الفحص المجهري داخل الحيوية لدراسة تفاعلات الصفائح الدموية بين الكريات البيض والبطانة في كبد الفأر

الفحص المجهري داخل الحيوية هو أداة قوية توفر نظرة ثاقبة لكل من العلاقات الزمنية والمكانية للعمليات السريعة و / أو المتسلسلة. هنا ، نصف بروتوكولا لتقييم كل من تفاعلات البروتين والبروتين والتفاعلات الصفائح الدموية والعدلات وبطانة في الجيوب الأنفية الكبدية في نموذج الفئران للتعفن التجريبي (تسمم الدم الداخلي).

الالتهاب والتخثر من العمليات المعقدة التي تحدث بشكل أساسي في دوران الأوعية الدقيقة. على الرغم من أن علم الأنسجة القياسي قد يوفر نظرة ثاقبة للمسار النهائي لكل من الالتهاب والتخثر ، إلا أنه غير قادر على إظهار التغيرات الزمنية التي تحدث طوال المسار الزمني لهذه العمليات. الفحص المجهري داخل الحيوية (IVM) هو استخدام التصوير الحيواني الحي لاكتساب نظرة ثاقبة زمنية للعمليات الفسيولوجية في الجسم الحي. هذه الطريقة قوية بشكل خاص عند تقييم التفاعلات الخلوية والبروتينية داخل الدورة الدموية بسبب الأحداث السريعة والمتسلسلة التي غالبا ما تكون ضرورية لحدوث هذه التفاعلات. في حين أن IVM هي منهجية تصوير قوية للغاية قادرة على عرض العمليات المعقدة في الجسم الحي ، إلا أن هناك عددا من العوامل المنهجية التي يجب مراعاتها عند التخطيط لدراسة IVM. توضح هذه الورقة عملية إجراء التصوير داخل الحيوية للكبد ، وتحديد الاعتبارات المهمة والمزالق المحتملة التي قد تنشأ. وهكذا ، تصف هذه الورقة استخدام IVM لدراسة تفاعلات الصفائح الدموية والكريات البيض وبطانة الكبد لدراسة المساهمات النسبية لكل منها في نماذج مختلفة من إصابة الكبد الحادة.

الالتهاب والتخثر من العمليات المعقدة التي تحدث بشكل أساسي في دوران الأوعية الدقيقة. يحدد هذا البروتوكول التحضير الجراحي الذي يسمح بتصوير الأوعية الدموية الدقيقة للكبد في الجسم الحي. على الرغم من أن علم الأنسجة القياسي قد يوفر نظرة ثاقبة للمسارات النهائية لكل من الالتهاب والتخثر ، إلا أنه لا يمكن أن يظهر التغيرات الزمنية التي تحدث طوال العملية. علاوة على ذلك ، فإن هذه الطريقة قوية بشكل خاص عند تقييم التفاعلات الخلوية والبروتينية العابرة التي تحدث داخل الدورة الدموية الوعائية الدقيقة نظرا لقدرتها على التقاط التفاعلات السريعة والمتسلسلة التي تحدث في كثير من الأحيان داخل الأنظمة البيولوجية عبر الفحص المجهري. تصف هذه الورقة استخدام الفحص المجهري داخل الحيوية لدراسة تفاعلات الصفائح الدموية والكريات البيض وبطانة الكبد في الجيوب الأنفية الكبدية لدراسة المساهمة النسبية لكل منها في نماذج مختلفة من إصابة الكبد الحادة.

في حين أن طريقة التحضير الجراحي والتصوير هذه لديها القدرة على التكيف مع مجموعة من النماذج الالتهابية والمرضية ، فقد تم توضيح نموذجين لالتهاب الأوعية الدموية هنا: نموذج تسمم الدم لتعفن الدم في الفئران وإصابة الكبد الناجمة عن الأسيتامينوفين (APAP). حقن السموم الداخلية (عديد السكاريد الدهني; LPS) للحث على نموذج تجريبي لتعفن الدم الفئران بدأ في وقت مبكر من الثلاثينيات من القرن العشرين مع عزله واستكشافه اللاحق كجزيء رئيسي في تطور الإنتان¹. في حين أن هذا النموذج محدود من حيث أن LPS هو مكون واحد فقط من البكتيريا سالبة الجرام ، إلا أن هذه طريقة مقبولة ومستخدمة على نطاق واسع وهي بسيطة نسبيا وسريعة الأداء. علاوة على ذلك ، فإنه يكرر بسرعة ودقة المظاهر الفسيولوجية للتعفن^{الدماغي 1}. بالنظر إلى الدور الذي يلعبه امتصاص السموم الداخلية المعوية في تطور أمراض الكبد والالتهابات² ، يعد هذا نموذجا رائعا لدراسة تفاعلات الصفائح الدموية والكريات البيض وبطانة الرحم في كبد الفأر.

