Microscopia intravital para estudar as interações plaquetário-leucocitário-endotelial no fígado de camundongo

A microscopia intravital é uma ferramenta poderosa que fornece informações sobre as relações temporais e espaciais de processos rápidos e/ou sequenciais. Descrevemos um protocolo para avaliar as interações proteína-proteína e as interações plaqueta-neutrófilo-endotelial em sinusóides hepáticos em um modelo murino de sepse experimental (endotoxemia).

Inflamação e trombose são processos complexos que ocorrem principalmente na microcirculação. Embora a histologia padrão possa fornecer informações sobre a via final da inflamação e da trombose, ela não é capaz de mostrar as mudanças temporais que ocorrem ao longo do curso de tempo desses processos. A microscopia intravital (IVM) é o uso de imagens de animais vivos para obter informações temporais sobre os processos fisiológicos in vivo. Este método é particularmente poderoso ao avaliar as interações celulares e proteicas dentro da circulação devido aos eventos rápidos e sequenciais que muitas vezes são necessários para que essas interações ocorram. Embora o IVM seja uma metodologia de imagem extremamente poderosa, capaz de visualizar processos complexos in vivo, há uma série de fatores metodológicos que são importantes a serem considerados ao planejar um estudo de IVM. Este artigo descreve o processo de realização de imagens intravitais do fígado, identificando considerações importantes e possíveis armadilhas que podem surgir. Assim, este artigo descreve o uso da MIV para estudar as interações plaquetas-leucócitos-endoteliais em sinusóides hepáticos para estudar as contribuições relativas de cada um em diferentes modelos de lesão hepática aguda.

Inflamação e trombose são processos complexos que ocorrem principalmente na microcirculação. Este protocolo descreve a preparação cirúrgica que permite a imagem da microvasculatura hepática in vivo. Embora a histologia padrão possa fornecer informações sobre as vias finais da inflamação e da trombose, ela não pode mostrar as mudanças temporais que ocorrem ao longo do processo. Além disso, este método é particularmente poderoso ao avaliar as interações celulares e proteicas transitórias que ocorrem dentro da circulação microvascular devido à sua capacidade de capturar, via videomicroscopia, as interações muitas vezes rápidas e sequenciais que ocorrem dentro de sistemas biológicos. Este artigo descreve o uso da microscopia intravital para estudar as interações plaquetário-leucocitário-endotelial em sinusóides hepáticos para estudar a contribuição relativa de cada um em diferentes modelos de lesão hepática aguda.

Embora essa preparação cirúrgica e a modalidade de imagem tenham o potencial de serem adaptadas a uma série de modelos inflamatórios e patológicos, dois modelos de inflamação vascular são descritos aqui: um modelo de endotoxemia de sepse murina e lesão hepática induzida por paracetamol (APAP). A injeção de endotoxina (lipopolissacarídeo; LPS) para induzir um modelo experimental de sepse murina começou já na década de 1930 com seu isolamento e subsequente exploração como uma molécula-chave na progressão da sepse¹. Embora este modelo seja limitado porque o LPS é apenas um único componente das bactérias Gram-negativas, este é um método amplamente aceito e utilizado que é relativamente simples e rápido de executar. Além disso, replica com rapidez e precisão as manifestações fisiológicas da sepse¹. Dado o papel que a absorção de endotoxinas intestinais desempenha no desenvolvimento de doenças hepáticas e inflamações², este é um excelente modelo para estudar as interações plaquetas-leucócitos-endoteliais no fígado de camundongos.

Além de um modelo LPS de sepse, a overdose de APAP fornece um excelente modelo para o estudo de interações patológicas célula-célula no fígado. A superdosagem de APAP pode levar à insuficiência hepática aguda, marcada por trombocitopenia e acúmulo de plaquetas no fígado, bloqueando subsequentemente a recuperação hepática mediada por leucócitos³. Embora a preparação cirúrgica e a metodologia de imagem para este modelo possam ser adaptadas para uma série de questões biológicas e para estudar vários processos patológicos, tanto o modelo LPS de sepse quanto a lesão hepática induzida por APAP são excelentes modelos para o estudo das interações plaqueta-leucócitos-endotelial in vivo.

