La microscopie électronique à transmission : un outil de pathologie chirurgicale pour le neuroblastome

Les petites tumeurs rondes à cellules bleues pédiatriques sont une collection intrigante et stimulante de néoplasmes. Par conséquent, la microscopie électronique à transmission (MET) et les connaissances professionnelles des tumeurs pédiatriques peuvent être extrêmement précieuses en pathologie chirurgicale. Ici, nous présentons un protocole pour effectuer une TEM pour diagnostiquer le neuroblastome, l’une des tumeurs solides les plus courantes chez l’enfant.

Les petites tumeurs rondes à cellules bleues pédiatriques (PSRBCT) sont un ensemble intrigant et stimulant de néoplasmes. La microscopie optique des petites tumeurs rondes à cellules bleues identifie les petites cellules rondes. Ils abritent un noyau généralement hyperchromatique et un cytoplasme basophile relativement maigre. Les petites tumeurs rondes à cellules bleues pédiatriques comprennent plusieurs entités. Habituellement, ils incorporent la tumeur de Wilms, le neuroblastome, le rhabdomyosarcome, le sarcome d’Ewing, le rétinoblastome, le lymphome et l’ostéosarcome à petites cellules, entre autres. Même en utilisant l’immunohistochimie, le diagnostic différentiel de ces néoplasmes peut être controversé en microscopie optique. Une légère coloration ou un arrière-plan ambigu peuvent dissuader les pathologistes de prendre la bonne décision diagnostique. De plus, la biologie moléculaire peut fournir une quantité écrasante de données difficiles à distinguer, et certaines translocations peuvent être observées dans plus d’une catégorie. Ainsi, la microscopie électronique à transmission (MET) peut être extrêmement précieuse. Ici, nous mettons l’accent sur le protocole moderne pour les données TEM du neuroblastome. Les cellules tumorales avec des enchevêtrements de processus cytoplasmiques contenant des granules neurosécrétoires peuvent diagnostiquer le neuroblastome.

Le travail d’un pathologiste peut être assez difficile à la fois dans les domaines du diagnostic clinique et de la recherche. L’évolution de la microscopie optique aux 18e^et 19e^{siècles a} été remarquable. La puissance d’un microscope électronique repose principalement sur la longueur d’onde des électrons, qui est plus courte que la lumière ^1,2,3. Avant l’avènement des anticorps polyclonaux et monoclonaux et leur application en immunohistochimie, la TEM jouait un rôle influent dans le diagnostic des petites tumeurs rondes à cellules bleues.

À partir des années 90 du siècle dernier, l’approche immunohistochimique a substitué l’outil morphologique dans le diagnostic⁴. Actuellement, il existe des milliers de nouveaux anticorps polyclonaux et monoclonaux dirigés vers les antigènes du groupe de petites tumeurs rondes à cellules bleues 4,6,7,8. Au cours de la dernière décennie du très prolifique^{XXe siècle et} de la première décennie du début du XXIe^siècle, la biologie moléculaire, y compris l’hybridation in situ en fluorescence, à partir de sondes génomiques jusqu’au séquençage de nouvelle génération, semble avoir supplanté le rôle d’application significatif de l’immunohistochimie dans plusieurs^{laboratoires4}. La Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis d’Amérique, l’Agence canadienne d’inspection des aliments (ACIA) du Canada, l’Agence de protection de l’environnement (EPA) ou des organismes gouvernementaux similaires dans d’autres pays n’approuvent pas toujours les protocoles de biologie moléculaire⁹. Il semble qu’il y ait beaucoup d’informations assez difficiles à insérer dans un rapport de pathologie qui peuvent être utilisées à des fins thérapeutiques, et le choix d’un système d’information de laboratoire bien financé et fonctionnel est essentiel¹⁰. Entre-temps, l’immunohistochimie a révélé de nombreux écueils, les tumeurs épithéliales présentant des marqueurs mésenchymateux et vice versa¹¹. La transition épithéliale-mésenchymateuse a brouillé certaines frontières dans les groupes de pathologie^12,13. Au cours des dernières années, il est devenu évident que la microscopie électronique s’est développée dans plusieurs laboratoires à travers le monde¹⁴. En particulier, le délai d’exécution des échantillons de tissus est passé de plusieurs semaines à seulement 3 jours, voire moins, en utilisant plusieurs protocoles d’approche de la coloration avec des anticorps monoclonaux ou polyclonaux ^4,10.