بالإضافة إلى نموذج LPS للتعفن الدموي ، توفر جرعة زائدة من APAP نموذجا ممتازا لدراسة التفاعلات المرضية بين الخلايا والخلايا في الكبد. يمكن أن تؤدي الجرعة الزائدة من APAP إلى فشل كبدي حاد ، يتميز بقلة الصفيحات وتراكم الصفائح الدموية في الكبد ، مما يؤدي لاحقا إلى منع تعافي الكبد بوساطة الكريات البيض³. في حين أن منهجية التحضير الجراحي والتصوير لهذا النموذج يمكن تكييفها لعدد من الأسئلة البيولوجية ولدراسة العمليات المرضية المختلفة ، فإن كلا من نموذج LPS للتعفن الدموي وإصابة الكبد الناجمة عن APAP هما نماذج ممتازة لدراسة تفاعلات الصفائح الدموية والكريات البيض والبطانية في الجسم الحي.

يتمتع IVM ببعض المزايا المتأصلة في التقنيات النسيجية القياسية. بينما تسمح الأساليب النسيجية القياسية بدراسة عينات الأنسجة الكاملة أو المقطعة وتقدير البروتينات وبنية الأنسجة ، فإن هذه المنهجيات تأتي مع قيود. حسب التصميم ، تتطلب هذه العمليات معالجة الأنسجة ، والتي لديها القدرة على تشويه أو إخفاء ما هو موجود في الجهاز الحي. يجب إصلاح الأنسجة أثناء التحضير النسيجي ، مما يؤدي إلى إمكانية التثبيت أو التألق الذاتي المعزز. يمكن أن يؤدي التثبيت أيضا إلى تغييرات داخل الخلايا في الأنسجة ، وقد يؤدي احتمال التثبيت غير السليم إلى تدهور الأنسجة. علاوة على ذلك ، تفتقر الأساليب النسيجية إلى إمكانية الدراسة المباشرة للجوانب الزمنية للتفاعلات البروتينية أو الخلوية ولديها القدرة على فقدان التفاعلات سريعة الزوال أو غير المتكررة.

على العكس من ذلك ، يسمح الفحص المجهري داخل الحيوية الفلوري للمرء بتجنب العديد من المضاعفات والقيود الكامنة في علم الأنسجة القياسي. يتجنب IVM التثبيت ، وبالتالي القطع الأثرية أو تدهور الأنسجة الذي يمكن أن يحدث أثناء التحضير النسيجي. حسب التصميم ، فإنه يسمح أيضا بتصوير الأنسجة داخل النظام البيولوجي الحي ، وعلى هذا النحو ، لا يلزم عزل الأنسجة وتقسيمها. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح بتصوير ودراسة العمليات العابرة أو غير المتكررة ، والتي قد يكون من الصعب أو المستحيل التقاطها باستخدام الأنسجة. يمكن أيضا استخدام طريقة IVM هذه لالتقاط وتحديد العمليات المتسلسلة (على سبيل المثال ، التفاعلات التي تبدأ من الصفائح الدموية أو الكريات البيض مما يؤدي إلى مجاميع الصفائح الدموية والكريات البيض المرتبطة ببطانة الأوعية الدموية). أخيرا ، يمكن تكييف هذه الطريقة مع مجموعة من أنظمة التصوير. اعتمادا على احتياجات الدراسة ومجموعة البيانات المطلوبة ، بعد التحضير الجراحي ، يمكن وضع الكبد الخارجي على أي نظام تصوير مرغوب فيه تقريبا. لقد نجحنا في تطبيق هذا البروتوكول على التصوير باستخدام الفحص المجهري الفلوري واسع المجال ، والفحص المجهري للقرص الدوار ، والفحص المجهري متحد البؤر للمسح بالليزر باستخدام ماسح ضوئي لرأس الرنين ، بالإضافة إلى الفحص المجهري ثنائي الفوتون. ومع ذلك ، لا يوجد سبب للاعتقاد بأن هذه الطريقة يجب أن تقتصر على أنظمة الفحص المجهري المذكورة أعلاه.

