透射电子显微镜：神经母细胞瘤的外科病理学工具

小儿小圆蓝细胞瘤是一个有趣且具有挑战性的肿瘤集合。因此，透射电子显微镜 （TEM） 和儿科肿瘤的专业知识在外科病理学中极具价值。在这里，我们提出了一种进行 TEM 以诊断神经母细胞瘤的方案，神经母细胞瘤是儿童期最常见的实体瘤之一。

小儿小圆蓝细胞瘤 （PSRBCT） 是一个有趣且具有挑战性的肿瘤集合。小圆形蓝色细胞肿瘤的光学显微镜检查可识别小圆形细胞。它们通常具有深染性细胞核和相对较少的嗜碱性细胞质。小儿小圆蓝细胞瘤包括多种实体。通常，它们包括肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、视网膜母细胞瘤、淋巴瘤和小细胞骨肉瘤等。即使使用免疫组化，这些肿瘤的鉴别诊断在光学显微镜下也可能存在争议。微弱的染色或模糊的背景会阻止病理学家做出正确的诊断决定。此外，分子生物学可能提供大量难以区分它们的数据，并且一些易位可能出现在不止一个类别中。因此，透射电子显微镜 （TEM） 可能非常有价值。在这里，我们强调神经母细胞瘤 TEM 数据的现代方案。肿瘤细胞与含有神经分泌颗粒的细胞质过程缠结可以诊断神经母细胞瘤。

病理学家的工作在临床诊断和研究领域都可能非常具有挑战性。光学显微镜在 18^世纪和 19^世纪的发展是显着的。电子显微镜的功率主要取决于电子的波长，它比光短 ^1,2,3。在多克隆和单克隆抗体出现及其在免疫组化中的应用之前，TEM 在诊断小圆蓝细胞肿瘤方面发挥了重要作用。

从上世纪 90 年代开始，免疫组织化学方法已经取代了诊断学中的形态学工具⁴。目前，有数千种针对小圆蓝细胞肿瘤组 4,6,7,8 抗原的新型多克隆和单克隆抗体。在高产的 20^世纪的最后十年和 21^世纪初的第一个十年中，分子生物学，包括从基因组探针到下一代测序的荧光原位杂交，似乎已经取代了免疫组织化学在几个实验室中的重要应用作用⁴.美国食品药品监督管理局 （FDA）、加拿大食品检验局 （CFIA）、环境保护署 （EPA） 或其他国家/地区的类似政府机构并不总是批准分子生物学方案⁹。似乎有很多信息很难插入到可用于治疗目的的病理报告中，并且选择资金充足且运行良好的实验室信息系统至关重要¹⁰。与此同时，免疫组化揭示了许多缺陷，上皮肿瘤显示间充质标志物，反之亦然¹¹。上皮-间充质转化混淆了病理组^12,13 中的一些边界。在过去的几年里，很明显，电子显微镜在全球多个实验室中蓬勃发展¹⁴。特别是，使用几种使用单克隆或多克隆抗体进行染色的方案，组织标本的周转时间已从数周缩短到仅 3 天甚至更短 ^4,10。

此外，将电子相机与电子显微镜耦合有助于为病理学家提供快速图像，该图像在不同的作系统中具有通用性。最后，一些抗体，即使在抗原修复后，也很难在某些坏死或自噬/缺血相关变化的区域显示。同时，安全的电子显微镜仍然可以为未知病理肿瘤的正确分类提供出色的结果和提示¹⁵。

