Microscopía intravital para estudiar las interacciones plaqueta-leucocito-endotelial en el hígado de ratón

La microscopía intravital es una herramienta poderosa que proporciona información sobre las relaciones temporales y espaciales de procesos rápidos y/o secuenciales. En este trabajo describimos un protocolo para evaluar tanto las interacciones proteína-proteína como las interacciones plaqueta-neutrófilos-endoteliales en sinusoides hepáticos en un modelo murino de sepsis experimental (endotoxemia).

La inflamación y la trombosis son procesos complejos que ocurren principalmente en la microcirculación. Aunque la histología estándar puede proporcionar información sobre la vía final tanto para la inflamación como para la trombosis, no es capaz de mostrar los cambios temporales que ocurren a lo largo del curso temporal de estos procesos. La microscopía intravital (IVM) es el uso de imágenes de animales vivos para obtener información temporal sobre los procesos fisiológicos in vivo. Este método es particularmente poderoso cuando se evalúan las interacciones celulares y proteicas dentro de la circulación debido a los eventos rápidos y secuenciales que a menudo son necesarios para que ocurran estas interacciones. Si bien la MIV es una metodología de imagen extremadamente poderosa capaz de ver procesos complejos in vivo, hay una serie de factores metodológicos que es importante tener en cuenta al planificar un estudio de MIV. Este documento describe el proceso de realización de imágenes intravitales del hígado, identificando consideraciones importantes y posibles dificultades que pueden surgir. Por lo tanto, este artículo describe el uso de la MIV para estudiar las interacciones plaqueta-leucocito-endotelial en sinusoides hepáticos para estudiar las contribuciones relativas de cada uno en diferentes modelos de lesión hepática aguda.

La inflamación y la trombosis son procesos complejos que ocurren principalmente en la microcirculación. Este protocolo describe la preparación quirúrgica que permite obtener imágenes de la microvasculatura hepática in vivo. Aunque la histología estándar puede proporcionar información sobre las vías finales tanto para la inflamación como para la trombosis, no puede mostrar los cambios temporales que ocurren a lo largo del proceso. Además, este método es particularmente poderoso cuando se evalúan las interacciones celulares y proteicas transitorias que ocurren dentro de la circulación microvascular debido a su capacidad para capturar, a través de videomicroscopía, las interacciones a menudo rápidas y secuenciales que ocurren dentro de los sistemas biológicos. Este artículo describe el uso de la microscopía intravital para estudiar las interacciones plaqueta-leucocito-endotelial en sinusoides hepáticos para estudiar la contribución relativa de cada uno en diferentes modelos de lesión hepática aguda.

Si bien esta preparación quirúrgica y esta modalidad de imagen tienen el potencial de adaptarse a una gran cantidad de modelos inflamatorios y patológicos, aquí se describen dos modelos de inflamación vascular: un modelo de endotoxemia de sepsis murina y una lesión hepática inducida por acetaminofén (APAP). La inyección de endotoxina (lipopolisacárido; LPS) para inducir un modelo experimental de sepsis murina comenzó ya en la década de 1930 con su aislamiento y posterior exploración como una molécula clave en la progresión de la sepsis¹. Si bien este modelo es limitado en el sentido de que el LPS es solo un componente de las bacterias gramnegativas, este es un método ampliamente aceptado y utilizado que es relativamente simple y rápido de realizar. Además, replica de forma rápida y precisa las manifestaciones fisiológicas de la sepsis¹. Dado el papel que desempeña la absorción de endotoxinas intestinales en el desarrollo de la enfermedad hepática y la inflamación², este es un modelo excelente para estudiar las interacciones plaqueta-leucocitos-endoteliales en el hígado de ratón.

Además de un modelo LPS de sepsis, la sobredosis de APAP proporciona un modelo excelente para el estudio de las interacciones patológicas célula-célula en el hígado. La sobredosis de APAP puede conducir a insuficiencia hepática aguda, marcada por trombocitopenia y acumulación de plaquetas en el hígado, bloqueando posteriormente la recuperación hepática mediada por leucocitos³. Si bien la preparación quirúrgica y la metodología de imagen para este modelo se pueden adaptar a una serie de cuestiones biológicas y para estudiar diversos procesos patológicos, tanto el modelo LPS de sepsis como la lesión hepática inducida por APAP son excelentes modelos para el estudio de las interacciones plaqueta-leucocito-endotelial in vivo.

