배아 구조 프로토콜은 서로 다른 Cucurbita 종 간의 종간 교배에서 파생 된 미성숙 배아의 재생에 필수적입니다. 그것은 Cucurbita moschata와 Cucurbita pepo 사이의 십자가에 가장 일반적으로 사용됩니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 단순성입니다.
이 프로토콜은 항생제가 포함 된 MS 배지 만 사용합니다. 따라서 모든 실험실에서 쉽게 복제할 수 있습니다. 이 기술을 수정하여 종간 또는 제네릭 간 혼성화에 대한 다양한 장벽을 조사하는 것이 가능합니다.
모든 단계에서 세부 사항에주의를 기울이면 성공적인 결과에 도움이됩니다. 질소, 인 및 칼륨의 킬로그램 당 1.38g을 포함하는 완전한 질소, 인 및 칼륨 비료가 보충 된 화분 배지를 사용하여 25 x 50cm의 50 셀 시작 플랫을 채워 Cucurbita 식물을 심는 것으로 시작하십시오. 다음으로 씨앗을 길이와 같은 깊이로 뿌리고 화분 매체로 덮으십시오.
고인 물을 만들지 않고 평지에 물을 주고 하루에 한 번 물을 주어 매체를 촉촉하게 유지하십시오. 두 번째 진정한 잎 단계가 끝나면 묘목을 직경 30cm의 화분에 이식하고 화분 당 완전한 비료 3 큰술을 보충합니다. 7 일마다 1 그램의 물에 20, 20, 20 질소, 인 및 칼륨을 함유 한 액체 비료 500 밀리리터로 각 냄비를 비옥하게합니다.
자연 채광 체제 하에서 섭씨 22도에서 28도 사이의 온도에서 온실의 식물을 유지하십시오. 유전자형을 구부리려면 온실에서지지 격자를 제공하십시오. 식물이 파종 후 6-8 주에 개화를 시작하자마자 제어 된 교잡 또는 수분을 수행하십시오.
꽃잎에 노란색 색조가있는 개봉하지 않은 꽃을 확인하고 Cucurbita pepo 및 Cucurbita moschata 품종의 수꽃과 암꽃을 식별하십시오. 우발적 인 곤충 수분을 방지하려면 마스킹 테이프를 사용하여 상단의 닫힌 꽃을 부드럽게 테이프로 붙입니다. 다음날 아침, 오전 10:00 이전에 암꽃의 테이프 상단 부분을 부드럽게 제거하여 수분을 수행하십시오.
수꽃에서 꽃잎을 분리하고 암꽃 오명에 꽃밥을 부드럽게 문질러 꽃가루를 옮깁니다. 수분 후 즉시 마스킹 테이프로 수분 된 암화를 닫고 태그를 사용하여 수분 날짜를 기록하고 십자가에 사용 된 부계 및 외부모를 나타냅니다. 확장 된 난소로 표시된 성공적인 십자가는 일주일 이내에 작은 열매를 형성합니다.
수분 45-55 일 후에 과일을 수확하십시오. 세포탁심 주식을 준비하십시오. 멸균 된 0.22 미크론 주사기 필터를 통해 여과하십시오.
그리고 섭씨 영하 20도에서 보관하기 전에 밀리리터 당 250 밀리그램의 0.5 밀리리터 분취량을 만드십시오. 마찬가지로 암피실린 스톡을 준비하십시오. 멸균 된 0.22 미크론 주사기 필터를 통해 여과하고 밀리리터 암피실린 당 100 밀리그램의 1 밀리리터 분취량을 준비한 후 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.
Murashige 및 Skoog 또는 MS 배지를 1 리터 병에 500ml의 증류수에 2.45g의 배지를 용해시켜 준비합니다. MS 배지에 1.5g의 젤란 검을 넣고 섭씨 121도에서 20분 동안 오토클레이브합니다. 병을 섭씨 50 도의 수조에 넣어 매체를 식히십시오.
층류 캐비닛 내부의 항생제 재고를 해동하십시오. 배지 병을 층류 후드로 옮기고 적절한 혼합으로 0.6 밀리리터의 세포탁심 스톡과 0.25 밀리리터의 암피실린 스톡을 배지에 추가합니다. 약 7 밀리리터의 배지를 60 x 15 밀리미터의 멸균 페트리 접시에 붓습니다.