小儿小圆蓝细胞瘤组包括几种肿瘤，主要为神经母细胞瘤、肾母细胞瘤或肾母细胞瘤、横纹肌肉瘤和尤文肉瘤。由于应用了技术，相对于儿科小圆蓝细胞肿瘤组的分子生物学数据可能是压倒性的。小的圆形蓝色细胞在常规染色（苏木精和伊红染色）上可能没有太大差异，一些肿瘤可能具有异常的免疫表型特征。自从 TEM 被发现以来，分子生物学取得了巨大的进步。在小圆蓝细胞肿瘤组中，一些肿瘤可能比其他肿瘤更频繁地出现，但需要考虑它们。虽然状肾细胞癌本质上不是小的圆形蓝细胞肿瘤，但主要以为特征，但它可能会显示一些圆形细胞区域，可能需要使用几种辅助技术与其他众所周知的小圆形蓝细胞肿瘤（例如肾母细胞瘤）区分开来¹⁶。最终，后肾基质瘤也可能需要纳入鉴别诊断¹⁷。横纹肌样瘤是一种特别恶性的儿科肿瘤，在肾和肾外亚型¹⁸ 中有所不同。

神经母细胞瘤是婴儿和儿童期最常见的实体恶性肿瘤之一。神经母细胞瘤细胞是这种实体瘤的恶性细胞，它从原始神经嵴的衍生物中隐匿地产生。其诊断和鉴别诊断可能很困难。在过去的几十年里，它的自然生物学取得了显着的进步。转录因子的叉头家族具有独特的“叉头”结构域 （FOXO3/FKHRL1）。这些转录因子通过表达细胞死亡所需的基因来触发细胞凋亡（程序性细胞死亡）。FOXO3/FKHRL1 被 5-氮杂-2-脱氧胞苷激活并诱导沉默的 caspase-8，该复合物在神经母细胞瘤中起着至关重要的作用。核 FOXO3 可预测神经母细胞瘤的不良临床结果并促进肿瘤血管生成 ^7,19。尽管分子病理学取得了进步，但 Shimada 分类仍然是任何病理学家和儿科肿瘤学家的实践标准。它对于区分有利和不利的组织学至关重要 20,21,22,23。

为疑似神经母细胞瘤的肿瘤进行电子显微镜检查制定简单方案的基本原理与组织标本超微结构检查的可行性和稳定性有关。它很少因使用免疫组化通常遇到的问题而改变。基本原理和方案已成为几本教科书的基础，以及对儿科病理学和电子显微镜的科学贡献 ^4,24,25。该协议跨越了作者三十年的经验，并将侧重于一些 PSRBCT，强调个人经历和文献综述。

在涉及人类参与者的研究中执行的所有程序均符合机构和/或国家研究委员会的道德标准以及 1964 年赫尔辛基宣言及其后来的修正案或类似的道德标准。电子显微镜研究是对收到的用于诊断目的的样本进行显微镜检查的正常常规程序的一部分，不需要生物伦理委员会的批准。这项研究是回顾性的，并尊重样本的完全匿名性。