O IVM tem algumas vantagens inerentes às técnicas histológicas padrão. Embora os métodos histológicos padrão permitam o estudo de amostras de tecido inteiro ou seccionado e a apreciação de proteínas e arquitetura de tecido, essas metodologias apresentam limitações. Por design, esses processos requerem processamento de tecidos, que tem o potencial de distorcer ou mascarar o que é encontrado no sistema vivo. O tecido deve ser fixado durante o preparo histológico, introduzindo o potencial para artefatos de fixação ou autofluorescência aprimorada. A fixação também pode levar a alterações intracelulares no tecido, e o potencial de fixação inadequada pode levar à degradação do tecido. Além disso, os métodos histológicos não têm o potencial de estudar diretamente os aspectos temporais das interações proteicas ou celulares e têm o potencial de perder interações efêmeras ou pouco frequentes.

Por outro lado, a microscopia intravital de fluorescência permite evitar muitas das complicações e limitações inerentes à histologia padrão. A MIV evita a fixação e, portanto, os artefatos ou degradação tecidual que podem ocorrer durante o preparo histológico. Por design, também permite a imagem de tecidos dentro do sistema biológico vivo e, como tal, o isolamento e o seccionamento do tecido não são necessários. Além disso, permite a imagem e o estudo de processos transitórios ou pouco frequentes, que podem ser difíceis ou impossíveis de capturar usando histologia. Esse método de MIV também pode ser usado para capturar e identificar processos sequenciais (por exemplo, interações iniciadas por plaquetas ou leucócitos, resultando em agregados plaquetários-leucócitos ligados ao endotélio vascular). Finalmente, este método pode ser adaptado a uma série de sistemas de imagem. Dependendo das necessidades do estudo e do conjunto de dados desejado, após a preparação cirúrgica, o fígado externalizado pode ser colocado em quase qualquer sistema de imagem desejado. Aplicamos com sucesso este protocolo a imagens usando microscopia de fluorescência de campo amplo, microscopia de disco giratório, microscopia confocal de varredura a laser usando um scanner de cabeça de ressonância, bem como microscopia de dois fótons. No entanto, não há razão para acreditar que esse método deva ser limitado aos sistemas de microscopia acima mencionados.

Este artigo de métodos descreve um protocolo para IVM, que foi usado anteriormente para estudar as interações plaqueta-leucócitos-endotelial no fígado de camundongo. Esse protocolo tem sido utilizado para comparar a adesão plaquetária-endotelial temporal de plaquetas, marcadas com anticorpos conjugados fluorescentes ou geneticamente modificadas para fluorescência endógena⁴. Este protocolo tem sido usado para avaliar as interações transitórias plaquetas-leucócitos-endoteliais nos sinusóides hepáticos em um modelo endotoxêmico de inflamação hepática e para co-localizar a P-selectina e a proteína recombinante. Além disso, esse protocolo possibilitou determinar se as diferenças observadas na densidade de neutrófilos usando histologia padrão eram resultado de diferenças nas velocidades dos glóbulos vermelhos (como substituto da taxa de fluxo volumétrico)⁵. Finalmente, esse método tem sido usado para avaliar o recrutamento de plaquetas pelas células de Kupffer nos sinusóides hepáticos em um modelo agudo de lesão hepática induzida por APAP⁶. Este corpo de trabalho não teria sido possível usando métodos histológicos padrão. Como afirmado, este protocolo pode ser adaptado para uma variedade de sistemas de imagem e, com preparação cirúrgica adequada, escolha de anticorpos fluorescentes e configurações de imagem, este protocolo é altamente confiável e reprodutível para o estudo da patologia hepática.

Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Baylor College of Medicine e pelo Comitê de Pesquisa e Desenvolvimento do Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center. Todos os experimentos são terminais, com a eutanásia realizada no final sob um plano cirúrgico de anestesia. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo.