تحدد ورقة الطرق هذه بروتوكولا للإدارة المتكاملة للنسب الدموية ، والذي تم استخدامه سابقا لدراسة تفاعلات الصفائح الدموية والكريات البيض وبطانة الرحم في كبد الفأر. تم استخدام هذا البروتوكول لمقارنة التصاق الصفائح الدموية والبطانية الصدغية للصفائح الدموية ، إما المسمى بأجسام مضادة مترافقة فلورية أو معدلة وراثيا للتألق الداخلي⁴. تم استخدام هذا البروتوكول لتقييم التفاعلات العابرة للصفائح الدموية والكريات البيض وبطانة في الجيوب الأنفية للكبد في نموذج السم الداخلي لالتهاب الكبد والمشاركة في تحديد موقع P-selectin والبروتين المؤتلف. بالإضافة إلى ذلك ، أتاح هذا البروتوكول تحديد ما إذا كانت الاختلافات التي شوهدت في كثافة العدلات باستخدام الأنسجة القياسية كانت نتيجة للاختلافات في سرعات خلايا الدم الحمراء (كبديل لمعدل التدفق الحجمي)⁵. أخيرا ، تم استخدام هذه الطريقة لتقييم تجنيد الصفائح الدموية بواسطة خلايا Kupffer في الجيوب الأنفية الكبدية في نموذج حاد لإصابة الكبد التي يسببها APAP⁶. لم يكن هذا العمل ممكنا باستخدام الأساليب النسيجية القياسية. كما ذكرنا ، يمكن تكييف هذا البروتوكول مع مجموعة متنوعة من أنظمة التصوير ، ومع التحضير الجراحي المناسب ، واختيار الأجسام المضادة الفلورية ، وإعدادات التصوير ، فإن هذا البروتوكول موثوق به للغاية وقابل للتكرار لدراسة أمراض الكبد.

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في كلية بايلور للطب ولجنة البحث والتطوير في المركز الطبي لشؤون المحاربين القدامى مايكل إي ديباكي. جميع التجارب نهائية ، حيث يتم إجراء القتل الرحيم في النهاية تحت مستوى جراحي للتخدير. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. تحضير الأجسام المضادة والأصباغ

