para selecionar a área ao redor da ferida (w = 150, h = 150). Registre os valores X e Y, clique com o botão direito do mouse no retângulo > Duplicar > Nomeie o assunto > Pressione Enter. Na nova imagem, pressione + duas vezes para aumentar o zoom (Figura 2E).
5. Salve a imagem cortada seguindo o caminho: Arquivo > Salvar como > Tiff > Digite o nome > Salvar.
6. Crie uma duplicata da imagem cortada para evitar modificações durante a segmentação: Clique com o botão direito do mouse na imagem cortada > Duplicar > Nomeie-a adicionando "Segmentação" ao final. Em seguida, pressione Enter. Na nova imagem, pressione + duas vezes para aumentar o zoom.
7. Separe a imagem em canais de cores seguindo este caminho: Tipo de > de imagem > Pilha RGB. Na imagem do canal vermelho (1/3 Vermelho), clique com o botão direito do mouse em Duplicar e pressione OK na janela Duplicar.
8. Segmente a imagem do canal vermelho. Clique na imagem do canal vermelho, Imagem > Ajustar > Limite. Em seguida, selecione Padrão > Aplicar (Figura 2F).
9. Retifique a região de interesse (ROI) para garantir a cobertura completa da ferida e evitar distorções de segmentação.
   NOTA: Se as áreas ao redor da ferida não estiverem incluídas na segmentação, vá para Processar > Binário > Preencher Furos. Para remover pontos pretos fora da ferida, vá para Processar > Binário > Corroer. Se o comando Erodir reduzir o tamanho da ferida, corrija-o usando Processar > Binário > Dilate.
10. Marcar o perímetro do ROI: Editar > seleção > Criar seleção. O ROI será destacado em amarelo. Adicione-o ao ROI Manager seguindo Editar > Seleção > Adicionar ao Manager (Figura 2G).
11. Valide a segmentação: abra a janela Gerenciador de ROI e selecione o ROI a ser revisado: Mais > Traduzir. Insira os valores X e Y registrados na etapa 4 e pressione OK.
    1. Maximize a imagem original e selecione o ROI no ROI Manager. Ajuste a ROI usando as teclas de seta até que ela se alinhe com a ferida (Figura 2H). Se o ROI corresponder à ferida, a segmentação foi bem-sucedida. Caso contrário, repita a partir da etapa 2.
12. Uma vez confirmada a segmentação, obtenha as medidas da ferida: Analisar > Medir. Uma tabela de resultados exibirá os valores de área, perímetro e posição X/Y. Copie esses valores para o software SPSS para documentação e análise estatística (Figura 2I).

Figura 2: Fluxo de trabalho de medição de feridas usando planimetria digital e técnicas de segmentação. (A) Incisão dermoepidérmica usando um punção de biópsia estéril de 5 mm. (B) Colocar o camundongo em uma câmara de anestesia inalada por 3 min. (C) Documentação fotográfica posicionando o camundongo anestesiado na cabine de fotos e prendendo seu focinho dentro de uma máscara de sevoflurano. (D) Abrir a imagem obtida no ImageJ e dimensioná-la usando a régua como referência. (E) Extraindo a área da ferida usando a ferramenta retângulo. (F) Separar a imagem em canais RGB e processar o canal vermelho. (G) Delinear e gerenciar a região de interesse (ROI). (H) Validar a segmentação combinando o ROI com a ferida. (I) Medir os parâmetros da ferida e registrar os resultados para análise estatística. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Eutanásia pós-procedimento

NOTA: O estudo é concluído após 14 dias, momento em que as feridas em roedores saudáveis normalmente atingem estágios avançados de cicatrização. Nesta fase, os camundongos foram sacrificados humanamente seguindo o procedimento de eutanásia estabelecido institucionalmente aprovado.

1. Prepare o equipamento. Certifique-se de que a câmara de eutanásia esteja limpa, seca e de tamanho apropriado para acomodar os ratos sem superlotação. Conecte a câmara a uma fonte de CO₂ de grau médico com um regulador de fluxo.
2. Transfira suavemente os ratos para a câmara para minimizar o estresse. Certifique-se de que eles estejam em um ambiente calmo com o mínimo de distúrbios externos.
3. Defina a taxa de fluxo de CO₂ para 20% -30% do volume da câmara por minuto, conforme recomendado pelas Diretrizes da AVMA para a Eutanásia de Animais. Aumente gradualmente a concentração de CO₂ para evitar induzir angústia ou desconforto nos camundongos.
4. Observe os camundongos de perto durante o procedimento. Procure sinais de perda gradual de consciência, incluindo atividade e respiração reduzidas, seguidas de apneia e parada cardíaca.
5. Confirme a morte quando os ratos não estiverem mais respirando e não mostrarem sinais de movimento; Aguarde mais 1-2 minutos para garantir a cessação completa das funções vitais. Verifique a morte confirmando a ausência de reflexos (por exemplo, reflexo da córnea) e atividade cardíaca.
6. Transfira as carcaças para recipientes designados de Resíduos Biológicos Perigosos. Siga os protocolos institucionais e as diretrizes nacionais para o descarte seguro de restos mortais.
7. Registre o número de animais sacrificados, a data e quaisquer observações relevantes para garantir a conformidade com os padrões éticos e institucionais.

Após o dimensionamento das imagens no software ImageJ, o perímetro médio (Tabela 1) e a área (Tabela 2) das feridas, juntamente com seus respectivos desvios-padrão, foram obtidos por meio de segmentação digital. Esses valores foram registrados do dia zero ao décimo quarto dia (D0-D14).

Em modelos pré-clínicos, a análise quantitativa da evolução de feridas traumáticas em modelos pré-clínicos enfrenta desafios devido a fatores como tamanho da ferida, resposta inflamatória localizada³⁴, localização e/ou manipulação. Existem métodos de planimetria manual direta³⁶ e digital indireta 11,16,37,38 para essas medições.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse relacionados a esta pesquisa.

Os autores gostariam de agradecer ao Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCyT, CVU: 933600) por meio da doação para fornecer financiamento, e ao Laboratorio Nacional de Investigación y Desarrollo de Radiofármacos del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares (LANIDER-ININ) por seu apoio. Além disso, a Figura 2 foi elaborada com o auxílio do software BioRender (2020), disponível em BioRender.com/p67z056.