De plus, l’utilisation d’une caméra électronique couplée au microscope électronique a permis de fournir aux pathologistes une image rapide, polyvalente dans différents systèmes d’exploitation. Enfin, certains anticorps, même après récupération de l’antigène, sont difficiles à révéler dans certaines zones de nécrose ou de modifications liées à l’autophagie/ischémie. Dans le même temps, la microscopie électronique entre de bonnes mains peut encore fournir d’excellents résultats et des indices pour la classification correcte des tumeurs pathologiques inconnues¹⁵.

Le groupe pédiatrique des petites tumeurs rondes à cellules bleues comprend plusieurs tumeurs, principalement le neuroblastome, la tumeur de Wilms ou le néphroblastome, le rhabdomyosarcome et le sarcome d’Ewing. Les données de biologie moléculaire relatives au groupe pédiatrique de petites tumeurs rondes à cellules bleues peuvent être écrasantes en raison des techniques appliquées. Les petites cellules bleues rondes peuvent ne pas différer beaucoup lors des colorations de routine (coloration à l’hématoxyline et à l’éosine), et certaines tumeurs peuvent présenter des caractéristiques immunophénotypiques aberrantes. Les progrès de la biologie moléculaire ont été énormes depuis la découverte de la TEM. Dans le groupe des petites tumeurs rondes à cellules bleues, certains néoplasmes peuvent être plus fréquemment rencontrés que d’autres, mais ils doivent être pris en compte. Bien que le carcinome papillaire du rein ne soit pas essentiellement une petite tumeur à cellules bleues rondes, mais comporte principalement des papilles, il peut présenter certaines zones de cellules rondes qui peuvent avoir besoin d’être distinctes d’autres tumeurs à petits cellules rondes bien connues (par exemple, la tumeur de Wilms) en utilisant plusieurs techniques auxiliaires¹⁶. En fin de compte, les tumeurs stromales métanéphriques peuvent également devoir être prises en compte dans le diagnostic différentiel¹⁷. La tumeur rhabdoïde est une tumeur pédiatrique particulièrement maligne distincte dans le sous-type¹⁸ rénal et extra-rénal.

Le neuroblastome est l’une des tumeurs malignes solides les plus courantes dans la petite enfance et l’enfance. Les cellules du neuroblastome sont les cellules malignes de cette tumeur solide qui résultent insidieusement des dérivés de la crête neurale primordiale. Son diagnostic et son diagnostic différentiel peuvent être difficiles. Sa biologie naturelle a connu des progrès remarquables au cours des deux dernières décennies. La famille des facteurs de transcription à tête fourchue est caractérisée par un domaine distinct (FOXO3/FKHRL1). Ces facteurs de transcription fonctionnent comme un déclencheur de l’apoptose (mort cellulaire programmée) par l’expression de gènes nécessaires à la mort cellulaire. FOXO3/FKHRL1 est activé par la 5-aza-2-désoxycytidine et induit une caspase-8 silencieuse, et ce complexe joue un rôle crucial dans le neuroblastome. FOXO3 nucléaire prédit les résultats cliniques indésirables et favorise l’angiogenèse tumorale dans le neuroblastome ^7,19. Malgré les progrès de la pathologie moléculaire, la classification de Shimada reste la norme de pratique pour tout pathologiste et oncologue pédiatrique. Il est essentiel de différencier l’histologie favorable et défavorable 20,21,22,23.

La raison d’être de l’élaboration d’un protocole simple pour la microscopie électronique des tumeurs suspectes de neuroblastome est liée à la faisabilité et à la solidité de l’examen ultrastructurel de l’échantillon de tissu. Elle est rarement altérée par les problèmes couramment rencontrés avec l’immunohistochimie. La raison d’être et le protocole ont servi de base à plusieurs manuels et contributions scientifiques à la pathologie pédiatrique et à la microscopie électronique ^4,24,25. Ce protocole couvre l’expérience de trois décennies de l’auteur et se concentrera sur quelques PSRBCT, en mettant l’accent sur l’expérience personnelle et la revue de la littérature.