La MIV tiene algunas ventajas inherentes sobre las técnicas histológicas estándar. Si bien los métodos histológicos estándar permiten el estudio de muestras de tejido enteras o seccionadas y la apreciación de las proteínas y la arquitectura de los tejidos, estas metodologías tienen limitaciones. Por diseño, estos procesos requieren el procesamiento de tejidos, que tiene el potencial de distorsionar o enmascarar lo que se encuentra en el sistema vivo. El tejido debe fijarse durante la preparación histológica, lo que introduce la posibilidad de artefactos de fijación o autofluorescencia mejorada. La fijación también puede provocar cambios intracelulares en el tejido, y la posibilidad de una fijación inadecuada puede conducir a la degradación del tejido. Además, los métodos histológicos carecen del potencial para estudiar directamente los aspectos temporales de las interacciones proteicas o celulares y tienen el potencial de omitir interacciones efímeras o poco frecuentes.

Por el contrario, la microscopía intravital de fluorescencia permite evitar muchas de las complicaciones y limitaciones inherentes a la histología estándar. La MIV evita la fijación y, por lo tanto, los artefactos o la degradación del tejido que pueden ocurrir durante la preparación histológica. Por diseño, también permite la obtención de imágenes de tejidos dentro del sistema biológico vivo y, como tal, no se requiere aislamiento y sección de tejidos. Además, permite la obtención de imágenes y el estudio de procesos transitorios o poco frecuentes, que pueden ser difíciles o imposibles de capturar mediante histología. Este método de MIV también se puede utilizar para capturar e identificar procesos secuenciales (por ejemplo, interacciones iniciadas por plaquetas o leucocitos que dan lugar a agregados de plaquetas y leucocitos unidos al endotelio vascular). Por último, este método se puede adaptar a una gran cantidad de sistemas de imagen. Dependiendo de las necesidades del estudio y del conjunto de datos deseado, después de la preparación quirúrgica, el hígado externalizado se puede colocar en casi cualquier sistema de imagen que se desee. Hemos aplicado con éxito este protocolo a la obtención de imágenes mediante microscopía de fluorescencia de campo amplio, microscopía de disco giratorio, microscopía confocal de barrido láser mediante un escáner de cabeza de resonancia, así como microscopía de dos fotones. Sin embargo, no hay razón para creer que este método deba limitarse a los sistemas de microscopía antes mencionados.

Este documento de métodos describe un protocolo para la MIV, que se utilizó anteriormente para estudiar las interacciones plaqueta-leucocito-endotelial en el hígado de ratón. Este protocolo se ha utilizado para comparar la adhesión temporal plaquetaria-endotelial de las plaquetas, ya sea marcadas con anticuerpos conjugados fluorescentes o modificadas genéticamente para fluorescencia endógena⁴. Este protocolo se ha utilizado para evaluar las interacciones transitorias plaqueta-leucocito-endotelial en los sinusoides hepáticos en un modelo endotoxémico de inflamación hepática y para colocalizar la P-selectina y la proteína recombinante. Además, este protocolo permitió determinar si las diferencias observadas en la densidad de neutrófilos utilizando la histología estándar eran el resultado de diferencias en las velocidades de los glóbulos rojos (como sustituto del caudal volumétrico)⁵. Finalmente, este método se ha utilizado para evaluar el reclutamiento de plaquetas por las células de Kupffer en los sinusoides hepáticos en un modelo agudo de lesión hepática inducida por APAP⁶. Este trabajo no habría sido posible con los métodos histológicos estándar. Como se ha señalado, este protocolo se puede adaptar a una variedad de sistemas de imagen y, con la preparación quirúrgica adecuada, la elección de anticuerpos fluorescentes y la configuración de imágenes, este protocolo es altamente confiable y reproducible para el estudio de la patología hepática.

Todos los protocolos para animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Baylor College of Medicine y el Comité de Investigación y Desarrollo del Centro Médico de Asuntos de Veteranos Michael E. DeBakey. Todos los experimentos son terminales, con la eutanasia realizada al final bajo un plano quirúrgico de anestesia. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo.