1. Preparação de anticorpos e corantes

1. Seleção de anticorpos e corantes
   NOTA: O número de cores simultâneas observadas dependerá da configuração específica do microscópio. No sistema usado aqui, quatro comprimentos de onda diferentes podem ser visualizados simultaneamente.
   1. Visualizando embarcações:
      1. Com base no desenho experimental, marque a vasculatura com um anticorpo específico do endotélio (por exemplo, CD31) e/ou uma molécula uniformemente distribuída no plasma (por exemplo, dextrana ou albumina).
         NOTA: Este artigo descreve o uso de dextrano rotulado com Texas Red (150 kDa; 250 μg/camundongo). O benefício desta proteína de grande peso molecular está em sua capacidade de permanecer dentro da vasculatura durante a inflamação aguda. Deve-se ter cuidado ao usar a marcação de anticorpos para evitar anticorpos que tenham o potencial de interferir na função endotelial.
   2. Visualizando plaquetas:
      1. Para identificar plaquetas, use camundongos geneticamente modificados (por exemplo, R26R-EYFP^{f / f} / PF4-Cre) ou anticorpos específicos para plaquetas (por exemplo, anti-GPIbβ) para IVM. Para obter informações detalhadas sobre o uso da marcação fluorescente de plaquetas, consulte uma publicação anterior⁴.
         NOTA: Aqui, são usados anticorpos anti-GPIbβ marcados com DyLight488 (X488; 6 μg/camundongo). Deve-se ter cuidado ao usar a marcação de anticorpos para evitar interferência na função ou adesão plaquetária.
   3. Visualizando leucócitos:
      1. Semelhante às plaquetas de imagem, visualize os leucócitos de interesse com camundongos geneticamente modificados (por exemplo, LysM-EGFP para granulócitos) ou anticorpos específicos para leucócitos (por exemplo, Ly6G para neutrófilos murinos). Para seguir este protocolo, use anticorpos anti-Ly6G marcados com Brilliant Violet 421 (BV421) (3 μg/camundongo). Em experimentos agudos (<6 h), marque neutrófilos com 3 μg de anti-Ly6G (clone 1A8) por animal.
         NOTA: Ao usar o anticorpo anti-Ly6G (clone 1A8), ^deve-se notar que este anticorpo tem sido usado para esgotar neutrófilos (0,05-1 mg de anticorpo/camundongo)^7-9 após pelo menos 24 h e/ou com injeções repetidas. Os anticorpos anti-Ly6G (1A8) também foram relatados para afetar a adesão e a transmigração de neutrófilos em altas (mas não baixas) tensões de cisalhamento em certas, mas não em todas as situações ^9,10. Portanto, a dosagem de anticorpos deve ser escolhida cuidadosamente para cada caso.
   4. Proteínas adicionais:
      1. Dependendo do número de lasers e conjuntos de filtros/detectores disponíveis em um determinado sistema de imagem, adicione mais comprimentos de onda para identificar mais objetos simultaneamente, tomando cuidado para evitar sobreposição espectral.
         NOTA: Este protocolo descreve a imagem de um 4º objeto, P-selectina (clone Psel.KO2.3), usando um anticorpo anti-P-selectina marcado com PerCP-eFluor 710 (4 μg/camundongo). Embora a maioria das descrições e imagens neste artigo sejam para lesão hepática aguda induzida por LPS, outros modelos de lesão podem ser de interesse e podem exigir rótulos alternativos. Consulte a discussão para obter uma descrição dos anticorpos usados para lesões induzidas por APAP⁶.
2. Remoção de conservantes e esterilização
   NOTA: Embora existam anticorpos e corantes disponíveis comercialmente prontos para injeção em animais, a maioria deles terá transportadores ou conservantes (por exemplo, azida de sódio) que podem ser prejudiciais aos animais ou adicionar variáveis de confusão. Anticorpos e corantes contendo carreadores ou conservantes devem ser dialisados contra solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco sem cálcio ou magnésio (DPBS^-/-; ou outros tampões fisiológicos).
   1. Despeje 500 mL de DPBS^-/- (~ 1.000 vezes o volume do anticorpo/corante a ser dialisado) em um béquer com uma barra de agitação magnética. Conecte um de 7.000 MWCO a uma bóia flutuante e coloque-o no tampão de diálise por pelo menos 5 min para pré-condicionar a membrana. Remova o e seque as bordas de plástico com um lenço de papel sem fiapos. Evite tocar na membrana de diálise.
   2. Injete o anticorpo/corante no através de uma das quatro portas usando uma agulha de 18-20 G. Coloque o com o anticorpo/corante no tampão de diálise. Colocar o copo sobre um agitador magnético e dialisar durante pelo menos 1 h a 4 °C. Troque o tampão de diálise.
   3. Repita a diálise e a troca do tampão de diálise na etapa 1.2.2 por no mínimo mais duas vezes (pelo menos três trocas).
   4. Remova o e seque as bordas de plástico com um lenço de papel sem fiapos. Evite tocar na membrana de diálise. Aspire o anticorpo/corante do através de uma porta não utilizada usando uma agulha de 18-20 G.
   5. Numa capa de cultura de tecidos, esterilizar as preparações utilizando um filtro de 0,2 μm antes da utilização em animais. Conservar as porções não utilizadas em tubos estéreis a 4 °C.
3. Controles
   1. Embora os controles exatos necessários para cada experimento variem dependendo do desenho do estudo, certifique-se de incluir coortes simuladas adequadas, grupos tratados com e não tratados com veículo, bem como controles de isotipo para excluir rotulagem não específica e efeitos biológicos ao analisar os resultados do estudo.