Toutes les procédures effectuées dans les études impliquant des participants humains étaient conformes aux normes éthiques du comité de recherche institutionnel et/ou national et à la Déclaration d’Helsinki de 1964 et à ses amendements ultérieurs ou à des normes éthiques comparables. L’étude de microscopie électronique fait partie de la routine normale d’investigation microscopique des échantillons reçus à des fins de diagnostic et ne nécessite pas l’approbation du Comité de bioéthique. Cette étude est rétrospective et respecte l’anonymat complet des échantillons.

1. Protocole TEM pour le prélèvement de FFPE (fixé au formol et enrobé de paraffine) et les échantillons de tissus fixés au glutaraldéhyde

1. Récupérer les dernières lames colorées à l’hématoxyline et à l’éosine ainsi que le bloc tissulaire FFPE.
2. À l’aide d’un marqueur permanent, sélectionnez la zone d’intérêt sur la lame de tissu et associez-la à la zone du bloc de tissus.
3. Découpez la zone sélectionnée avec une nouvelle lame de rasoir dans le bloc et coupez-la avec précision en cubes de 5 mm sur du papier filtre.
4. Placez le papier filtre avec le tissu récupéré dans une boîte de Pétri étiquetée. Placez la boîte de Pétri dans un four à 60-70 °C pendant 15 min, c’est-à-dire jusqu’à ce que la paraffine fonde (la cire de paraffine est constituée d’un mélange d’hydrocarbures solides à chaîne droite dont le point de fusion est de 48 °C à 66 °C (120 à 150 °F)) et soit absorbée par le papier filtre.
5. Transvaser le tissu extrait exempt de paraffine dans un flacon à scintillation rempli de 4 mL de toluène (méthylbenzène) à 100 % v/v [100 % de toluène signifie 100 mL de toluène]. Assurez-vous que les échantillons tournent en continu tout au long du processus de déparaffinisation (vitesse de rotation : 24 tours/min).
6. Effectuez deux changements de toluène, 1 h chacun, et un changement de 4 mL de toluène à 100 % 30 min chacun, à l’aide d’un dispositif rotatif incliné.
7. Effectuez un changement de 4 ml d’éthanol absolu à 100 % (C₂H₅OH) pendant 1 h, puis deux changements de 4 ml d’éthanol absolu à 100 % pendant 30 min chacun. Puis, un autre changement de 30 min dans 4 mL d’éthanol à 70 %.
8. Procéder à un changement de 4 mL de tampon de cacodylate de sodium 0,1 M, 30 min. Transvaser les échantillons dans 4 mL de glutaraldéhyde à 2,5 % et les conserver à 4 °C jusqu’au traitement.
9. Utilisez les étapes suivantes dans un processeur de tissus automatisé pour normaliser le traitement : tampon de cacodylate de sodium 0,1 M pendant 5 min, tétroxyde d’osmium à 2 % pendant 1 h et 50 min, dH₂O pendant 5 min, éthanol à 50 % pendant 15 min, éthanol à 70 % pendant 30 min, éthanol à 100 % pendant 15 min (trois fois), éthanol à 100 % pendant 30 min (trois fois), 100 % éthanol pendant 45 min, acétone pendant 50 min, résine pendant 1 h (deux fois) et résine fraîche pendant la nuit. Le volume de toutes les solutions est de 15 ml.
10. Incorporez avec de la résine fraîche directement sortie du processeur de tissus.
    1. Placez les capsules de polyéthylène dans un support avec des bandes de papier numérotées. Déposez de la résine fraîche dans les capsules, transférez l’échantillon dans les blocs appropriés et conservez les blocs toute la nuit dans un four à 60 °C (140 °F).
11. Teindre des sections semi-minces (500 nm) avec 1 % de bleu de toluidine sur la plaque chauffante, réglage de chaleur minimum pendant 30 s, rincer à dH₂O, puis placer une lamelle.
12. Ici, le microtome Ultracut (UCM) est utilisé pour le tronçonnage de sections semi-minces.
    1. Prenez un bloc incrusté de résine et installez-le dans le support de bloc de l’UCM. Ensuite, installez le support de bloc sur la platine de l’UCM et serrez-le.
    2. Coupez l’excès de résine autour de l’échantillon à l’aide d’une lame de rasoir enduite d’un seul tranchant à l’aide des oculaires. Coupez la face du bloc en forme de trapèze.
    3. Retirez le support de bloc de la scène et installez-le dans le bras UCM, bien serré. Ensuite, installez le porte-lame sur la platine UCM. Enfin, serrez un couteau en verre sur le porte-lame.
    4. À l’aide des oculaires et de la lumière fournie par l’UCM, faites glisser le bord du couteau en verre lentement, le plus près possible, de la surface du bloc de résine à couper. Serrez le porte-lame en place sur la platine.
    5. Réglez l’épaisseur de coupe de l’UCM à 500 nm et coupez le bloc de résine jusqu’à ce qu’il soit complet à 75 %.