1. 用于 FFPE（福尔马林固定和石蜡包埋）修复和戊二醛固定组织标本的 TEM 方案

1. 检索最后的苏木精和伊红染色的载玻片和 FFPE 组织块。
2. 使用永久性标记物，选择组织载玻片上的感兴趣区域，并将其与组织块上的区域匹配。
3. 用新的剃须刀片从块上切出所选区域，并在滤纸上将其准确切成 5 毫米的立方体。
4. 将滤纸和回收的组织放入贴有标签的培养皿中。将培养皿放入 60-70 °C 的烘箱中 15 分钟，即直到石蜡熔化（石蜡由熔点为 48 °C-66 °C（120 至 150 °F）的固体直链碳氢化合物的混合物组成）并被滤纸吸收。
5. 将回收的无石蜡组织转移到装有 4 mL 100% 甲苯（甲苯）v/v [100% 甲苯是指 100 mL 甲苯] 的闪烁瓶中。确保样品在脱蜡过程中连续旋转（转速：24 转/分钟）。
6. 使用倾斜的旋转装置，进行两次甲苯更换，每次 1 小时，每次更换 4 mL 100% 甲苯 30 分钟。
7. 在 4 mL 100% 无水乙醇 （C₂H₅OH） 中更换一次 1 小时，然后更换两次 4 mL 100% 无水乙醇，每次 30 分钟。然后，在 4 mL 70% 乙醇中再次更换 30 分钟。
8. 继续更换 4 mL 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液一次，30 分钟。将样品转移到 4 mL 的 2.5% 戊二醛中，并保持在 4 °C 直至处理。
9. 在自动组织处理器中使用以下步骤标准化处理：0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液 5 分钟，2% 四氧化锇 1 小时和 50 分钟，dH₂O 5 分钟，50% 乙醇 15 分钟，70% 乙醇 30 分钟，100% 乙醇 15 分钟（3 次），100% 乙醇 30 分钟（3 次）， 100% 乙醇 45 分钟，丙酮 50 分钟，树脂 1 小时（两次），新鲜树脂过夜。所有溶液的体积为 15 mL。
10. 直接从组织脱水机中取出新鲜树脂包埋。
    1. 将聚乙烯胶囊放在带有编号纸条的支架中。将新鲜树脂滴入胶囊中，将样品转移到适当的模块中，并将模块在 60 °C （140 °F） 的烘箱中放置过夜。
11. 在热板上用 1% 甲苯胺蓝染色半薄 （500 nm） 切片，最低加热设置为 30 秒，在 dH₂O 中冲洗，然后放置盖玻片。
12. 在这里，Ultracut 切片机 （UCM） 用于半薄切片。
    1. 取出树脂嵌入块并将其安装在 UCM 的块支架中。然后，将块支架安装在 UCM 的载物台上并拧紧。
    2. 使用目镜使用单边涂层剃须刀片切割样品周围多余的树脂。将块的表面切成梯形。
    3. 从载物台上取下块架，并将其拧紧安装在 UCM 臂中。接下来，将刀架安装在 UCM 载物台上。最后，拧紧刀架上的玻璃刀。
    4. 使用目镜和 UCM 提供的光线，将玻璃刀的边缘缓慢滑动，尽可能靠近树脂块的表面进行切割。将刀片架拧紧到位tage.
    5. 将 UCM 的切割厚度设置为 500 nm，并修剪树脂块，直到 75% 全面。
    6. 将玻璃刀换成新的。将无菌水加入玻璃刀的储液槽中。
    7. 用箱子编号标记显微镜载玻片，并在载玻片上滴入四滴单独的无菌水。
    8. 仍然在 500 nm 设置下，从块上切下四个部分。使用细镊子，一次将 1 个切片转移到载玻片上的一滴水中。幻灯片上的每个拖放都将包含一个部分。在热板上以最低的热量设置干燥载玻片直至干燥（30 秒）。
13. 用甲苯胺蓝法染色。用水冲洗并放置盖玻片。在光学显微镜下检查甲苯胺蓝切片。如果可以看到所需的组织结构，请切割超薄切片。如果看不到所需的组织结构，请切下较深的切片并使用相同的步骤对其进行染色，直到所需的结构暴露并显示在甲苯胺蓝载玻片上。
14. 当从甲苯胺蓝色切片中确定所需的电子显微镜区域时，在铜网格上切割超薄部分。使用超薄切片机切割超薄切片（要在 TEM 中观察的样品必须切割成非常薄的切片 （80 nm））。
    1. 取出树脂嵌入块并将其安装在 UCM 的块支架中。然后，将块支架安装在 UCM 的载物台上并拧紧。
    2. 使用目镜，使用单边涂层剃须刀片在所需区域周围切割树脂以进行电子显微镜检查。将块的表面切成不大于 1 毫米见方的梯形。如果由于光线的眩光而难以看到电子显微镜所需的区域，请使用少量氯仿来突出树脂嵌段中的结构。
    3. 从载物台上取下块架，并将其拧紧安装在 UCM 臂中。接下来，将刀架安装在 UCM 载物台上。最后，拧紧刀架上的金刚石刀。
    4. 使用目镜和 UCM 提供的光线，将金刚石刀的边缘缓慢滑动，尽可能靠近树脂块的表面进行切割。将刀片架拧紧到位tage.
    5. 使用 UCM 的螺钉调整金刚石刀的不同角度。确保金刚石刀的边缘与要切割的块的表面尽可能完全对齐。用无菌水填充金刚石刀的储液槽。
    6. 将 UCM 设置为 80 nm 厚度和 1 mm/s 速度。在这里，自动化功能用于超薄切片。在 UCM 上设置切割窗口（块面的顶部和底部）。
    7. 按 UCM 的 开始 按钮开始切片。切片将漂浮在金刚石刀的无菌储液器上。
    8. 切下足够的切片后，使用氯仿烟雾拉直切片。将棉签浸入氯仿中，然后将其穿过切片上方，不要触摸它们。
15. 将铜网格浸入 100% 酒精中，然后使用细镊子将无菌水浸入水中。使用前清洁每个网格。选择几个网格上的部分。
16. 将带有部分的网格保留在带标签的滤纸上。将该滤纸放入培养皿中，并将其放入 60 °C 的烤箱中 30 分钟，以使切片在网格上干燥。
17. 然后，进行造影剂染色。
    1. 用乙酸铀酰或任何环保替代替代物对网格染色 1 分钟。然后，用无菌注射用水冲洗它们（乙酸铀酰和柠檬酸铅后，每次冲洗在四个不同的水容器中浸泡 40 次）。柠檬酸铅步长也是 1 分钟。
18. 将栅极插入 TEM 中，允许阴极发射高压电子束并由磁透镜产生。部分穿过薄（电子半透明）样品的光束在屏幕上形成 TEM 信息（见下文）。