2. Injeção intraperitoneal de endotoxina

NOTA: Para avaliar as interações plaqueta-neutrófilo-endotelial nos sinusóides hepáticos em um modelo experimental de sepse murina, a injeção de endotoxina pode ser usada.

1. Pese os camundongos para determinar a quantidade de endotoxina a ser injetada (5 mg / kg; Escherichia coli sorotipo O111:B4; teor de endotoxina 1 x 10⁶ UE/mg).
   NOTA: A potência e o efeito da endotoxina dependem da espécie e da cepa e podem variar de lote para lote¹¹. Portanto, para maximizar a consistência dos resultados, os experimentos devem ser conduzidos com o mesmo lote de endotoxina¹².
2. Retire a endotoxina diluída com solução salina normal (cloreto de sódio a 0,9%) em uma seringa com uma agulha de 27 G acoplada. Na mão não dominante, segure o mouse pela nuca usando o polegar e o indicador. Usando a outra mão, coloque tração na cauda para expor o abdômen e coloque a cauda entre o quinto dedo e a palma da mão não dominante.
3. Limpe o abdômen com etanol 70%. Insira a agulha no abdômen inferior esquerdo (ou direito) e injete a endotoxina.
   NOTA: Deve-se tomar cuidado para evitar inserir a agulha muito profundamente, pois existe o risco de lesão de órgãos que pode confundir os experimentos (por exemplo, lesões nos intestinos, intestinos, rins, etc.).
4. Execute as etapas 2.1-2.3 em animais de controle usando solução salina normal (ou veículo).
   NOTA: A lesão hepática induzida por APAP pode ser realizada usando uma metodologia semelhante à acima, usando APAP em vez de endotoxina⁶. Consulte a discussão para obter detalhes relacionados ao modelo de lesão hepática induzida por APAP.

3. Indução e manutenção da anestesia dos animais e eutanásia

1. Coloque os animais sob um plano cirúrgico de anestesia. Mantenha a anestesia usando isoflurano inalado por meio de um nariz ou tubo de traqueostomia. Avalie e ajuste o nível de anestesia monitorando o movimento após uma pitada no dedo do pé.
2. Realizar a eutanásia no final de todos os experimentos por exsanguinação sob um plano cirúrgico de anestesia seguido de pneumotórax bilateral.