    6. Remplacez le couteau en verre par un nouveau. Ajoutez de l’eau stérile dans le réservoir du couteau en verre.
    7. Étiquetez une lame de microscope avec le numéro du boîtier et placez quatre gouttes d’eau stérile distinctes sur la lame de verre.
    8. Toujours à 500 nm, coupez quatre sections du bloc. À l’aide d’une pince fine, transférez 1 section à la fois dans l’une des gouttes d’eau sur la lame de verre. Chaque goutte de la diapositive contiendra une section. Séchez la lame sur une plaque chauffante à la température la plus basse jusqu’à ce qu’elle soit sèche (30 s).
13. Colorer avec la méthode au bleu de toluidine. Rincez à l’eau et placez une lamelle. Examinez les coupes de bleu de toluidine au microscope optique. Si les structures tissulaires souhaitées sont visibles, coupez des sections ultra-minces. Si les structures tissulaires souhaitées ne sont pas visibles, coupez des sections plus profondes et colorez-les en suivant les mêmes étapes jusqu’à ce que les structures souhaitées soient exposées et montrées sur la lame de bleu toluidine.
14. Lorsque la zone souhaitée pour la microscopie électronique est identifiée à partir des sections de bleu de toluidine, coupez les sections ultra-minces sur les grilles de cuivre. Couper des tranches ultraminces à l’aide d’un ultramicrotome (les échantillons destinés à être visualisés dans le MET doivent être coupés en tranches très fines (80 nm)).
    1. Prenez un bloc incrusté de résine et installez-le dans le support de bloc de l’UCM. Ensuite, installez le support de bloc sur la platine de l’UCM et serrez-le.
    2. À l’aide des oculaires, coupez la résine autour de la zone souhaitée pour la microscopie électronique à l’aide d’une lame de rasoir enduite à un seul tranchant. Coupez la face du bloc en forme de trapèze, ne dépassant pas 1 mm de côté. Si la zone souhaitée pour la microscopie électronique est difficile à voir en raison de l’éblouissement de la lumière, utilisez une noisette de chloroforme pour mettre en évidence les structures du bloc de résine.
    3. Retirez le support de bloc de la scène et installez-le dans le bras UCM, bien serré. Ensuite, installez le porte-lame sur la platine UCM. Enfin, serrez un couteau diamanté sur le porte-lame.
    4. À l’aide des oculaires et de la lumière fournie par l’UCM, faites glisser le tranchant du couteau diamanté lentement, le plus près possible, de la surface du bloc de résine à couper. Serrez le porte-lame en place sur la platine.
    5. Ajustez les différents angles du couteau diamanté à l’aide des vis de l’UCM. Veillez à ce que le tranchant du couteau diamanté soit aligné aussi parfaitement que possible avec la surface du bloc à couper. Remplissez le réservoir du couteau diamanté avec de l’eau stérile.
    6. Réglez l’UCM à une épaisseur de 80 nm et une vitesse de 1 mm/s. Ici, la fonction automatisée est utilisée pour le sectionnement ultra-fin. Réglez la fenêtre de coupe sur l’UCM (haut et bas de la face du bloc).
    7. Appuyez sur le bouton Start de l’UCM pour commencer le sectionnement. Les sections flotteront sur le réservoir stérile du couteau diamanté.
    8. Lorsque suffisamment de sections sont coupées, utilisez des vapeurs de chloroforme pour redresser les sections. Trempez un coton-tige dans du chloroforme et passez-le au-dessus des sections sans les toucher.
15. Trempez une grille en cuivre dans de l’alcool à 100 % puis de l’eau stérile à l’aide d’une pince fine. Nettoyez chaque grille avant de l’utiliser. Choisissez les sections sur quelques grilles.
16. Laissez les grilles avec des sections sur du papier filtre étiqueté. Placez ce papier filtre dans une boîte de Pétri et mettez-le au four à 60 °C pendant 30 min pour permettre aux sections de sécher sur les grilles.
17. Ensuite, effectuez la coloration de contraste.
    1. Teindre les grilles dans de l’acétate d’uranyle ou toute alternative respectueuse de l’environnement pendant 1 min. Ensuite, rincez-les à l’eau stérile pour injection (40 trempages dans quatre récipients d’eau différents pour chaque rinçage après l’acétate d’uranyle et le citrate de plomb). L’étape du citrate de plomb est également de 1 min.
18. Insérez la grille dans le MET, permettant à un faisceau d’électrons à haute tension d’être émis par une cathode et créé par des lentilles magnétiques. Le faisceau qui a été partiellement transmis à travers l’échantillon mince (électron-semi-transparent) forme l’information TEM sur l’écran (voir ci-dessous).

