Microscopia eletrônica de transmissão: uma ferramenta de patologia cirúrgica para neuroblastoma

Os tumores pediátricos de pequenas células azuis redondas são uma coleção intrigante e desafiadora de neoplasias. Portanto, a microscopia eletrônica de transmissão (MET) e o conhecimento profissional de tumores pediátricos podem ser extremamente valiosos na patologia cirúrgica. Aqui, apresentamos um protocolo para realizar MET para diagnóstico de neuroblastoma, um dos tumores sólidos mais comuns na infância.

Os tumores pediátricos de pequenas células azuis redondas (PSRBCT) são uma coleção intrigante e desafiadora de neoplasias. A microscopia óptica de pequenos tumores redondos de células azuis identifica pequenas células redondas. Eles abrigam um núcleo geralmente hipercromático e citoplasma basofílico relativamente escasso. Os tumores pediátricos de pequenas células azuis redondas incluem várias entidades. Normalmente, eles incorporam tumor de Wilms, neuroblastoma, rabdomiossarcoma, sarcoma de Ewing, retinoblastoma, linfoma e osteossarcoma de pequenas células, entre outros. Mesmo utilizando imuno-histoquímica, o diagnóstico diferencial dessas neoplasias pode ser controverso à microscopia de luz. Uma coloração fraca ou um fundo ambíguo podem impedir os patologistas de tomar a decisão diagnóstica adequada. Além disso, a biologia molecular pode fornecer uma quantidade esmagadora de dados difíceis de distingui-los, e algumas translocações podem ser vistas em mais de uma categoria. Assim, a microscopia eletrônica de transmissão (MET) pode ser extremamente valiosa. Aqui enfatizamos o protocolo moderno para dados TEM do neuroblastoma. Células tumorais com emaranhados de processos citoplasmáticos contendo grânulos neurossecretores podem diagnosticar neuroblastoma.

O trabalho de um patologista pode ser bastante desafiador tanto no diagnóstico clínico quanto nos campos de pesquisa. A evolução da microscopia de luz nos^séculos 18 e 19 foi notável. O poder de um microscópio eletrônico depende principalmente do comprimento de onda dos elétrons, que é menor que a luz ^1,2,3. Antes do advento dos anticorpos policlonais e monoclonais e sua aplicação em imuno-histoquímica, o TEM desempenhou um papel influente no diagnóstico de pequenos tumores redondos de células azuis.

A partir da década de 90 do século passado, a abordagem imuno-histoquímica substituiu a ferramenta morfológica no diagnóstico⁴. Atualmente, existem milhares de novos anticorpos policlonais e monoclonais direcionados a antígenos do grupo de tumores de pequenas células azuis redondas 4,6,7,8. Na última década^{do altamente} prolífico século 20 e na primeira década do início^{do século} 21, a biologia molecular, incluindo a hibridização in situ fluorescente, de sondas genômicas por meio de sequenciamento de próxima geração, parece ter substituído o papel significativo de aplicação da imuno-histoquímica em vários laboratórios⁴. A Food and Drug Administration (FDA) nos Estados Unidos da América, a Agência Canadense de Inspeção de Alimentos (CFIA) do Canadá, a Agência de Proteção Ambiental (EPA) ou órgãos governamentais semelhantes em outros países nem sempre aprovam protocolos de biologia molecular⁹. Parece que há muitas informações bastante desafiadoras para inserir em um laudo de patologia que podem ser usadas para fins terapêuticos, e a escolha oculada de um sistema de informação laboratorial bem financiado e funcionando é fundamental¹⁰. Nesse ínterim, a imuno-histoquímica revelou inúmeras armadilhas, com tumores epiteliais apresentando marcadores mesenquimais e vice-versa¹¹. A transição epitélio-mesenquimal confundiu algumas fronteiras em grupos patológicos^12,13. Nos últimos anos, tornou-se evidente que a microscopia eletrônica floresceu em vários laboratórios em todo o mundo¹⁴. Em particular, o tempo de resposta das amostras de tecido diminuiu de semanas para apenas 3 dias ou até menos usando vários protocolos que abordam a coloração com anticorpos monoclonais ou policlonais ^4,10.

