El protocolo de rescate embrionario es obligatorio para la regeneración de embriones inmaduros derivados de cruces interespecíficos entre diferentes especies de Cucurbita. Se usa más comúnmente para cruces entre Cucurbita moschata y Cucurbita pepo. La principal ventaja de esta técnica es su simplicidad.
El protocolo utiliza solo medios de EM con antibióticos. Por lo tanto, puede ser fácilmente replicado por cualquier laboratorio. Sería posible modificar esta técnica para investigar diferentes barreras a la hibridación interespecífica o intergenérica.
Prestar atención a los detalles durante cada paso será útil para un resultado exitoso. Comience con la siembra de las plantas de Cucurbita llenando 50 celdas planas de 25 por 50 centímetros utilizando un medio para macetas complementado con fertilizante completo de nitrógeno, fósforo y potasio, que contiene 1.38 gramos por kilogramo de nitrógeno, fósforo y potasio cada uno. A continuación, siembre las semillas a una profundidad igual a su longitud y cúbralas con el medio para macetas.
Riegue los pisos sin crear agua estancada y mantenga los medios húmedos regándolos una vez al día. Al final de la segunda etapa de hoja verdadera, transplante las plántulas en macetas de 30 centímetros de diámetro complementadas con tres cucharadas de fertilizante completo por maceta. Después de cada siete días, fertilice cada maceta con 500 mililitros de fertilizante líquido que contenga 20, 20, 20 nitrógeno, fósforo y potasio en un gramo agregado a un galón de agua.
Mantener las plantas en el invernadero a temperaturas entre 22 y 28 grados centígrados bajo el régimen de luz natural. Para los genotipos de enredadera, proporcione un enrejado de soporte en el invernadero. Realice la hibridación o polinización controlada tan pronto como las plantas comiencen a florecer a las seis u ocho semanas de la siembra.
Verifique las flores sin abrir que tienen un tono amarillo en los pétalos e identifique las flores masculinas y femeninas de los cultivares Cucurbita pepo y Cucurbita moschata. Para evitar la polinización accidental de insectos, pegue suavemente la flor cerrada en la parte superior con cinta adhesiva. A la mañana siguiente, realice la polinización antes de las 10:00 AM retirando suavemente la parte superior con cinta adhesiva de la flor masculina y femenina.
Separar los pétalos de la flor masculina y transferir el polen frotando suavemente la antera sobre el estigma de la flor femenina. Después de la polinización, cierre inmediatamente la flor femenina polinizada con cinta adhesiva y use una etiqueta para registrar la fecha de polinización e indicar los padres paternos y maternos utilizados en la cruz. Una cruz exitosa indicada por un ovario expandido formará una pequeña fruta dentro de una semana.
Coseche la fruta después de 45 a 55 días de polinización. Preparar un caldo de cefotaxima. Filtrarlo a través de un filtro de jeringa estéril de 0,22 micras.
Y haga alícuotas de 0.5 mililitros de 250 miligramos por mililitro de cefotaxima antes de almacenarlas a menos 20 grados centígrados. Del mismo modo, prepare el caldo de ampicilina. Filtre a través de un filtro de jeringa estéril de 0,22 micras y prepare alícuotas de un mililitro de 100 miligramos por mililitro de ampicilina antes de almacenarlas a menos 20 grados centígrados.
Prepare Murashige y Skoog, o medio MS disolviendo 2,45 gramos del medio en 500 mililitros de agua destilada en una botella de un litro. Agregue 1,5 gramos de goma gellan al medio MS y autoclave a 121 grados centígrados durante 20 minutos. Enfríe el medio colocando la botella en un baño de agua a 50 grados centígrados.
Descongele las existencias de antibióticos dentro del gabinete de flujo laminar. Transfiera la botella mediana a la campana de flujo laminar y agregue 0.6 mililitros de caldo de cefotaxima y 0.25 mililitros de caldo de ampicilina al medio con la mezcla adecuada. Vierta aproximadamente siete mililitros del medio en una placa de Petri estéril de 60 por 15 milímetros.