1. Preparación de anticuerpos y colorantes

1. Selección de anticuerpos y colorantes
   NOTA: El número de colores simultáneos observados dependerá de la configuración específica del microscopio. En el sistema utilizado aquí, se pueden visualizar cuatro longitudes de onda diferentes simultáneamente.
   1. Visualización de buques:
      1. Con base en el diseño experimental, marcar la vasculatura con un anticuerpo específico del endotelio (por ejemplo, CD31) y/o una molécula que se distribuya uniformemente en el plasma (por ejemplo, dextrano o albúmina).
         NOTA: Este artículo describe el uso del dextrano marcado con Texas Red (150 kDa; 250 μg/ratón). El beneficio de esta proteína de gran peso molecular radica en su capacidad para permanecer dentro de la vasculatura durante la inflamación aguda. Se debe tener cuidado al usar el marcaje de anticuerpos para evitar anticuerpos que tengan el potencial de interferir con la función endotelial.
   2. Visualización de plaquetas:
      1. Para identificar las plaquetas, utilice ratones modificados genéticamente (por ejemplo, R26R-EYFP^f/f/PF4-Cre) o anticuerpos específicos de plaquetas (por ejemplo, anti-GPIbβ) para la MIV. Para obtener información detallada sobre el uso del etiquetado fluorescente de plaquetas, consulte una publicación anterior⁴.
         NOTA: En este caso, se utilizan anticuerpos anti-GPIbβ marcados con DyLight488 (X488; 6 μg/ratón). Se debe tener cuidado al usar el etiquetado de anticuerpos para evitar interferencias con la función o adhesión de las plaquetas.
   3. Visualización de leucocitos:
      1. De manera similar a la obtención de imágenes de plaquetas, visualice los leucocitos de interés con ratones modificados genéticamente (por ejemplo, LysM-EGFP para granulocitos) o anticuerpos específicos de leucocitos (por ejemplo, Ly6G para neutrófilos murinos). Para seguir este protocolo, utilice anticuerpos anti-Ly6G marcados con Brilliant Violet 421 (BV421) (3 μg/ratón). En experimentos agudos (<6 h), marque los neutrófilos con 3 μg de anti-Ly6G (clon 1A8) por animal.
         NOTA: Cuando se utiliza el anticuerpo anti-Ly6G (clon 1A8), debe tenerse en cuenta que este anticuerpo se ha utilizado para agotar neutrófilos (0,05-1 mg de anticuerpo/ratón)^{7-9 después de} al menos 24 h y/o con inyecciones repetidas. También se ha descrito que los anticuerpos anti-Ly6G (1A8) afectan a la adhesión y transmigración de los neutrófilos con un esfuerzo de cizallamiento alto (pero no bajo) en ^{ciertas situaciones,} pero no en todas ^9,10. Por lo tanto, la dosis de anticuerpos debe elegirse cuidadosamente para cada caso.
   4. Proteínas adicionales:
      1. Dependiendo del número de láseres y conjuntos de filtros/detectores disponibles en un sistema de imágenes en particular, agregue más longitudes de onda para identificar más objetos simultáneamente mientras tiene cuidado de evitar la superposición espectral.
         NOTA: Este protocolo describe la obtención de imágenes de un 4º objeto, P-selectina (clon Psel.KO2.3), utilizando un anticuerpo anti-P-selectina marcado con PerCP-eFluor 710 (4 μg/ratón). Aunque la mayoría de las descripciones e imágenes de este artículo se refieren a la lesión hepática aguda inducida por LPS, otros modelos de lesión pueden ser de interés y pueden requerir etiquetas alternativas. Véase la discusión para una descripción de los anticuerpos utilizados para la lesión inducida por APAP⁶.
2. Eliminación de conservantes y esterilización
   NOTA: Aunque hay anticuerpos y tintes disponibles comercialmente listos para inyectar en animales, la mayoría de ellos tendrán portadores o conservantes (por ejemplo, azida de sodio) que pueden ser dañinos para los animales o agregar variables de confusión. Los anticuerpos y colorantes que contienen portadores o conservantes deben dializarse contra la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio ni magnesio (DPBS^-/-; u otros tampones fisiológicos).
   1. Vierta 500 mL de DPBS^-/- (~1.000 veces el volumen del anticuerpo/colorante que se va a dializar) en un vaso de precipitados con una barra agitadora magnética. Conecte un casete de 7.000 MWCO a una boya flotante y colóquelo en el tampón de diálisis durante al menos 5 minutos para preacondicionar la membrana. Retire el casete y seque los bordes de plástico con un pañuelo sin pelusa. Evite tocar la membrana de diálisis.
   2. Inyecte el anticuerpo/colorante en el casete a través de uno de los cuatro puertos con una aguja de 18-20 G. Coloque el casete con el anticuerpo/tinte en el tampón de diálisis. Coloque el vaso de precipitados en un agitador magnético y dialice durante al menos 1 h a 4 °C. Cambie el tampón de diálisis.
   3. Repita la diálisis y el cambio del tampón de diálisis en el paso 1.2.2 durante un mínimo de dos veces más (al menos tres intercambios).
   4. Retire el casete y seque los bordes de plástico con un pañuelo sin pelusa. Evite tocar la membrana de diálisis. Aspire el anticuerpo/colorante del casete a través de un puerto no utilizado con una aguja de 18-20 G.
   5. En una campana de cultivo de tejidos, esterilice las preparaciones con un filtro de 0,2 μm antes de usarlas en animales. Almacene las porciones no utilizadas en tubos estériles a 4 °C.
3. Mandos
   1. Si bien los controles exactos necesarios para cada experimento variarán según el diseño del estudio, asegúrese de incluir cohortes simuladas adecuadas, grupos tratados con vehículos y grupos no tratados, así como controles de isotipos para excluir el etiquetado no específico y los efectos biológicos al analizar los resultados del estudio.