1. اختيار الأجسام المضادة والصبغة
   ملاحظة: يعتمد عدد الألوان المتزامنة التي تمت ملاحظتها على إعداد المجهر المحدد. في النظام المستخدم هنا ، يمكن تصور أربعة أطوال موجية مختلفة في وقت واحد.
   1. تصور السفن:
      1. بناء على التصميم التجريبي ، قم بتسمية الأوعية الدموية إما بجسم مضاد خاص بالبطانة (على سبيل المثال ، CD31) و / أو جزيء موزع بشكل موحد في البلازما (على سبيل المثال ، ديكستران أو ألبومين).
         ملاحظة: تصف هذه المقالة استخدام ديكستران تكساس ذو العلامات الحمراء (150 كيلو دالتون ؛ 250 ميكروغرام / فأر). تكمن فائدة هذا البروتين ذو الوزن الجزيئي الكبير في قدرته على البقاء داخل الأوعية الدموية أثناء الالتهاب الحاد. يجب توخي الحذر عند استخدام وضع العلامات على الأجسام المضادة لتجنب الأجسام المضادة التي لديها القدرة على التداخل مع وظيفة البطانة.
   2. تصور الصفائح الدموية:
      1. لتحديد الصفائح الدموية ، استخدم إما الفئران المعدلة وراثيا (على سبيل المثال ، R26R-EYFP^{f / f} / PF4-Cre) أو الأجسام المضادة الخاصة بالصفائح الدموية (على سبيل المثال ، مضاد ل GPIbβ) للIVM. للحصول على معلومات متعمقة حول استخدام الملصقات الفلورية للصفائح الدموية ، راجع المنشور السابق⁴.
         ملاحظة: هنا ، يتم استخدام الأجسام المضادة المضادة ل GPIbβ المسمى DyLight488 (X488 ؛ 6 ميكروغرام / فأر). يجب توخي الحذر عند استخدام ملصقات الأجسام المضادة لتجنب التداخل مع وظيفة الصفائح الدموية أو التصاقها.
   3. تصور الكريات البيض:
      1. على غرار تصوير الصفائح الدموية ، تصور الكريات البيض ذات الأهمية إما مع الفئران المعدلة وراثيا (على سبيل المثال ، LysM-EGFP للخلايا الحبيبية) أو الأجسام المضادة الخاصة بالخلايا البيضاء (على سبيل المثال ، Ly6G لعدلات الفئران). لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم الأجسام المضادة المضادة ل Ly6G المسمى Brilliant Violet 421 (BV421) (3 ميكروغرام / فأر). في التجارب الحادة (<6 ساعات) ، قم بتسمية العدلات ب 3 ميكروغرام من مضاد Ly6G (استنساخ 1A8) لكل.
         ملاحظة: عند استخدام الجسم المضاد ل Ly6G (استنساخ 1A8) ، تجدر الإشارة إلى أن هذا الجسم المضاد قد تم استخدامه لاستنفاد العدلات (0.05-1 مجم جسم مضاد / فأر) ^7-9 بعد 24 ساعة على الأقل و / أو مع الحقن المتكرر. كما تم الإبلاغ عن أن الأجسام المضادة ل Ly6G (1A8) تؤثر على التصاق العدلات والتحول في إجهاد القص المرتفع (ولكن ليس المنخفض) في بعض المواقف ، ولكن ليس كلها ، ^9،10. لذلك ، يجب اختيار جرعة الأجسام المضادة بعناية لكل حالة.
   4. بروتينات إضافية:
      1. اعتمادا على عدد الليزر ومجموعات المرشحات / أجهزة الكشف المتوفرة على نظام تصوير معين ، أضف المزيد من الأطوال الموجية لتحديد المزيد من الكائنات في وقت واحد مع الحرص على تجنب التداخل الطيفي.
         ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تصوير كائن رابع ، P-selectin (استنساخ Psel.KO2.3) ، باستخدام جسم مضاد مضاد ل P-selectin المسمى PerCP-eFluor 710 (4 ميكروغرام / فأر). على الرغم من أن غالبية الأوصاف والصور الواردة في هذه الورقة تخص إصابة الكبد الحادة الناجمة عن LPS ، إلا أن نماذج الإصابات الأخرى قد تكون ذات أهمية وقد تتطلب تسميات بديلة. انظر المناقشة للحصول على وصف للأجسام المضادة المستخدمة للإصابة التي يسببها APAP⁶.
2. إزالة المواد الحافظة والتعقيم
   ملاحظة: على الرغم من وجود أجسام مضادة وأصباغ متاحة تجاريا جاهزة للحقن في ، إلا أن معظمها سيحتوي على ناقلات أو مواد حافظة (مثل أزيد الصوديوم) قد تكون ضارة بالحيوانات أو تضيف متغيرات مربكة. يجب غسيل الأجسام المضادة والأصباغ التي تحتوي على ناقلات أو مواد حافظة ضد محلول ملحي Dulbecco المخزن بالفوسفات بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم (DPBS^-/- ؛ أو غيرها من المخازن المؤقتة الفسيولوجية).
   1. صب 500 مل DPBS ^{- /-} (~ 1,000 ضعف الحجم من الجسم المضاد / الصبغة المراد تحليلها) في دورق بقضيب تحريك مغناطيسي. قم بتوصيل كاسيت 7,000 MWCO بعوامة عائمة وضعها في مخزن غسيل الكلى لمدة 5 دقائق على الأقل لتكييف الغشاء مسبقا. قم بإزالة الكاسيت وامسح الحواف البلاستيكية حتى تجف بمنديل خال من النسالة. تجنب لمس غشاء غسيل الكلى.
   2. قم بحقن الجسم المضاد / الصبغة في الكاسيت من خلال أحد المنافذ الأربعة باستخدام إبرة 18-20 جراما. ضع الكاسيت مع الجسم المضاد / الصبغة في مخزن غسيل الكلى. ضع الدورق على محرك مغناطيسي وغسيل الكلى لمدة ساعة واحدة على الأقل عند 4 درجات مئوية. قم بتغيير المخزن المؤقت لغسيل الكلى.
   3. كرر غسيل الكلى وتغيير المخزن المؤقت لغسيل الكلى في الخطوة 1.2.2 مرتين أخريين على الأقل (ثلاث عمليات تبادل على الأقل).
   4. قم بإزالة الكاسيت وامسح الحواف البلاستيكية حتى تجف بمنديل خال من النسالة. تجنب لمس غشاء غسيل الكلى. استنشط الجسم المضاد / الصبغة من الكاسيت من خلال منفذ غير مستخدم باستخدام إبرة 18-20 جم.
   5. في غطاء زراعة الأنسجة ، قم بتعقيم المستحضرات باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر قبل استخدامها في. قم بتخزين الأجزاء غير المستخدمة في أنابيب معقمة عند 4 درجات مئوية.
3. عناصر التحكم
   1. في حين أن الضوابط الدقيقة اللازمة لكل تجربة ستختلف اعتمادا على تصميم الدراسة ، تأكد من تضمين مجموعات زائفة مناسبة ، ومجموعات معالجة بالمركبات وغير معالجة بالمركبات ، بالإضافة إلى ضوابط النمط المتماثل من أجل استبعاد الملصقات غير المحددة والتأثيرات البيولوجية عند تحليل نتائج الدراسة.

2. حقن الذيفان الداخلي داخل الصفاق

ملاحظة: لتقييم تفاعلات الصفائح الدموية والعدلات والبطانية في الجيوب الأنفية للكبد في نموذج تجريبي لتعفن الدم الفئراني ، يمكن استخدام حقن السموم الداخلية.