2. 用于扫描和拍摄标本的 TEM 方案

1. 网格上的切片染色后，用电子显微镜筛选它们。在电子显微镜上，将 ACC 电压打开到预先设定的设置 （200-300 kV），这取决于所使用的电子显微镜。
2. 在计算机上，打开数码相机软件并输入案例编号。这一点很重要，因为缩微照片保存在相应的案例文件中。
3. 将网格加载到电子显微镜中，将枪式样品拉出一半，然后将开关拨到 AIR 上，让样品枪室中的真空充满环境（室内）空气。
4. 充满空气后，拉出喷枪样本。将喷枪样品放在设计的支架上。然后，翻开喷枪尖端的网格支架。
5. 将网格放置在适当的位置。关闭网格支架并确保网格已固定。
6. 中途将枪式样品放回样品室，然后将开关拨回 EVAC 以在样品室中产生真空。
7. 当样品室达到真空时，绿灯指示灯将亮起。然后，小心地将枪样品推入电子显微镜柱中，确保不要让它走得太快。否则，它会损坏枪样尖端的物体。
8. 一旦网格在电子显微镜柱中就位，将灯丝打开到中间（预先建立的）饱和度设置。
9. 通过 ON/OFF 开关开启相机。在计算机上，单击成像软件中的 Live Image 。
10. 在电子显微镜上，按下 Low Magnification（低放大倍率 ）按钮并打开物镜孔径。这允许选择所需的屏蔽区域。接下来，使用电子显微镜柱两侧的两个控制器，将切片的所需区域定位到计算机屏幕的中间。
11. 在电子显微镜上，按下 Zoom 按钮并关闭物镜孔径以获得更好的对比度。
12. 通过以 2,500 倍放大倍率拍摄显微照片开始筛选切片。然后，使用电子显微镜上的摇摆按钮和亮度按钮调整焦距，以确保显微照片的质量。
13. 单击计算机上的 Final Image 拍摄缩微照片。如果颜色不均匀，请在相机软件上执行背景校正。此外，在保存缩微照片之前，请使用软件调整最终图像的对比度。
14. 保存显微照片时，请仔细检查案件编号和放大倍率，以确保正确识别所拍摄的显微照片。
    注意：在某些情况下，用户还可以输入额外的标题，并且还会输入电子显微镜技术人员的姓名首字母。
15. 对要筛选的切片的整个区域执行显微照片处理。在足够的 2,500 倍放大倍率后，保存显微照片以覆盖感兴趣区域，捕获 4,000 倍和 8,000 倍放大倍率的显微照片，并将它们保存在带有适当案例编号标识的计算机上。
16. 如果给出了非常具体的筛选说明，请在该部分进行特写，了解特定的超微结构细节。然后，将特定超微结构细节的测量值保存在计算机中，如果需要，考虑更高的放大倍率。
17. 标本筛选完成后，依次关闭灯丝、相机、高压和相机软件。接下来，从电子显微镜柱上取下网格，让空气进入枪式样品室。
18. 将网格锉入明胶胶囊中，并将胶囊与同一案例的树脂块一起存放在正确标记的盒子中。将喷枪样品放回喷枪室中，并将其存放在阴凉干燥的环境中，以保存所用材料。
19. 将数字显微照片传输到常见的协作平台（例如 SharePoint）或内部服务器上，以允许病理学家查看它们。
20. 在实验室信息系统 （LIS） 中输入工作单元。
21. 如果需要更具体的显微照片，请拉出田间网格并将其重新用于其他筛选或特定问题。