2. Inyección intraperitoneal de endotoxinas

NOTA: Para evaluar las interacciones plaqueta-neutrófilos-endoteliales en los sinusoides hepáticos en un modelo experimental de sepsis murina, se puede utilizar la inyección de endotoxinas.

1. Pesar los ratones para determinar la cantidad de endotoxina a inyectar (5 mg/kg; Escherichia coli serotipo O111:B4; contenido de endotoxinas 1 x 10⁶ UE/mg).
   NOTA: La potencia y el efecto de las endotoxinas dependen de la especie y la cepa y pueden variar de un lote a otro¹¹. Por lo tanto, para maximizar la consistencia de los resultados, se deben realizar experimentos con el mismo lote de endotoxina¹².
2. Extraiga la endotoxina diluida con solución salina normal (cloruro de sodio al 0,9%) en una jeringa con una aguja de 27 G adherida. En la mano no dominante, sujete el ratón por el pescuezo con el pulgar y el índice. Con la otra mano, pon tracción en la cola para exponer el abdomen y coloca la cola entre el quinto dedo y la palma de la mano no dominante.
3. Limpiar el abdomen con etanol al 70%. Inserte la aguja en la parte inferior izquierda (o derecha) del abdomen e inyecte la endotoxina.
   NOTA: Se debe tener cuidado de evitar insertar la aguja demasiado profundamente porque existe el riesgo de lesiones orgánicas que pueden confundir los experimentos (por ejemplo, lesiones en los intestinos, intestinos, riñones, etc.).
4. Realice los pasos 2.1-2.3 en animales de control utilizando solución salina normal (o vehículo).
   NOTA: La lesión hepática inducida por APAP se puede lograr utilizando una metodología similar a la anterior, usando APAP en lugar de endotoxina⁶. Consulte la discusión para obtener detalles relacionados con el modelo de lesión hepática inducida por APAP.

3. Inducción y mantenimiento de la anestesia de los animales y eutanasia

1. Coloque a los animales bajo un plano quirúrgico de anestesia. Mantener la anestesia con isoflurano inhalado a través de una nariz o un tubo de traqueostomía. Evalúe y ajuste el nivel de anestesia mediante el monitoreo del movimiento después de un pinzamiento en el dedo del pie.
2. Realizar la eutanasia al final de todos los experimentos por exanguinación bajo un plano quirúrgico de anestesia seguido de neumotórax bilateral.