1. وزن الفئران لتحديد كمية السموم الداخلية المراد حقنها (5 مجم / كجم ؛ الإشريكية القولونية النمط المصلي O111: B4 ؛ محتوى السموم الداخلية 1 × 10⁶ الاتحاد الأوروبي / ملغ).
   ملاحظة: تعتمد فاعلية وتأثير السموم الداخلية على الأنواع والسلالات وقد تختلف من دفعة إلى^{أخرى 11}. لذلك ، لتحقيق أقصى قدر من اتساق النتائج ، يجب إجراء التجارب بنفس الكمية من السموم الداخلية¹².
2. ارسم السم الداخلي المخفف بمحلول ملحي عادي (0.9٪ كلوريد الصوديوم) في حقنة بإبرة 27 جم متصلة. في اليد غير المهيمنة، أمسك الماوس من القفظة باستخدام الإبهام والسبابة. باستخدام اليد الأخرى ، ضع الجر على الذيل لفضح البطن ووضع الذيل بين الرقم الخامس وراحة اليد غير المهيمنة.
3. نظف البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. أدخل الإبرة في أسفل اليسار (أو الأيمن) البطن وحقن السم الداخلي.
   ملاحظة: يجب توخي الحذر لتجنب إدخال الإبرة بعمق شديد لأن هناك خطر إصابة الأعضاء التي قد تربك التجارب (على سبيل المثال ، إصابة الأمعاء والأمعاء والكلى وما إلى ذلك).
4. قم بتنفيذ الخطوات 2.1-2.3 في المراقبة باستخدام محلول ملحي عادي (أو مركبة).
   ملاحظة: يمكن تحقيق إصابة الكبد الناجمة عن APAP باستخدام منهجية مماثلة على النحو الوارد أعلاه ، باستخدام APAP بدلا من الذيفان^{الداخلي 6}. انظر المناقشة للحصول على التفاصيل المتعلقة بنموذج إصابة الكبد الناجم عن APAP.

3. تحريض وصيانة تخدير والقتل الرحيم

1. ضع تحت مستوى جراحي للتخدير. حافظ على التخدير باستخدام الأيزوفلوران المستنشق عبر مخروط الأنف أو أنبوب فغر القصبة الهوائية. تقييم وضبط مستوى التخدير من خلال مراقبة الحركة بعد قرصة إصبع القدم.
2. إجراء القتل الرحيم في نهاية جميع التجارب عن طريق القتل الرحيم تحت مستوى جراحي للتخدير متبوعا بالتهاب الرئة الثنائي.