Além disso, a aplicação de uma câmera eletrônica acoplada ao microscópio eletrônico ajudou a fornecer aos patologistas uma imagem rápida, que é versátil em diferentes sistemas operacionais. Finalmente, alguns anticorpos, mesmo após a recuperação do antígeno, são difíceis de serem revelados em algumas áreas de necrose ou alterações relacionadas à autofagia/isquemia. Ao mesmo tempo, a microscopia eletrônica em boas mãos ainda pode fornecer excelentes resultados e dicas para a correta classificação de tumores patológicos desconhecidos¹⁵.

O grupo de tumores pediátricos de pequenas células azuis redondas inclui vários tumores, principalmente neuroblastoma, tumor de Wilms ou nefroblastoma, rabdomiossarcoma e sarcoma de Ewing. Os dados de biologia molecular relativos ao grupo pediátrico de pequenos tumores redondos de células azuis podem ser esmagadores devido às técnicas aplicadas. Os pequenos glóbulos azuis redondos podem não diferir muito nas colorações de rotina (coloração de hematoxilina e eosina), e alguns tumores podem ter características imunofenotípicas aberrantes. Os avanços na biologia molecular têm sido enormes desde a descoberta do TEM. No grupo de pequenos tumores redondos de células azuis, algumas neoplasias podem ser encontradas com mais frequência do que outras, mas precisam ser consideradas. Embora o carcinoma de células renais papilíferas não seja essencialmente um pequeno tumor redondo de células azuis, mas apresente principalmente papilas, ele pode mostrar algumas áreas de células redondas que podem precisar ser distintas de outros pequenos tumores redondos de células azuis bem conhecidos (por exemplo, tumor de Wilms) usando várias técnicas auxiliares¹⁶. Em última análise, os tumores estromais metanéfricos também podem precisar ser levados ao diagnóstico diferencial¹⁷. O tumor rabdoide é um tumor pediátrico particularmente maligno, distinto do subtipo renal e extra-renal¹⁸.

O neuroblastoma é uma das neoplasias sólidas mais comuns na infância. As células do neuroblastoma são as células malignas desse tumor sólido que surgem insidiosamente de derivados da crista neural primordial. Seu diagnóstico e diagnóstico diferencial podem ser difíceis. Sua biologia natural teve avanços notáveis nas últimas duas décadas. A família forkhead de fatores de transcrição é caracterizada por um domínio "forkhead" distinto (FOXO3 / FKHRL1). Esses fatores de transcrição funcionam como um gatilho para a apoptose (morte celular programada) por meio da expressão de genes necessários para a morte celular. FOXO3 / FKHRL1 é ativado por 5-aza-2-desoxicitidina e induz caspase-8 silenciada, e esse complexo desempenha um papel crucial no neuroblastoma. O FOXO3 nuclear prediz desfechos clínicos adversos e promove a angiogênese tumoral no neuroblastoma ^7,19. Apesar dos avanços da patologia molecular, a classificação de Shimada continua sendo o padrão de prática para qualquer patologista e oncologista pediátrico. É fundamental na diferenciação entre histologia favorável e desfavorável 20,21,22,23.

A justificativa para o desenvolvimento de um protocolo simples para a microscopia eletrônica de tumores suspeitos de neuroblastoma está ligada à viabilidade e solidez do exame ultraestrutural da amostra de tecido. Raramente é alterado por problemas comumente encontrados usando imuno-histoquímica. A justificativa e o protocolo têm sido a base de vários livros-texto e contribuições científicas para a patologia pediátrica e microscopia eletrônica ^4,24,25. Este protocolo abrange a experiência de três décadas do autor e se concentrará em alguns PSRBCT, enfatizando a experiência pessoal e a revisão da literatura.

Todos os procedimentos realizados em estudos envolvendo participantes humanos estavam de acordo com os padrões éticos do comitê de pesquisa institucional e/ou nacional e com a Declaração de Helsinque de 1964 e suas emendas posteriores ou padrões éticos comparáveis. O estudo de microscopia eletrônica faz parte da rotina normal de investigação microscópica das amostras recebidas para fins diagnósticos e não requer aprovação do Comitê de Bioética. Este estudo é retrospectivo e respeita o completo anonimato das amostras.