2. Protocole TEM pour la numérisation et la photographie des échantillons

1. Une fois les sections des grilles colorées, criblez-les au microscope électronique. Au microscope électronique, réglez la tension ACC sur un réglage préétabli (200-300 kV), qui dépend du microscope électronique utilisé.
2. Sur l’ordinateur, allumez le logiciel de l’appareil photo numérique et entrez le numéro du dossier. Ceci est important car les microphotographies sont enregistrées dans le dossier correspondant.
3. Chargez la grille dans le microscope électronique, tirez l’échantillon du pistolet à mi-chemin et basculez l’interrupteur sur AIR pour permettre au vide de la chambre du pistolet à échantillon de se remplir d’air ambiant (pièce).
4. Une fois qu’il est plein d’air, retirez l’échantillon de pistolet. Placez l’échantillon de pistolet sur le support conçu. Ensuite, ouvrez le support de grille à la pointe du pistolet.
5. Placez la grille en place. Fermez le support de grille et assurez-vous que la grille est bien fixée.
6. Remettez l’échantillon du pistolet dans la chambre d’échantillon à mi-chemin et basculez l’interrupteur sur EVAC pour créer un vide dans la chambre d’échantillon.
7. Le voyant vert s’allume lorsque le vide est atteint dans la chambre d’échantillonnage. Ensuite, poussez soigneusement l’échantillon du pistolet dans la colonne du microscope électronique et assurez-vous de ne pas le laisser aller trop vite. Sinon, cela endommagerait l’objet à l’extrémité de l’échantillon de canon.
8. Une fois que la grille est bien en place dans la colonne du microscope électronique, allumez le filament jusqu’au réglage de saturation intermédiaire (préétabli).
9. Allumez l’appareil photo à l’aide de l’interrupteur ON/OFF . Sur l’ordinateur, cliquez sur Live Image dans le logiciel d’imagerie.
10. Sur le microscope électronique, appuyez sur le bouton Faible grossissement et ouvrez l’ouverture de l’objectif. Cela permet de choisir la zone de criblage souhaitée. Ensuite, positionnez la zone souhaitée de la section au milieu de l’écran de l’ordinateur, à l’aide des deux contrôleurs situés de chaque côté de la colonne du microscope électronique.
11. Sur le microscope électronique, appuyez sur le bouton Zoom et fermez l’ouverture de l’objectif pour obtenir un meilleur contraste.
12. Commencez la projection de la section en prenant des microphotographies à un grossissement de 2 500x. Ensuite, ajustez la mise au point à l’aide du bouton wobbler et du bouton de luminosité du microscope électronique pour assurer la qualité de la microphotographie.
13. Cliquez sur l’image finale sur l’ordinateur pour prendre la microphotographie. Si les couleurs ne sont pas uniformes, effectuez une correction d’arrière-plan sur le logiciel de l’appareil photo. Ajustez également le contraste sur l’image finale à l’aide du logiciel avant d’enregistrer la microphotographie.
14. Lorsque la microphotographie est enregistrée, vérifiez le numéro de cas et le grossissement pour vous assurer que les microphotographies prises sont correctement identifiées.
    REMARQUE : Dans certains cas, l’utilisateur peut également entrer des sous-titres supplémentaires, et les initiales du technologue en microscopie électronique sont également saisies.
15. Effectuez le processus de micrographie sur toute la zone de la section à cribler. Après un grossissement suffisant de 2 500x, les microphotographies sont enregistrées pour couvrir la zone d’intérêt, capturer des microphotographies à grossissement de 4 000x et 8 000x et les enregistrer sur l’ordinateur avec l’identification du numéro de cas approprié.
16. Faites un gros plan sur la section pour des détails ultrastructurels spécifiques si des instructions de dépistage très spécifiques sont données. Ensuite, enregistrez les mesures de détails ultrastructurels spécifiques dans l’ordinateur en tenant compte de grossissements plus élevés si nécessaire.
17. Une fois le criblage de l’échantillon terminé, éteignez le filament, la caméra, la haute tension et le logiciel de la caméra dans l’ordre. Ensuite, retirez la grille de la colonne du microscope électronique, laissant entrer l’air dans la chambre d’échantillonnage du pistolet.
18. Limez la grille dans une capsule de gélatine et stockez la capsule dans une boîte correctement étiquetée, avec les blocs de résine du même boîtier. Remettez l’échantillon du pistolet dans la chambre du pistolet et stockez-le dans un environnement frais et sec pour préserver le matériau utilisé.
19. Transférez les microphotographies numériques sur des plateformes collaboratives courantes (p. ex., SharePoint) ou des serveurs internes pour permettre au pathologiste de les visualiser.
20. Entrez les unités de travail dans le système d’information de laboratoire (SIL).
21. Si des microphotographies plus spécifiques sont nécessaires, extrayez la grille de terrain et réutilisez-les pour un dépistage supplémentaire ou des questions spécifiques.