배지가 페트리 접시에서 약 15-20분 동안 굳도록 합니다. 밀봉 랩으로 페트리 접시를 닫고 나중에 사용할 때까지 실온의 보관 상자에 넣으십시오. 호박 열매는 주 포도 나무를 잘라 수확하고 0.3 % 클로록시 레놀과 같은 액체 세제를 사용하여 실험실 싱크대에서 표면을 씻어 과일을 소독합니다.
과일을 라미네이트 기류 캐비닛으로 옮기기 전에 충분한 수돗물로 과일을 헹구고 깨끗한 종이 타월로 말리십시오. 70 % 에탄올을 분사하여 캐비닛 내부의 과일 표면을 소독하십시오. 멸균 칼로 과일을 이등분하고 씨앗을 추출하십시오.
멸균 집게 또는 멸균 장갑이 달린 손을 사용하여 종자 코트를 무균 적으로 열고 미성숙 배아를 노출시킨 후 항생제가 보충 된 MS 배지가 들어있는 페트리 접시에 넣습니다. 포장 필름을 사용하여 페트리 플레이트를 밀봉하고 섭씨 25도, 16시간 광기 및 70% 상대 습도의 성장 챔버에 넣습니다. 오염의 경우, 오염되지 않은 배아를 즉시 동일한 배지를 갖는 새로운 판으로 계대 배양하십시오.
10-14 일 후에 뿌리가 발달하고 15-21 일 후에 자엽이 발달하면 페트리 접시에서 묘목을 꺼내고 수돗물을 사용하여 뿌리 주변에 존재하는 배지를 부드럽게 씻어냅니다. 청소 한 묘목을 14 x 9 x 4 센티미터의 플라스틱 용기에 넣고 젖은 종이 타월로 뿌리를 덮으십시오. 용기를 덮고 필요한 경우 종이 타월을 다시 적 십니다.
플라스틱 용기를 섭씨 25도에서 28도까지 유지하고 종이 타월의 촉촉한 상태를 유지하면서 묘목에 적응할 수 있도록 16 시간의 사진 기간을 유지하십시오. 7-10 일 동안 순응 한 후 3-4 센티미터 길이의 묘목을 비료로 수정 된 상업용 화분 믹스가 들어있는 50 개의 셀 플랫으로 옮기고 온실로 옮깁니다. 썩는 것을 방지하기 위해 과수를 피하고 필요에 따라 세포 당 약 10-20 밀리리터의 물을 추가하십시오.
두 번째에서 세 번째 진정한 잎 단계에서 묘목을 비료로 수정 된 화분 배지로 채워진 직경 25cm 화분에 이식하고 식물이 개화하기 시작하면 제어 된 교잡을 수행합니다. 자연 채광 체제 하에서 섭씨 22도에서 28도까지 온실의 식물을 유지하십시오. 그리고 과일과 종자 특성에 대해 식물을 평가하십시오.
4 개의 쿠 쿠르 비타 페포와 11 개의 쿠 쿠르 비타 모샤타가 종간 교잡화를 위해 선택되었습니다. 시도된 24개의 종간 교차 조합 중 과일 세트에서 92% 이상의 성공을 나타내는 22개의 교차에 대해 과일 세트를 얻었습니다. 유전자형 O와 M, 유전자형 E와 J를 포함하는 Cucurbita moschata와 Cucurbita pepo 사이의 교배는 성숙한 열매를 맺지 못했습니다.
반면 쿠쿠르비타 모샤타와 쿠쿠르비타 페포 사이의 교배는 유전자형 F와 J를 포함하며 6개의 과일을 생산했습니다. 다른 교차 조합에 대해 수분 된 꽃의 수는 1에서 11까지 다양했습니다. 그리고 수분 성공률은 0%에서 100% 사이였습니다. 모든 교차 조합에서 생산된 44개의 과일 중 쿠쿠르비타 모샤타와 쿠쿠르비타 페포 사이의 교배에서 단 하나의 과일만 유전자형 C와 J가 구조될 수 있는 미성숙 배아를 생성했습니다.
이러한 잘 발달되지 않은 배아의 발달을 위해 배아 구조 배지를 사용하여 배양하여 배아 구조 성공률이 80%였습니다. 가장 중요한 두 가지 절차는 Cucurbita moschata와 Cucurbita pepo라는 두 종 사이의 호환 가능한 교배와 성공적인 배아 재생을 식별하는 것입니다. 배아 구조 기술은 간단하고 쉽게 복제 할 수 있기 때문에 전 세계의 스쿼시 육종가는이 기술을 사용하여 서로 다른 Cucurbita 종 간의 종간 교배에서 파생 된 미성숙 배아를 구출 할 수 있습니다.