1. Protocolo TEM para recuperação FFPE (fixada em formalina e embebida em parafina) e amostras de tecido fixadas em glutaraldeído

1. Recupere as últimas lâminas coradas com hematoxilina e eosina e o bloco de tecido FFPE.
2. Com um marcador permanente, selecione a área de interesse na lâmina de tecido e combine-a com a área no bloco de tecido.
3. Corte a área selecionada com uma nova lâmina de barbear do bloco e corte-a com precisão em cubos de 5 mm em papel de filtro.
4. Coloque o papel de filtro com o tecido recuperado em uma placa de Petri rotulada. Aloje a placa de Petri em um forno de 60-70 ° C por 15 min, ou seja, até que a parafina derreta (a cera de parafina consiste em uma mistura de hidrocarbonetos sólidos de cadeia linear variando em ponto de fusão de 48 ° C-66 ° C (120 a 150 ° F)) e seja absorvida pelo papel de filtro.
5. Transfira o tecido recuperado livre de parafina para um frasco de cintilação cheio de 4 mL de tolueno (metilbenzeno) v / v [100% tolueno significa 100 mL de tolueno]. Certifique-se de que as amostras giram continuamente durante o processo de desparafinização (velocidade de rotação: 24 rotações/min).
6. Passar por duas trocas de tolueno, 1 h cada, e uma troca de 4 mL de tolueno 100% 30 min cada, utilizando um dispositivo rotativo angular.
7. Proceda com uma troca em 4 mL de etanol absoluto a 100% (C₂H₅OH) por 1 h e, em seguida, duas trocas de 4 mL de etanol absoluto a 100% por 30 min cada. Em seguida, outra troca de 30 min em 4 mL de etanol a 70%.
8. Proceda a uma troca de 4 mL de tampão de cacodilato de sódio 0,1 M, 30 min. Transfira as amostras em 4 mL de glutaraldeído a 2,5% e mantenha a 4 ° C até o processamento.
9. Use as seguintes etapas em um processador de tecidos automatizado para padronizar o processamento: tampão de cacodilato de sódio 0,1 M por 5 min, tetróxido de ósmio a 2% por 1 h e 50 min, dH₂O por 5 min, etanol a 50% por 15 min, etanol a 70% por 30 min, etanol a 100% por 15 min (três vezes), etanol a 100% por 30 min (três vezes), Etanol 100% por 45 min, acetona por 50 min, resina por 1 h (duas vezes) e resina fresca durante a noite. O volume de todas as soluções é de 15 mL.
10. Incorpore com resina fresca direto do processador de tecidos.
    1. Posicione as cápsulas de polietileno em um suporte com tiras de papel numeradas. Coloque resina fresca nas cápsulas, transfira a amostra para os blocos apropriados e mantenha os blocos durante a noite em um forno a 60 ° C (140 ° F).
11. Manchar secções semifinas (500 nm) com azul de toluidina a 1% na placa de aquecimento, ajuste mínimo de calor durante 30 s, enxaguar em dH₂O e, em seguida, colocar uma lamínula.
12. Aqui, o micrótomo Ultracut (UCM) é usado para seccionar seções semifinas.
    1. Pegue o bloco embutido de resina e instale-o no suporte do bloco do UCM. Em seguida, instale o suporte do bloco no stage do UCM e aperte-o.
    2. Corte o excesso de resina ao redor da amostra usando uma lâmina de barbear revestida de borda única usando as oculares. Corte a face do bloco em forma trapezoidal.
    3. Remova o suporte do bloco do stage e instale-o no braço UCM, apertado. Em seguida, instale o porta-lâminas no UCM stage. Por fim, aperte uma faca de vidro no porta-lâminas.
    4. Usando as oculares e a luz fornecida pelo UCM, deslize a borda da faca de vidro lentamente, o mais próximo possível, da superfície do bloco de resina a ser cortado. Aperte o porta-lâmina no lugar no palco.
    5. Defina a espessura de corte do UCM em 500 nm e apare o bloco de resina até 75% da face completa.
    6. Troque a faca de vidro por uma nova. Adicione água estéril ao reservatório da faca de vidro.
    7. Rotule uma lâmina de microscópio com o número do estojo e coloque quatro gotas separadas de água estéril na lâmina de vidro.