4. Cateterismo da veia jugular e traqueia

1. Realize uma traqueostomia para facilitar a respiração e a colocação de cateteres vasculares para a injeção de anticorpos/corantes marcados.
   NOTA: Um microscópio de dissecção cirúrgica ou lupas são úteis no cateterismo.
2. Raspe o pelo do pescoço e abdômen; Remova o excesso de pelos. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 °C, usando uma sonda retal para monitorar a temperatura central. Esfregue o pescoço com betadina seguida de etanol a 70%.
3. Faça uma incisão vertical na linha média do pescoço e exponha a traqueia usando dissecção romba.
   1. Traqueostomia
      1. Prepare um tubo de traqueostomia PE90 com uma agulha romba de 21 G inserida (Figura 1A).
         NOTA: Adicionar um chanfro de ~45° à extremidade do tubo de traqueostomia pode ajudar a facilitar sua inserção na traqueia. Alternativamente, um cateter intravenoso periférico de 18-20 G também pode ser substituído pelo tubo PE90.
      2. Uma vez que a pele e a fáscia são incisadas, reflita as glândulas salivares para longe do centro.
      3. Usando dissecção romba, separe o músculo esternotireóideo para dar melhor acesso à traqueia.
         NOTA: Tome cuidado para evitar os vasos fornecedores e as artérias carótidas adjacentes à traqueia.
      4. Faça uma pequena incisão horizontal (~ 1-2 mm) entre os anéis traqueais no lado ventral / anterior da traqueia (Figura 1B).
         NOTA: O uso de tesouras Vannas facilitará a dissecção adequada. Certifique-se de que apenas a face anterior da traqueia esteja incisada; A transecção completa da traqueia dificultará a canulação da traqueia e corre o risco de danificar as estruturas vasculares próximas.
      5. Passe um tubo de traqueostomia no orifício. Certifique-se de que a ponta do tubo não seja inserida além da carina.
      6. Prenda o tubo de traqueostomia dentro da traqueia amarrando uma sutura de seda # 4-0 ao redor da traqueia e do tubo, usando os anéis traqueais como suporte (Figura 1C).
   2. Canulação jugular externa
      1. Prepare um cateter jugular (Figura 2) usando tubo PE50 (OD 0,97 mm, ID 0,58 mm) com tubo PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) inserido em uma extremidade (Figura 2 inserção) e uma agulha romba 22 G ou 23 G inserida na outra. Use adesivo para garantir que a tubulação não escorregue ou vaze. Conecte uma seringa cheia de solução salina normal estéril para lavar o cateter.
      2. Exponha a veia jugular externa (EJV) após a reflexão das glândulas salivares. Usando dissecção romba, libere o EJV do tecido conjuntivo circundante (Figura 3A).
      3. Usando suturas de seda # 4-0, ligue a extremidade cranial do EJV visualizado e coloque uma alça solta ao redor da extremidade caudal do EJV (Figura 3B). Prenda as extremidades de cada sutura com hemostáticos e retraia suavemente os dois hemostáticos um do outro para ajudar a expor o EJV.
         NOTA: A região ideal para canular é entre os ramos da veia jugular anterior cranialmente e a veia jugular interna caudalmente. Para facilitar a colocação da sutura, dobre um pedaço (~15 cm) de sutura ao meio e passe a extremidade dobrada por baixo do EJV com um par de pinças enquanto levanta o EJV com um par de pinças separado para evitar o rolamento do vaso. Em seguida, corte a sutura para fazer dois comprimentos separados.
      4. Usando uma tesoura Vannas, faça uma pequena incisão (~1 mm) na superfície anterior do EJV. Insira uma agulha romba de 30 G dobrada (aumentada com um pino minucienal de 0,15 mm limado sem corte e inserido na ponta da agulha) no EJV através da incisão e levante-o suavemente para facilitar a passagem do cateter contendo solução salina normal para o EJV.
         NOTA: Certifique-se de que o cateter e o hub não tenham bolhas de ar antes de inserir e lavar no mouse. Um êmbolo de ar pode ser letal para o animal.
      5. Quando o cateter estiver dentro do EJV, afrouxe a alça caudal apenas o suficiente para permitir a passagem do cateter mais profundamente na veia. Verifique a colocação do cateter aspirando sangue e lavando o cateter para verificar se há vazamentos (Figura 3C).
      6. Usando a alça caudal, prenda o cateter dentro do EJV. Usando a sutura craniana, prenda o cateter na extremidade cranial da VEJ para minimizar a decanulação acidental (Figura 3D).
      7. Feche a incisão da pele do pescoço com sutura de seda # 4-0.