4. Cateterismo de la vena yugular y la tráquea

1. Realizar una traqueotomía para facilitar la respiración y la colocación de catéteres vasculares para la inyección de anticuerpos/colorantes marcados.
   NOTA: Un microscopio de disección quirúrgica o lupas son útiles en el cateterismo.
2. Afeita el pelaje del cuello y el abdomen; Elimina el exceso de vello. Coloque al animal en una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal a 37 °C, utilizando una sonda rectal para controlar la temperatura central. Frote el cuello con betadine seguido de etanol al 70%.
3. Haga una incisión vertical en la línea media del cuello y exponga la tráquea con una disección roma.
   1. Traqueostomía
      1. Prepare un tubo de traqueostomía PE90 con una aguja roma de 21 G insertada (Figura 1A).
         NOTA: Agregar un bisel de ~45° al extremo del tubo de traqueostomía puede ayudar a facilitar su inserción en la tráquea. Alternativamente, también se puede sustituir un catéter intravenoso periférico de 18-20 G por un tubo de PE90.
      2. Una vez que la piel y la fascia estén incisas, refleje las glándulas salivales lejos del centro.
      3. Usando una disección roma, separe el músculo esternotiroideo para dar un mejor acceso a la tráquea.
         NOTA: Tenga cuidado de evitar los vasos irrigadores y las arterias carótidas adyacentes a la tráquea.
      4. Haga una pequeña incisión horizontal (~1-2 mm) entre los anillos traqueales en el lado ventral/anterior de la tráquea (Figura 1B).
         NOTA: El uso de tijeras Vannas facilitará una disección adecuada. Asegúrese de que solo la cara anterior de la tráquea esté incisa; La transección completa de la tráquea dificultará la canulación de la tráquea y corre el riesgo de dañar las estructuras vasculares cercanas.
      5. Pase un tubo de traqueostomía en el orificio. Asegúrese de que la punta del tubo no se inserte más allá de la carina.
      6. Asegure el tubo de traqueostomía dentro de la tráquea atando una sutura de seda #4-0 alrededor de la tráquea y el tubo, utilizando los anillos traqueales como soporte (Figura 1C).
   2. Canulación yugular externa
      1. Prepare un catéter yugular (Figura 2) utilizando un tubo de PE50 (diámetro exterior 0,97 mm, diámetro interior 0,58 mm) con un tubo de PE10 (diámetro exterior 0,61 mm, diámetro interior 0,28 mm) insertado en un extremo (figura 2 recuadro) y una aguja roma de 22 G o 23 G insertada en el otro. Use adhesivo para asegurarse de que el tubo no se deslice ni tenga fugas. Coloque una jeringa llena de solución salina normal estéril para enjuagar el catéter.
      2. Exponga la vena yugular externa (EJV) después de la reflexión de las glándulas salivales. Usando una disección roma, libere el EJV del tejido conectivo circundante (Figura 3A).
      3. Usando suturas de seda #4-0, ligar el extremo craneal del EJV visualizado y colocar un lazo suelto alrededor del extremo caudal del EJV (Figura 3B). Sujete los extremos de cada sutura con hemostáticos y retraiga suavemente los dos hemostáticos entre sí para ayudar a exponer el EJV.
         NOTA: La región óptima para la cánula es entre las ramas de la vena yugular anterior cranealmente y la vena yugular interna caudalmente. Para facilitar la colocación de la sutura, doble un trozo (~15 cm) de sutura por la mitad y pase el extremo doblado por debajo del EJV con un par de pinzas mientras eleva el EJV con un par de pinzas separadas para evitar que el vaso ruede. Luego, corte la sutura para hacer dos longitudes separadas.
      4. Con las tijeras Vannas, haga una pequeña incisión (~1 mm) en la superficie anterior de la EJV. Inserte una aguja roma doblada de 30 G (aumentada con un alfiler de minutien de 0,15 mm limado sin romos e insertado en la punta de la aguja) en la EJV a través de la incisión y levántela suavemente para facilitar el paso del catéter que contiene solución salina normal a la EJV.
         NOTA: Asegúrese de que el catéter y el cubo no tengan burbujas de aire antes de insertarlos y enjuagarlos en el mouse. Un émbolo gaseoso puede ser letal para el animal.
      5. Una vez que el catéter esté dentro de la EJV, afloje el asa caudal lo suficiente para permitir el paso del catéter más profundamente en la vena. Verifique la colocación del catéter aspirando sangre y enjuagando el catéter para verificar si hay fugas (Figura 3C).
      6. Usando el asa caudal, asegure el catéter dentro del EJV. Con la sutura craneal, fije el catéter al extremo craneal de la EJV para minimizar la decanulación accidental (Figura 3D).
      7. Cierre la incisión en la piel del cuello con una sutura de seda #4-0.