    8. Ainda na configuração de 500 nm, corte quatro seções do bloco. Usando uma pinça fina, transfira 1 seção de cada vez em uma das gotas de água na lâmina de vidro. Cada gota no slide conterá uma seção. Seque a lâmina em uma placa quente na temperatura mais baixa até secar (30 s).
13. Manchar com o método do azul de toluidina. Enxágüe com água e coloque uma lamínula. Examinar as secções de azul de toluidina ao microscópio óptico. Se as estruturas de tecido desejadas forem visíveis, corte seções ultrafinas. Se as estruturas de tecido desejadas não forem visíveis, corte seções mais profundas e core-as usando as mesmas etapas até que as estruturas desejadas sejam expostas e mostradas na lâmina azul de toluidina.
14. Quando a área desejada para microscopia eletrônica for identificada a partir das seções de azul de toluidina, corte as seções ultrafinas nas grades de cobre. Cortar fatias ultrafinas com um ultramicrótomo (as amostras destinadas à visualização no MET devem ser cortadas em fatias muito finas (80 nm)).
    1. Pegue o bloco embutido de resina e instale-o no suporte do bloco do UCM. Em seguida, instale o suporte do bloco no stage do UCM e aperte-o.
    2. Usando as oculares, corte a resina ao redor da área desejada para microscopia eletrônica usando uma lâmina de barbear revestida de uma única borda. Corte a face do bloco em forma de trapézio, não maior que 1 mm quadrado. Se a área desejada para microscopia eletrônica for difícil de ver devido ao brilho da luz, use um pouco de clorofórmio para destacar as estruturas no bloco de resina.
    3. Remova o suporte do bloco do stage e instale-o no braço UCM, apertado. Em seguida, instale o porta-lâminas no UCM stage. Por fim, aperte uma faca diamantada no porta-lâminas.
    4. Usando as oculares e a luz fornecida pelo UCM, deslize a borda da faca de diamante lentamente, o mais próximo possível, da superfície do bloco de resina a ser cortado. Aperte o porta-lâmina no lugar no palco.
    5. Ajuste os diferentes ângulos da faca diamantada usando os parafusos do UCM. Certifique-se de que a borda da faca de diamante esteja alinhada o mais perfeitamente possível com a superfície do bloco a ser cortado. Encha o reservatório da faca de diamante com água estéril.
    6. Defina o UCM com 80 nm de espessura e velocidade de 1 mm/s. Aqui, a função automatizada é usada para seccionamento ultrafino. Defina a janela de corte no UCM (parte superior e inferior da face do bloco).
    7. Pressione o botão Iniciar do UCM para iniciar o seccionamento. As seções flutuarão no reservatório estéril da faca de diamante.
    8. Quando seções suficientes forem cortadas, use vapores de clorofórmio para endireitar as seções. Mergulhe um cotonete em clorofórmio e passe-o acima das seções sem tocá-las.
15. Mergulhe uma grade de cobre em álcool 100% e depois em água estéril usando uma pinça fina. Limpe cada grade antes de ser usada. Escolha as seções em algumas grades.
16. Deixe as grades com seções em papel de filtro rotulado. Coloque este papel de filtro em uma placa de Petri e coloque-o no forno a 60 °C por 30 min para permitir que as seções sequem nas grades.
17. Em seguida, execute a coloração com contraste.
    1. Manchar as grelhas com acetato de uranilo ou qualquer substitutivo alternativo amigo do ambiente durante 1 min. Em seguida, lave-os em água estéril para injeção (40 mergulhos em quatro recipientes de água diferentes para cada enxágue após acetato de uranila e citrato de chumbo). A etapa de citrato de chumbo também é de 1 min.
18. Insira a grade no TEM, permitindo que um feixe de elétrons de alta tensão seja emitido por um cátodo e criado por lentes magnéticas. O feixe que foi parcialmente transmitido através da amostra fina (semitransparente de elétrons) forma a informação MET na tela (veja abaixo).