4. قسطرة الوريد الوداجي والقصبة الهوائية

1. إجراء بضع القصبة الهوائية لتسهيل التنفس ووضع القسطرة الوعائية لحقن الأجسام المضادة / الأصباغ المصنفة.
   ملاحظة: المجهر الجراحي أو العدسات مفيدة في القسطرة.
2. حلق الفراء من الرقبة والبطن. إزالة الشعر الزائد. ضع على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية ، باستخدام مسبار المستقيم لمراقبة درجة الحرارة الأساسية. افرك الرقبة بالبيتادين متبوعا بنسبة 70٪ إيثانول.
3. قم بعمل شق عمودي في خط الوسط في الرقبة وكشف القصبة الهوائية باستخدام تشريح حاد.
   1. فغر القصبة الهوائية
      1. قم بإعداد أنبوب فغر القصبة الهوائية PE90 مع إدخال إبرة حادة 21 جم (الشكل 1 أ).
         ملاحظة: قد تساعد إضافة شطبة ~ 45 درجة إلى نهاية أنبوب فغر القصبة الهوائية في تسهيل إدخاله في القصبة الهوائية. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استبدال قسطرة وريدية محيطية 18-20 جم بأنابيب PE90.
      2. بمجرد شق الجلد واللفافة ، اعكس الغدد اللعابية بعيدا عن المركز.
      3. باستخدام تشريح حاد ، افصل عضلة القص والدرقية لإتاحة وصول أفضل إلى القصبة الهوائية.
         ملاحظة: احرص على تجنب الأوعية الإمدادة والشرايين السباتية المجاورة للقصبة الهوائية.
      4. قم بعمل شق أفقي صغير (~ 1-2 مم) بين حلقات القصبة الهوائية على الجانب البطني / الأمامي من القصبة الهوائية (الشكل 1 ب).
         ملاحظة: سيسهل استخدام مقص Vannas التشريح المناسب. تأكد من شق الوجه الأمامي للقصبة الهوائية فقط ؛ سيجعل القطع الكامل للقصبة الهوائية من الصعب قنية القصبة الهوائية ويخاطر بإتلاف هياكل الأوعية الدموية القريبة.
      5. مرر أنبوب فغر القصبة الهوائية في الحفرة. تأكد من عدم إدخال طرف الأنبوب بعد الكارينا.
      6. قم بتأمين أنبوب فغر القصبة الهوائية داخل القصبة الهوائية عن طريق ربط خياطة حريرية # 4-0 حول القصبة الهوائية والأنبوب ، باستخدام حلقات القصبة الهوائية كدعم (الشكل 1 ج).
   2. قنية الوداجي الخارجية
      1. قم بإعداد قسطرة وداجي (الشكل 2) باستخدام أنبوب PE50 (OD 0.97 مم ، معرف 0.58 مم) مع أنبوب PE10 (OD 0.61 مم ، معرف 0.28 مم) يتم إدخالها في أحد طرفيها (الشكل 2 داخلي) وإبرة حادة 22 جم أو 23 جم في الطرف الآخر. استخدم مادة لاصقة للتأكد من أن الأنبوب لا ينزلق أو يتسرب. قم بتوصيل حقنة مملوءة بمحلول ملحي عادي معقم لغسل القسطرة.
      2. كشف الوريد الوداجي الخارجي (EJV) بعد انعكاس الغدد اللعابية. باستخدام التشريح الحاد ، حرر EJV من النسيج الضام المحيط (الشكل 3 أ).
      3. باستخدام خيوط الحرير # 4-0 ، قم بربط الطرف الجمجمي ل EJV المرئي وضع حلقة فضفاضة حول الطرف الذيلي ل EJV (الشكل 3 ب). قم بتثبيت طرفي كل خياطة مع مرقئ وسحب المرقئ برفق بعيدا عن بعضهما البعض للمساعدة في كشف EJV.
         ملاحظة: المنطقة المثلى للقنية هي بين فروع الوريد الوداجي الأمامي في الجمجمة والوريد الوداجي الداخلي الذيلي. لتسهيل وضع الخيط ، قم بطي قطعة (~ 15 سم) من الخيط إلى نصفين وقم بتمرير الطرف المنحني أسفل EJV بزوج واحد من الملقط أثناء رفع EJV بزوج منفصل من الملقط لمنع تدحرج الوعاء. ثم قم بقص الخيط لعمل طولين منفصلين.
      4. باستخدام مقص Vannas ، قم بعمل شق صغير (~ 1 مم) في السطح الأمامي ل EJV. أدخل إبرة حادة مثنية 30 جم (معززة بدبوس 0.15 مم دقيقة يتم إدخالها بشكل صريح وإدخالها في طرف الإبرة) في EJV من خلال الشق وارفعها برفق لتسهيل مرور القسطرة التي تحتوي على محلول ملحي عادي إلى EJV.
         ملاحظة: تأكد من عدم احتواء القسطرة والمحور على أي فقاعات هواء قبل إدخالها وشطفها في الماوس. قد يكون الصمة الهوائية قاتلا للحيوان.
      5. بمجرد أن تكون القسطرة داخل EJV ، قم بفك الحلقة الذيلية بما يكفي للسماح بمرور القسطرة بشكل أعمق في الوريد. تحقق من وضع القسطرة عن طريق شفط الدم وشطف القسطرة للتحقق من وجود تسرب (الشكل 3C).
      6. باستخدام الحلقة الذيلية ، قم بتأمين القسطرة داخل EJV. باستخدام خياطة الجمجمة ، قم بتثبيت القسطرة في نهاية الجمجمة ل EJV لتقليل الإزالة العرضية (الشكل 3 د).
      7. أغلق شق جلد الرقبة بخياطة حريرية # 4-0.