5. Exteriorización del hígado

1. Limpie el abdomen con un exfoliante de betadine seguido de etanol al 70%.
2. Haga una incisión vertical de ~ 1 cm en la piel de la parte superior del abdomen comenzando en la base del esternón. Usando una disección roma, separe la piel de los músculos abdominales. Cauterice los grandes vasos de alimentación de la piel y los músculos para minimizar el sangrado durante los siguientes pasos (Figura 4A).
3. Haga una incisión horizontal de ~ 1-2 cm de la piel seguida del músculo abdominal, dividiendo la incisión vertical en el paso 5.2 aproximadamente en la parte superior del hígado visible; utilizar una herramienta de cauterización para ayudar en la hemostasia de la piel (Figura 4B).
   NOTA: El tamaño de la incisión en el abdomen es fundamental para obtener imágenes óptimas del hígado. Si la abertura es demasiado pequeña, existe el riesgo de isquemia hepática debido al estiramiento excesivo o al pinzamiento de la arteria hepática y/o la vena porta. Si la abertura es demasiado grande, otros órganos, como los intestinos, también pueden exteriorizarse e interferir con las imágenes.
4. Corta un círculo de aproximadamente 1 cm en el centro de una gasa de 2 pulgadas x 2 y humedécelo con solución salina normal tibia. Coloque la gasa de modo que la abertura quede centrada sobre la incisión. Separe suavemente los bordes de la incisión y aplique una presión ligera y ascendente sobre el abdomen para exteriorizar el hígado, de modo que el hígado descanse fácilmente sobre la gasa humedecida (Figura 4C).
5. Coloque el ratón en la bandeja de imágenes en posición prona, con el hígado centrado sobre el cubreobjetos (Figura 4D).
   NOTA: En un animal de control, el hígado debe tener un aspecto marrón. En este protocolo, se utiliza un microscopio confocal de barrido láser invertido con un escáner de cabeza de resonancia bidireccional para la MIV. Por lo tanto, se utilizó una impresora 3D para crear una bandeja IVM personalizada (Figura 5). Se proporcionan los archivos .stl creados para la impresión 3D (Archivo complementario 1); Es posible que sea necesario realizar ajustes para adaptarse a las necesidades de las personas.
6. Transfiera el animal al microscopio invertido.

6. Imágenes de microscopía intravital hepática

NOTA: Este protocolo utiliza un microscopio confocal de barrido láser con un escáner de cabeza de resonancia bidireccional para microscopía intravital. Para estabilizar la frecuencia del cabezal de resonancia, encienda el sistema durante al menos 30 minutos antes de la toma de imágenes. Diferentes sistemas pueden tener diferentes capacidades. La discusión de estos está fuera del alcance de este artículo. Póngase en contacto con los representantes de equipos para conocer los detalles técnicos de sistemas específicos.

1. Para mantener un plano quirúrgico de anestesia, conecte el animal al sistema de administración de isoflurano.
   NOTA: Dependiendo del protocolo experimental, puede ser necesaria la ventilación mecánica (frente a la ventilación espontánea).
2. Coloque una almohadilla térmica radiante sobre el animal, utilizando la sonda rectal para mantener una temperatura central de 37 °C.
   NOTA: En este protocolo, una pieza rectangular de espuma que se ajusta alrededor de la bandeja IVM actúa como aislante y espaciador sobre el cual se coloca la almohadilla térmica radiante (Figura 4D).
3. Ajuste la torreta del objetivo al aumento deseado, aplicando aceite de inmersión según sea necesario. Para seguir este protocolo, utilice el objetivo de aceite de silicona 60x/NA1.30 con zoom óptico de 1x.
4. Una vez identificado el plano focal, identifique ≥10 campos de visión aleatorios, evitando las áreas cercanas a los bordes del hígado.
   NOTA: Dado que el hígado exhibe autofluorescencia en el canal de isotiocianato de fluoresceína (FITC), utilice la epifluorescencia para identificar rápidamente el plano focal general.
   1. Dependiendo del sistema, identifique los bordes del hígado visible mediante epifluorescencia en el canal FITC y registre las coordenadas de la etapa (x,y).
   2. Utilice los límites (x,y) del hígado y un generador de números aleatorios para identificar las coordenadas aleatorias (x,y). Para un campo de visión aceptable, se debe a) la presencia de buques dispersos por todo el campo de visión; b) el ≥80% de los buques en el mismo plano focal; y (c) ≥1 campo de visión lejos de cualquier borde hepático (ejemplo en la Figura 6). Si el análisis de imágenes se centra en las interacciones plaqueta-leucocito-endotelial en los sinusoides hepáticos, se excluyan los campos con vasos cuyos diámetros sean de ≥15 μm (los sinusoides murinos suelen tener ≤10 μm de diámetro).