此处显示了神经母细胞瘤的独特 TEM 特征。在这里，我们将说明神经母细胞瘤的独特 TEM 特征。

神经母细胞瘤是婴儿和儿童期最常见的实体恶性肿瘤之一。神经母细胞瘤细胞是这种实体瘤的恶性细胞，它从原始神经嵴的衍生物中隐匿地产生。这种组织发生机制解释了这种蓝色肿瘤的一些生化和形态学特征。然而，神经母细胞瘤的确定性细胞和组织病理...

在这篇带有相关协议的叙述性综述中，我们强调了神经母细胞瘤独特的超微结构特征。最后，我们认为电子显微镜远非“死”或古老的技术，假设如果与单细胞组学技术相结合，将发现新作用。这一贡献旨在强调电子显微镜在儿科病理学中从未古老的作用 ^4,27。下面详细介绍了关键步骤、技术的修改和故障排除以及限制。

第一作者从以下出版商那里获得版税：施普林格 （https://link.springer.com/book/10.1007/978-3-662-59169-7;ISBN：978-3-662-59169-7）和 Nova （https://novapublishers.com/shop/science-culture-and-politics-despair-and-hopes-in-the-time-of-a-pandemic/;ISBN：978-1-53619-816-4）。所有版税都捐给儿科慈善机构。

我们感谢 Richard Vriend 博士（前阿尔伯塔省卫生服务部员工）和 Steven Joy （1972-2019） 的专业知识和慷慨支持，Steven Joy （1972-2019） 也曾是阿尔伯塔大学医院的阿尔伯塔省卫生服务员工。我们将这项工作献给 Joy 先生，他是一位超微结构研究方面的高级技术专家，几年前不幸过早地去世了。Joy 先生是加拿大阿尔伯塔省大多数电子显微镜研究的支柱。我们为他和他的家人表示哀悼和祈祷。我们还要感谢 Lesley Burnet 女士的帮助和建议。C. Sergi 博士的研究得到了安大略省渥太华东安大略省儿童医院、斯托勒里儿童医院基金会以及 Lois Hole 妇女医院支持者的慷慨资助，通过妇女和儿童健康研究所（WCHRI，资助 ID #：2096），湖北省自然科学基金为湖北工业大学提供（外国专家招聘计划的 100 名人才资助 总资金： 基于数字 PCR 和基于 NGS 的感染和肿瘤学诊断，2017-2022 年）、Österreichische Krebshilfe Tyrol（蒂罗尔州癌症研究所，2007 年和 2009 年 - “DMBTI 和胆管细胞癌”和“胰腺癌中的 Hsp70 和 HSPBP1”）、奥地利研究基金（Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung，FWF，拨款 ID L313-B13）、加拿大妇女健康基金会（“早期胎儿心脏RES0000928”）， 癌症研究协会（癌细胞中的血管性血友病因子基因表达）、加拿大卫生研究院（用于治疗肠衰竭相关肝病的 omega-3 脂肪酸：一项转化研究，2011-2014 年，CIHR 232514）和沙特文化局，加拿大渥太华。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。