5. Exteriorização do fígado

1. Limpe o abdômen com um esfoliante betadine seguido de etanol a 70%.
2. Faça uma incisão vertical de ~ 1 cm na pele do abdômen superior, começando na base do esterno. Usando dissecção romba, separe a pele dos músculos abdominais. Cauterize os grandes vasos de alimentação da pele e dos músculos para minimizar o sangramento durante as etapas a seguir (Figura 4A).
3. Faça uma incisão horizontal de ~ 1-2 cm da pele seguida pelo músculo abdominal, dividindo a incisão vertical na etapa 5.2 aproximadamente no topo do fígado visível; usar uma ferramenta de cauterização para auxiliar na hemostasia da pele (Figura 4B).
   NOTA: O tamanho da incisão do abdômen é fundamental para a imagem ideal do fígado. Se a abertura for muito pequena, existe o risco de isquemia hepática devido ao alongamento excessivo ou impacto da artéria hepática e/ou veia porta. Se a abertura for muito grande, outros órgãos, como os intestinos, também podem ser exteriorizados e interferir na imagem.
4. Corte um círculo de aproximadamente 1 cm no centro de uma gaze de 2 pol x 2 pol e umedeça-o com solução salina normal morna. Posicione a gaze de forma que a abertura fique centralizada sobre a incisão. Separe suavemente as bordas da incisão e aplique uma leve pressão para cima no abdômen para exteriorizar o fígado de modo que o fígado fique facilmente apoiado sobre a gaze umedecida ( Figura 4C ).
5. Coloque o mouse na bandeja de imagem em decúbito ventral, com o fígado centralizado sobre a lamínula (Figura 4D).
   NOTA: Em um animal de controle, o fígado deve parecer marrom. Um microscópio confocal de varredura a laser invertido com um scanner de cabeça de ressonância bidirecional é usado para IVM neste protocolo. Portanto, uma impressora 3D foi usada para criar uma bandeja IVM personalizada (Figura 5). Os arquivos .stl criados para impressão 3D são fornecidos (Arquivo Suplementar 1); ajustes podem ser necessários para atender às necessidades dos indivíduos.
6. Transfira o animal para o microscópio invertido.

6. Imagem de microscopia intravital do fígado

NOTA: Este protocolo usa um microscópio confocal de varredura a laser com um scanner de cabeça de ressonância bidirecional para microscopia intravital. Para estabilizar a frequência da cabeça de ressonância, ligue o sistema por pelo menos 30 minutos antes da imagem. Sistemas diferentes podem ter recursos diferentes. A discussão sobre isso está fora do escopo deste artigo. Entre em contato com os representantes do equipamento para obter detalhes técnicos de sistemas específicos.

1. Para manter um plano cirúrgico de anestesia, conecte o animal ao sistema de liberação de isoflurano.
   NOTA: Dependendo do protocolo experimental, pode ser necessária ventilação mecânica (vs. ventilação espontânea).
2. Coloque uma almofada de aquecimento radiante sobre o animal, usando a sonda retal para manter uma temperatura central de 37 °C.
   NOTA: Neste protocolo, um pedaço retangular de espuma que se encaixa ao redor da bandeja IVM atua como um isolante e um espaçador para colocar a almofada de aquecimento radiante (Figura 4D).
3. Defina a torre da objetiva para a ampliação desejada, aplicando óleo de imersão conforme necessário. Para seguir este protocolo, use a objetiva de óleo de silicone 60x/NA1.30 com zoom óptico de 1x.
4. Uma vez identificado o plano focal, identifique ≥10 campos de visão aleatórios, evitando as áreas próximas às bordas do fígado.
   NOTA: Como o fígado exibe autofluorescência no canal de isotiocianato de fluoresceína (FITC), use a epifluorescência para identificar rapidamente o plano focal geral.
   1. Dependendo do sistema, identifique as bordas do fígado visível usando epifluorescência no canal FITC e registre as coordenadas do estágio (x,y).
   2. Use os limites (x,y) do fígado e um gerador de números aleatórios para identificar coordenadas aleatórias (x,y). Para um campo de visão aceitável, procure (a) a presença de vasos dispersos por todo o campo de visão; b) ≥80% dos vasos no mesmo plano focal; e (c) ≥1 campo de visão longe de quaisquer bordas do fígado (exemplo na Figura 6). Se o foco da análise da imagem estiver nas interações plaquetas-leucócitos-endoteliais nos sinusóides hepáticos, exclua campos com vasos cujos diâmetros sejam ≥15 μm (os sinusóides murinos geralmente têm ≤10 μm de diâmetro).