5. إضفاء الطابع الخارجي على الكبد

1. نظف البطن بمقشر البيتادين متبوعا بنسبة 70٪ إيثانول.
2. قم بعمل شق عمودي ~ 1 سم في جلد الجزء العلوي من البطن بدءا من قاعدة القص. باستخدام تشريح حاد ، افصل الجلد عن عضلات البطن. كي أوعية التغذية الكبيرة للجلد والعضلات لتقليل النزيف خلال الخطوات التالية (الشكل 4 أ).
3. قم بعمل شق أفقي ~ 1-2 سم في الجلد متبوعا بعضلة البطن ، وتقسيم الشق الرأسي في الخطوة 5.2 تقريبا في الجزء العلوي من الكبد المرئي ؛ استخدم أداة الكي للمساعدة في إرقاء الجلد (الشكل 4 ب).
   ملاحظة: حجم شق البطن أمر بالغ الأهمية للتصوير الأمثل للكبد. إذا كانت الفتحة صغيرة جدا ، فهناك خطر الإصابة بنقص تروية الكبد بسبب الإفراط في التمدد أو الاصطدام بالشريان الكبدي و / أو الوريد البابي. إذا كانت الفتحة كبيرة جدا ، فقد تكون الأعضاء الأخرى ، مثل الأمعاء ، خارجية أيضا وتتداخل مع التصوير.
4. قم بقص دائرة بطول 1 سم تقريبا في وسط شاش 2 بوصة × 2 وترطيبها بمحلول ملحي عادي دافئ. ضع الشاش بحيث تتمركز الفتحة فوق الشق. اسحب حواف الشق برفق بعيدا عن بعضها البعض واضغط على البطن لإخراج الكبد من الخارج بحيث يستقر الكبد بسهولة فوق الشاش المبلل (الشكل 4 ج).
5. ضع الماوس على درج التصوير في وضع الانبطاح، مع توسيط الكبد فوق الغطاء (الشكل 4 د).
   ملاحظة: في التحكم ، يجب أن يظهر الكبد كستنائي يتم استخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر المقلوب مع ماسح ضوئي لرأس الرنين ثنائي الاتجاه للإدارة المتكاملة للنفايات في هذا البروتوكول. لذلك ، تم استخدام طابعة ثلاثية الأبعاد لإنشاء درج IVM مخصص (الشكل 5). يتم توفير ملفات .stl التي تم إنشاؤها للطباعة ثلاثية الأبعاد (الملف التكميلي 1) ؛ قد تكون التعديلات ضرورية لتناسب احتياجات الأفراد.
6. انقل إلى المجهر المقلوب.

6. التصوير المجهري داخل الكبد

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر مع ماسح ضوئي لرأس الرنين ثنائي الاتجاه للفحص المجهري داخل الحيوية. لتثبيت تردد رأس الرنين ، قم بتشغيل النظام لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التصوير. قد يكون للأنظمة المختلفة قدرات مختلفة. مناقشة هذه خارج نطاق هذه المقالة. اتصل بممثلي المعدات للحصول على التفاصيل الفنية لأنظمة معينة.

1. للحفاظ على مستوى التخدير الجراحي ، قم بتوصيل بنظام توصيل الأيزوفلوران.
   ملاحظة: اعتمادا على البروتوكول التجريبي ، قد تكون التهوية الميكانيكية ضرورية (مقابل التهوية التلقائية).
2. ضع وسادة تسخين مشعة فوق ، باستخدام مسبار المستقيم للحفاظ على درجة حرارة أساسية تبلغ 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تعمل قطعة مستطيلة من الرغوة تتناسب مع صينية IVM كعازل ومباع لوضع وسادة الاحترار المشعة (الشكل 4 د).
3. اضبط البرج الموضوعي على التكبير المطلوب ، وقم بتطبيق زيت الغاطس حسب الضرورة. لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم هدف زيت السيليكون 60x / NA1.30 مع تقريب بصري 1x.
4. بمجرد تحديد المستوى البؤري ، حدد ≥10 مجالات رؤية عشوائية ، وتجنب المناطق القريبة من حواف الكبد.
   ملاحظة: نظرا لأن الكبد يظهر التألق الذاتي في قناة إيزوثيوسيانات الفلوريسئين (FITC) ، استخدم التألق اللوحي لتحديد المستوى البؤري العام بسرعة.
   1. اعتمادا على النظام ، حدد حواف الكبد المرئي باستخدام التألق العرضي في قناة FITC وسجل إحداثيات المرحلة (x ، y).
   2. استخدم حدود الكبد (x,y) ومولد الأرقام العشوائية لتحديد الإحداثيات العشوائية (x,y). وللحصول على مجال رؤية مقبول، ابحث عن (أ) وجود سفن منتشرة في جميع أنحاء مجال الرؤية؛ (ب) وجود سفن منتشرة في جميع أنحاء مجال الرؤية؛ (ب) وجود سفن منتشرة في جميع أنحاء مجال الرؤية؛ (ب) وجود سفن منتشرة في جميع أنحاء مجال الرؤية؛ (ب) وجود س (ب) ≥80 في المائة من الأوعية في نفس المستوى البؤري؛ و (ج) ≥1 مجال رؤية بعيدا عن أي حواف كبد (مثال في الشكل 6). إذا كان تركيز تحليل الصورة على تفاعلات الصفائح الدموية والكريات البيض وبطانة الصفيحات في الجيوب الأنفية الكبدية ، فاستبعد الحقول ذات الأوعية التي يبلغ قطرها ≥15 ميكرومتر (يبلغ قطر الجيوب الأنفية الفئران عادة ≤10 ميكرومتر).

7. تحليل الصور

ملاحظة: تم استخدام ImageJ/FIJI لمعالجة جميع الصور في هذه الورقة. FIJI (fiji.sc) هو إصدار مفتوح المصدر من Image J (imagej.nih.gov) يحتوي على المزيد من الوظائف من خلال استخدام المكونات الإضافية ووحدات الماكرو¹³.