Deje que el medio se solidifique en las placas de Petri durante aproximadamente 15 a 20 minutos. Cierre las placas de Petri con una envoltura de sellado y colóquelas en una caja de almacenamiento a temperatura ambiente hasta que se vuelvan a usar. Coseche la fruta de calabaza cortándola de la vid principal y desinfecte la fruta lavando su superficie en el fregadero del laboratorio con un detergente líquido como 0.3% de cloroxilenol.
Enjuague la fruta con abundante agua del grifo y séquela con toallas de papel limpias antes de transferir la fruta al gabinete de flujo de aire laminado. Esterilice la superficie de la fruta dentro del gabinete rociando etanol al 70%. Divide la fruta con un cuchillo estéril y extrae las semillas.
Use fórceps estériles o manos con guantes estériles para abrir asépticamente la capa de semilla y exponer los embriones inmaduros antes de colocarlos en una placa de Petri que contenga MS Medium suplementado con antibióticos. Selle las placas de Petri con una película de envoltura y colóquelas en una cámara de crecimiento con una temperatura de 25 grados centígrados, un período fotográfico de 16 horas y una humedad relativa del 70%. En caso de contaminación, subcultive inmediatamente los embriones no contaminados en una nueva placa que tenga el mismo medio.
Una vez que las raíces se desarrollan después de 10 a 14 días, y los cotiledones se desarrollan después de 15 a 21 días, retire las plántulas de las placas de Petri y lave suavemente los medios presentes alrededor de las raíces con agua del grifo. Coloque las plántulas limpias en un recipiente de plástico de 14 por 9 por 4 centímetros y cubra las raíces con toallas de papel húmedas. Cubra el recipiente y vuelva a humedecer las toallas de papel cuando sea necesario.
Mantenga los recipientes de plástico a 25 a 28 grados centígrados, y en un período fotográfico de 16 horas para aclimatar las plántulas mientras mantiene la condición húmeda de las toallas de papel. Después de 7 a 10 días de aclimatación, transfiera las plántulas de tres a cuatro centímetros de largo a 50 pisos de celdas que contengan una mezcla comercial para macetas modificada con fertilizante y muévalas al invernadero. Evite el riego excesivo para evitar que se pudra y agregue aproximadamente de 10 a 20 mililitros de agua por celda según sea necesario.
En la segunda a la tercera etapa de hoja verdadera, transplante las plántulas en macetas de 25 centímetros de diámetro llenas de medio para macetas modificado con fertilizante y realice una hibridación controlada cuando las plantas comiencen a florecer. Mantenga las plantas en el invernadero a 22 a 28 grados centígrados bajo el régimen de luz natural. Y evalúe las características de las plantas para las frutas y semillas.
Se eligieron cuatro Cucurbita pepo y 11 Cucurbita moschata para hibridación interespecífica. De las 24 combinaciones cruzadas interespecíficas intentadas, se obtuvo un cuajado de frutos para 22 cruces que representan más del 92% de éxito en el cuajado. Los cruces entre Cucurbita moschata y Cucurbita pepo que involucran genotipos O y M, y genotipos E y J, no produjeron frutos maduros.
Mientras que el cruce entre Cucurbita moschata y Cucurbita pepo que involucra los genotipos F y J, produjo seis frutos. El número de flores polinizadas para diferentes combinaciones cruzadas varió de 1 a 11. Y la tasa de éxito de la polinización varió de 0% a 100%De 44 frutas producidas a partir de todas las combinaciones cruzadas, solo una fruta de un cruce entre Cucurbita moschata y Cucurbita pepo, los genotipos C y J produjeron embriones inmaduros que pudieron ser rescatados.
Para el desarrollo de estos embriones poco desarrollados, se cultivaron utilizando los medios de rescate de embriones, lo que resultó en una tasa de éxito del 80% para el rescate de embriones. Los dos procedimientos más importantes son la identificación de cruces compatibles entre dos especies, Cucurbita moschata y Cucurbita pepo, y la regeneración exitosa del embrión. Dado que la técnica de rescate de embriones es simple y fácilmente replicable, los criadores de calabaza de todo el mundo pueden usar esta técnica para rescatar embriones inmaduros derivados de cruces interespecíficos entre diferentes especies de Cucurbita.