7. Análisis de imágenes

NOTA: Se utilizó ImageJ/FIJI para procesar todas las imágenes de este documento. FIJI (fiji.sc) es una versión de código abierto de Image J (imagej.nih.gov) que tiene más funcionalidad mediante el uso de complementos y macros adicionales¹³.

1. Abra los archivos multicanal y time-laped en ImageJ/FIJI.
   NOTA: Dependiendo de la plataforma, es posible que se requieran programas/complementos adicionales. ImageJ/FIJI tiene un importador de bioformatos que puede abrir varios tipos diferentes de archivos, como los archivos .oir de Olympus. Aquí, los archivos se han convertido a .tif porque es un formato más utilizado.
2. Asegúrese de que se haya establecido la escala correcta; Busque la relación píxel/μm y el intervalo de tiempo en los metadatos/propiedades.
3. Utilice diferentes filtros para eliminar el ruido de fondo (por ejemplo, un filtro mediano con un radio de 2 píxeles utilizado en este protocolo). Asegúrese de que el procesamiento sea similar en todas las imágenes para minimizar la variación en el procesamiento posterior. A medida que se comparan los recuentos y las longitudes en estos experimentos, en lugar de la intensidad media de fluorescencia, se filtra para mejorar la claridad y la identificación y medición de las interacciones célula-célula.
   NOTA: El uso y la magnitud de los filtros dependerán del tamaño de los objetivos de interés y de la relación señal-ruido de las imágenes.
4. Dado que existe heterogeneidad entre los campos de visión en la densidad vascular, se mide el área vascular total en cada campo con el pincel de selección (Figura 7).
   1. Haga clic con el botón derecho en la herramienta de selección ovalada y elija la herramienta Pincel de selección .
   2. Ajuste el tamaño del pincel haciendo doble clic en el icono de la herramienta de pincel de selección .
   3. Traza sobre los vasos para resaltarlos o seleccionarlos. Para eliminar partes de la selección, use [alt] y haga clic con el botón izquierdo y agregue partes usando [shift] y haga clic con el botón izquierdo.
   4. Presione [M] para medir el área seleccionada.
      NOTA: Si la escala de la imagen se ha configurado correctamente, la salida debe estar en μm², que se convierte en mm².
5. Cuente la cantidad de plaquetas y leucocitos en el campo. Considere que las células son células adheridas si se movieron <1 cuerpo celular durante 30 s. Calcular el número de células (plaquetas y/o leucocitos) por^mm2.
6. Para estimar el flujo sanguíneo relativo dentro de cada vaso, mida la velocidad media de los glóbulos rojos (RBC) como sustituto utilizando el complemento MTrackJ en ImageJ/FIJI (imagescience.org/meijering/ software/mtrackj)¹⁴, como se describió anteriormente⁵. Identifique los glóbulos rojos como defectos de llenado redondos o en forma de disco en el canal de dextrano. Guarde las pistas para el mantenimiento de registros, el análisis asincrónico y la verificación.
   NOTA: Un ejemplo de esto se muestra en la Figura 8 y en el Video Suplementario S1.

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. El contenido no representa los puntos de vista del Departamento de Asuntos de Veteranos de EE. UU. ni del Gobierno de los Estados Unidos.

Este trabajo fue apoyado por NIH/NIGMS GM-123261 (FWL) y NIH/NHLBI HL139425 (JC). El apoyo a la investigación también fue financiado por el HL116524 de los NIH/NHLBI.