1. افتح الملفات متعددة القنوات ذات المنقضي الزمني في ImageJ / FIJI.
   ملاحظة: اعتمادا على النظام الأساسي ، قد تكون هناك حاجة إلى برامج / مكونات إضافية إضافية. يحتوي ImageJ / FIJI على مستورد التنسيقات الحيوية الذي يمكنه فتح عدة أنواع مختلفة من الملفات ، مثل ملفات .oir بواسطة Olympus. هنا ، تم تحويل الملفات إلى .tif لأنها تنسيق أكثر استخداما.
2. تأكد من ضبط المقياس الصحيح ؛ ابحث عن نسبة البكسل / الميكرومتر والفاصل الزمني في البيانات الوصفية / الخصائص.
3. استخدم فلاتر مختلفة لإزالة ضوضاء الخلفية (على سبيل المثال ، مرشح متوسط بنصف قطر 2 بكسل مستخدم في هذا البروتوكول). تأكد من أن المعالجة متشابهة بين جميع الصور لتقليل التباين في المعالجة اللاحقة. نظرا لمقارنة الأعداد والأطوال في هذه التجارب ، بدلا من متوسط شدة التألق ، قم بالتصفية لتحسين الوضوح وتحديد وقياس تفاعلات الخلية الخلية.
   ملاحظة: يعتمد استخدام المرشحات وحجمها على حجم الهدف (الأهداف) محل الاهتمام ونسبة الإشارة إلى الضوضاء في الصور.
4. نظرا لوجود عدم تجانس بين مجالات الرؤية في كثافة الأوعية الدموية ، قم بقياس إجمالي مساحة الأوعية الدموية في كل حقل باستخدام فرشاة الاختيار (الشكل 7).
   1. انقر بزر الماوس الأيمن فوق أداة التحديد البيضاوي واختر أداة فرشاة التحديد .
   2. اضبط حجم الفرشاة بالنقر المزدوج فوق أيقونة أداة فرشاة التحديد .
   3. تتبع فوق الأوعية لتمييزها / تحديدها. لحذف أجزاء من التحديد، استخدم النقر بزر الماوس الأيسر [alt] وأضف أجزاء باستخدام [shift] والنقر بزر الماوس الأيسر.
   4. اضغط على [M] لقياس المنطقة المحددة.
      ملاحظة: إذا تم ضبط مقياس الصورة بشكل صحيح ، فيجب أن يكون الإخراج بالميكرومتر² ، والذي يتم تحويله إلى مم².
5. احسب عدد الصفائح الدموية والكريات البيض في الحقل. ضع في اعتبارك الخلايا لتكون خلايا ملتصقة إذا تحركت <1 جسم خلية على مدى 30 ثانية. احسب عدد الخلايا (الصفائح الدموية و / أو الكريات البيض) لكل مم².
6. لتقدير تدفق الدم النسبي داخل كل وعاء ، قم بقياس متوسط سرعة خلايا الدم الحمراء (RBC) كبديل باستخدام المكون الإضافي MTrackJ في ImageJ / FIJI (imagescience.org/meijering/ software / mtrackj) ¹⁴ ، كما هو موضح^{سابقا 5}. تحديد كرات الدم الحمراء على أنها عيوب تعبئة مستديرة أو على شكل قرص في قناة ديكستران. احفظ المسارات لحفظ السجلات والتحليل غير المتزامن والتحقق.
   ملاحظة: يظهر مثال على ذلك في الشكل 8 والفيديو التكميلي S1.

تقييم تأثير مجال قضيب الفيمنتين في التصاق الكريات البيض بالبطانة الملتهبة
يحدث ارتباط Leukocyte P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) بالبطانة والصفائح الدموية P-selectin خلال المرحلة الحادة من التهاب إصابة الكبد الناجم عن الإنتان. ومع ذلك ، فقد ثبت أن مجال القضيب البشري المؤتلف من...

الغرض من ورقة الطرق هذه هو تحديد الخطوات اللازمة لالتقاط صور ومقاطع فيديو عالية الدقة داخل الحيوية لكبد الفأر بشكل موثوق في ظل ظروف الاستتباب واتباع إعطاء الذيفان الداخلي أو APAP. في حين أن هذا البروتوكول قد سمح بالإنتاج المتسق للبيانات حول تفاعلات الصفائح الدموية والكري...

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة. لا تمثل المحتويات وجهات نظر وزارة شؤون المحاربين القدامى الأمريكية أو حكومة الولايات المتحدة.

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIGMS GM-123261 (FWL) و NIH / NHLBI HL139425 (JC). كما تم تمويل الدعم البحثي من قبل HL116524 المعاهد الوطنية للصحة / NHLBI.