2. Protocolo TEM para escanear e fotografar os espécimes

1. Depois que as seções nas grades forem coradas, examine-as com o microscópio eletrônico. No microscópio eletrônico, ligue a tensão ACC para uma configuração pré-estabelecida (200-300 kV), que depende do microscópio eletrônico usado.
2. No computador, ligue o software da câmera digital e digite o número do caso. Isso é importante porque as microfotografias são salvas no arquivo de caso correspondente.
3. Carregue a grade no microscópio eletrônico, puxe a amostra da pistola até a metade e gire a chave para AIR para permitir que o vácuo da câmara da pistola de amostras seja preenchido com ar ambiente (ambiente).
4. Quando estiver cheio de ar, retire a amostra da arma. Coloque a amostra da pistola no suporte projetado. Em seguida, abra o suporte da grade na ponta da arma.
5. Coloque a grade no lugar. Feche o suporte da grade e certifique-se de que a grade esteja presa.
6. Coloque a amostra da pistola de volta na câmara da amostra na metade e gire a chave para EVAC para criar um vácuo na câmara da amostra.
7. O indicador de luz verde acenderá quando o vácuo for alcançado na câmara de amostra. Em seguida, empurre a amostra da pistola cuidadosamente para dentro da coluna do microscópio eletrônico e certifique-se de não permitir que ela vá muito rápido. Caso contrário, danificaria o objeto na ponta da amostra da arma.
8. Assim que a grade estiver bem encaixada na coluna do microscópio eletrônico, ligue o filamento para a configuração de saturação intermediária (pré-estabelecida).
9. Ligue a câmera através do botão ON/OFF . No computador, clique em Live Image no software de imagem.
10. No microscópio eletrônico, pressione o botão Baixa ampliação e abra a abertura da objetiva. Isso permite escolher a área de peneiramento desejada. Em seguida, posicione a área desejada da seção no meio da tela do computador, usando os dois controladores em cada lado da coluna do microscópio eletrônico.
11. No microscópio eletrônico, pressione o botão Zoom e feche a abertura da objetiva para obter melhor contraste.
12. Comece a triagem da seção tirando microfotografias com ampliação de 2.500x. Em seguida, ajuste o foco usando o botão wobbler e o botão de brilho no microscópio eletrônico para garantir a qualidade da microfotografia.
13. Clique em Imagem Final no computador para tirar a microfotografia. Se as cores não forem uniformes, execute uma correção de fundo no software da câmera. Além disso, ajuste o contraste na imagem final usando o software antes de salvar a microfotografia.
14. Quando a microfotografia estiver sendo salva, verifique novamente o número do caso e a ampliação para garantir a identificação adequada das microfotografias tiradas.
    NOTA: Em alguns casos, o usuário também pode inserir legendas extras e as iniciais do tecnólogo de microscopia eletrônica também são inseridas.
15. Execute o processo de micrografia em toda a área da seção a ser peneirada. Após ampliação suficiente de 2.500x, as microfotografias são salvas para cobrir a área de interesse, capturar microfotografias de ampliação de 4.000x e 8.000x e salvá-las no computador com a identificação apropriada do número do caso.
16. Faça um close-up na seção para detalhes ultraestruturais específicos se forem fornecidas instruções de triagem muito específicas. Em seguida, salve as medições de detalhes ultraestruturais específicos no computador, considerando ampliações maiores, se necessário.
17. Quando a triagem da amostra estiver concluída, desligue o filamento, a câmera, a alta tensão e o software da câmera em sequência. Em seguida, remova a grade da coluna do microscópio eletrônico, permitindo a entrada de ar na câmara de amostra da pistola.
18. Arquive a grade em uma cápsula de gelatina e armazene a cápsula em uma caixa devidamente rotulada, junto com os blocos de resina da mesma caixa. Coloque a amostra da pistola de volta na câmara da pistola e guarde-a em um ambiente fresco e seco para preservar o material usado.
19. Transfira as microfotografias digitais em plataformas colaborativas comuns (por exemplo, SharePoint) ou servidores internos para permitir que o patologista as visualize.
20. Entrar as unidades de trabalho no Sistema de Informação Laboratorial (LIS).
21. Se forem necessárias microfotografias mais específicas, retire a grade de campo e reutilize-as para triagem adicional ou perguntas específicas.