7. Análise de imagem

NOTA: ImageJ/FIJI foi usado para processar todas as imagens deste artigo. FIJI (fiji.sc) é uma versão de código aberto do Image J (imagej.nih.gov) que tem mais funcionalidade por meio do uso de plug-ins e macros adicionais¹³.

1. Abra os arquivos multicanal com lapso de tempo no ImageJ/FIJI.
   NOTA: Dependendo da plataforma, podem ser necessários programas/plug-ins adicionais. O ImageJ/FIJI possui um importador de bioformatos que pode abrir vários tipos diferentes de arquivos, como os arquivos .oir da Olympus. Aqui, os arquivos foram convertidos para .tif porque é um formato mais usado.
2. Certifique-se de que a escala correta esteja definida; Procure a proporção de pixel/μm e o intervalo de tempo nos metadados/propriedades.
3. Use filtros diferentes para remover o ruído de fundo (por exemplo, um filtro mediano com um raio de 2 pixels usado neste protocolo). Certifique-se de que o processamento seja semelhante entre todas as imagens para minimizar a variação no pós-processamento. À medida que as contagens e comprimentos estão sendo comparados nesses experimentos, em vez da intensidade média de fluorescência, filtre para melhorar a clareza e a identificação e medição das interações célula-célula.
   NOTA: O uso e a magnitude dos filtros dependerão do tamanho do(s) alvo(s) de interesse e da relação sinal-ruído nas imagens.
4. Como há heterogeneidade entre os campos de visão na densidade vascular, medir a área vascular total em cada campo usando o pincel de seleção (Figura 7).
   1. Clique com o botão direito do mouse na ferramenta de seleção oval e escolha a ferramenta pincel de seleção .
   2. Ajuste o tamanho do pincel clicando duas vezes no ícone da ferramenta pincel de seleção .
   3. Trace os vasos para destacá-los/selecioná-los. Para excluir partes da seleção, use o botão esquerdo do mouse [alt] e adicione partes usando o botão esquerdo [shift].
   4. Pressione [M] para medir a área selecionada.
      NOTA: Se a escala da imagem tiver sido definida corretamente, a saída deve estar em μm², que é convertida em mm².
5. Conte o número de plaquetas e leucócitos no campo. Considere as células como células aderidas se elas se moveram <1 corpo celular por mais de 30 s. Calcule o número de células (plaquetas e/ou leucócitos) por mm².
6. Para estimar o fluxo sanguíneo relativo dentro de cada vaso, meça a velocidade média dos glóbulos vermelhos (RBC) como um substituto usando o plug-in MTrackJ no ImageJ / FIJI (imagescience.org/meijering/ software / mtrackj) ¹⁴, conforme descrito anteriormente⁵. Identifique as hemácias como defeitos de enchimento redondos ou em forma de disco no canal de dextrano. Salve as faixas para manutenção de registros, análise assíncrona e verificação.
   NOTA: Um exemplo disso é mostrado na Figura 8 e no Vídeo Suplementar S1.

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito. O conteúdo não representa as opiniões do Departamento de Assuntos de Veteranos dos EUA ou do Governo dos Estados Unidos.

Este trabalho foi apoiado pelo NIH / NIGMS GM-123261 (FWL) e NIH / NHLBI HL139425 (JC). O apoio à pesquisa também foi financiado pelo NIH / NHLBI HL116524.