Les caractéristiques TEM distinctives du neuroblastome sont présentées ici. Ici, nous illustrerons les caractéristiques TEM distinctives du neuroblastome.

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Le premier auteur reçoit des droits d’auteur des éditeurs suivants : Springer (https://link.springer.com/book/10.1007/978-3-662-59169-7 ; ISBN : 978-3-662-59169-7) et Nova (https://novapublishers.com/shop/science-culture-and-politics-despair-and-hopes-in-the-time-of-a-pandemic/ ; ISBN : 978-1-53619-816-4). Toutes les redevances sont versées à des organismes de bienfaisance pédiatriques.

Nous avons souligné l’expertise et le généreux soutien du Dr Richard Vriend, ancien employé des Services de santé de l’Alberta à l’Hôpital de l’Université de l’Alberta, et de Steven Joy (1972-2019), également ancien employé des Services de santé de l’Alberta à l’Hôpital de l’Université de l’Alberta. Nous dédions ce travail à la mémoire de M. Joy, un technologue principal expert en études ultrastructurales qui est décédé tragiquement et prématurément il y a quelques années. M. Joy a été l’un des piliers de la plupart des études de microscopie électronique en Alberta, au Canada. Nos pensées et nos prières pour lui et sa famille. Nous sommes également redevables à Mme Lesley Burnet pour son aide et ses conseils. Les recherches du Dr C. Sergi ont été financées grâce à la générosité du Centre hospitalier pour enfants de l’est de l’Ontario, à Ottawa, en Ontario, de la Fondation de l’Hôpital pour enfants Stollery et des donateurs de l’Hôpital pour femmes Lois Hole par l’intermédiaire de l’Institut de recherche sur la santé des femmes et des enfants (WCHRI, Grant ID # : 2096), de la Fondation des sciences naturelles de la province du Hubei pour l’Université de technologie du Hubei (Subvention de 100 talents pour le programme de recrutement d’experts étrangers. Diagnostic numérique basé sur la PCR et le NGS pour les infections et l’oncologie, 2017-2022), Österreichische Krebshilfe Tyrol (Krebsgesellschaft Tirol, Institut de recherche sur le cancer du Tyrol autrichien, 2007 et 2009 - « DMBTI et carcinomes cholangiocellulaires » et « Hsp70 et HSPBP1 dans les carcinomes du pancréas »), Fonds autrichien de recherche (Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung, FWF, Grant ID L313-B13), Fondation canadienne pour la santé des femmes (« Early Fetal Heart-RES0000928 »), Société de recherche sur le cancer (expression du gène du facteur von Willebrand dans les cellules cancéreuses), Instituts de recherche en santé du Canada (Acides gras oméga-3 pour le traitement des maladies hépatiques associées à l’insuffisance intestinale : une étude de recherche translationnelle, 2011-2014, IRSC 232514), et le Bureau culturel saoudien, Ottawa, Canada. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.