As características distintas do neuroblastoma são exibidas aqui. Aqui vamos ilustrar as características distintivas do neuroblastoma TEM.

O neuroblastoma é uma das neoplasias sólidas mais comuns na infância. As células do neuroblastoma são as células malignas desse tumor sólido que surgem insidiosamente de derivados da crista neural primordial. Essa histogênese explica algumas características bioquímicas e morfológicas desse tumor azul. No entant...

Nesta revisão narrativa com protocolo associado, destacamos as características ultraestruturais distintas do neuroblastoma. No final, sugerimos que a microscopia eletrônica está longe de ser uma técnica "morta" ou antiga, postulando a descoberta de um novo papel se combinada com tecnologias ômicas de célula única. Essa contribuição gostaria de enfatizar o papel nunca antigo da microscopia eletrônica na patologia pediátrica ^4,27

O primeiro autor recebe royalties das seguintes editoras: Springer (https://link.springer.com/book/10.1007/978-3-662-59169-7; ISBN: 978-3-662-59169-7) e Nova (https://novapublishers.com/shop/science-culture-and-politics-despair-and-hopes-in-the-time-of-a-pandemic/; ISBN: 978-1-53619-816-4). Todos os royalties vão para instituições de caridade pediátricas.

Reconhecemos a experiência e o apoio generoso do Dr. Richard Vriend, ex-funcionário dos Serviços de Saúde de Alberta no Hospital da Universidade de Alberta, e Steven Joy (1972-2019), também ex-funcionário dos Serviços de Saúde de Alberta no Hospital da Universidade de Alberta. Dedicamos este trabalho à memória do Sr. Joy, um tecnólogo sênior especialista em investigações ultraestruturais que faleceu tragicamente e prematuramente há alguns anos. O Sr. Joy foi um pilar para a maioria dos estudos de microscopia eletrônica em Alberta, Canadá. Nossos pensamentos e orações por ele e sua família. Também somos gratos à Sra. Lesley Burnet por sua ajuda e conselhos. A pesquisa do Dr. C. Sergi foi financiada pela generosidade do Hospital Infantil do Leste de Ontário, Ottawa, Ontário, e da Fundação do Hospital Infantil Stollery e apoiadores do Hospital Lois Hole para Mulheres através do Instituto de Pesquisa em Saúde da Mulher e da Criança (WCHRI, Grant ID #: 2096), Fundação de Ciências Naturais da Província de Hubei para a Universidade de Tecnologia de Hubei (Subsídio de 100 Talentos para o Programa de Recrutamento de Especialistas Estrangeiros Financiamento total: PCR digital e diagnóstico baseado em NGS para infecção e oncologia, 2017-2022), Österreichische Krebshilfe Tyrol (Krebsgesellschaft Tirol, Instituto Austríaco de Pesquisa do Câncer do Tirol, 2007 e 2009 - "DMBTI e carcinomas colangiocelulares" e "Hsp70 e HSPBP1 em carcinomas do pâncreas"), Fundo de Pesquisa Austríaco (Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung, FWF, Grant ID L313-B13), Fundação Canadense para a Saúde da Mulher ("Early Fetal Heart-RES0000928"), Sociedade de Pesquisa do Câncer (expressão gênica do fator von Willebrand em células cancerígenas), Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (Ácidos graxos ômega-3 para tratamento de doença hepática associada à insuficiência intestinal: um estudo de pesquisa translacional, 2011-2014, CIHR 232514) e o Departamento Cultural Saudita, Ottawa, Canadá. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.