당사의 시투 프로토콜은 최소한의 배경 염색으로 유전자 발현 패턴을 시각화하는 간단한 방법을 제공하기 때문에 중요합니다. 이 기술을 사용하면 복잡하고 긴 프로토콜을 비교적 쉽게 수행할 수 있습니다. Benchtop은 제공된 제안 및 체크리스트를 설정하여 이 프로토콜을 올바르게 수행하고 재현하기가 더욱 쉬워졌습니다.
여기에 표시된 기술은 Astyanax 멕시코인에 만연하지만 프로토콜을 조금씩 조정하는 비교적 크기의 개인의 다른 시스템에 적응 할 수 있습니다. 첫째, 각 유전자에 대한 바이알과 파이펫을 지정하기 위해 컬러 실험실 테이프를 사용합니다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 배아를 정렬합니다.
일반적으로 바이알 당 12 배아, 한 번 정렬 되지 않습니다. 다음으로 흔들리는 수조를 섭씨 70도까지 설정합니다. 정렬된 배아의 바이알에 메탄올을 조심스럽게 꺼내 신선한 100% 메탄올 500 마이크로리터로 대체하십시오.
플랫폼 셰이커에서 약 1분 동안 배아를 잠깐 씻으시다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플랫폼 셰이커에 Tween 20을 가진 1x PBS의 증가 된 농도에서 배아를 재수화하십시오. 먼저 메쉬 바닥이 있는 작은 개스킷을 섭씨 70도까지 예열된 회전수 욕조에 놓습니다.
혼성화 버퍼 마이너스 및 혼성화 버퍼의 알리쿼트와 개스킷에 넣습니다. 모든 조직이 용액으로 완전히 덮여 있는지 확인하는 배아 의 바이알에 준비된 PK 솔루션을 부드럽게 추가합니다. 바이알을 플랫폼 셰이커로 옮기고 단백질Ae K 작업 용액에서 약 12분 동안 소화하게 하십시오.
그 후 PK 용액을 부드럽게 뽑아 내고 PBT로 바이알을 잠깐 범람하여 나머지 PK를 희석시합니다. PBT 솔루션을 500마이크로리터의 신선한 PBT로 교체하고 5분 동안 플랫폼 셰이커에 용액이 헹구도록 합니다. 그런 다음 PBT 솔루션을 해동 된 4 % PFA의 500 마이크로 리터로 대체하십시오. 배아가 실온에서 플랫폼 셰이커에 20분 동안 배아를 배양하게 하십시오.
사전 혼성화를 시작하려면, 배아 함유 바이알에 미리 따뜻해지는 혼성화 완충액 마이너스 용액의 500마이크로리터를 추가한다. 조심스럽게 5 분 동안 흔들리지 않고 70섭씨에 수조에 개스킷에 바이알을 배치합니다. 다음으로 혼성화 버퍼 마이너스 솔루션을 빼고 500 마이크로리터의 미리 웜된 혼성화 버퍼 플러스 솔루션으로 바이알을 범람시합니다.
바이알을 수조의 개스킷에 다시 넣고 4시간 또는 하룻밤 동안 흔들어 서배양합니다. 혼성화를 시작하려면 하이브리드화 버퍼를 바이알에서 빼내고 500마이크로리터의 신선한 미리 따뜻힌 혼성화 버퍼 플러스로 바꿉니다. 각 유리병에 RNA 프로브의 마이크로리터 2개를 조심스럽게 추가하고 부드럽게 소용돌이어 프로브의 분포를 보장합니다.
40 RPM에서 흔들면서 하룻밤 사이에 70도의 수조에서 배양하십시오. 시작하려면, 마이크로 원심 분리구를 텍스트 프로토콜에 설명한 대로 관심 RNA 프로브의 유전자와 플러스 혼성화 버퍼로 라벨을 붙인 마이크로 원심 분리관을 준비한다. 두 개의 15 밀리 리터 원콘 튜브를 설정하고 차단 시약의 0.2 그램과 MABT의 10 밀리리터를 추가합니다.
시약이 용액에 완전히 용해 될 때까지 두 튜브를 누두 믹서에 놓습니다. 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 혼성화 버퍼 플러스 및 프로브 용액을 빼내고 멸균 라벨이 부착된 미세 센심분리기 튜브에 넣습니다. 이 튜브를 냉동실에 보관하여 영하 20도의 냉동고에 보관하여 향후 사용시 사용합니다.
조심스럽게 디플루언스를 뺀 희석제의 따뜻한 식염수 나트륨 및 혼성화 버퍼의 500 마이크로리터를 추가합니다. 흔들리는 수조에서 각각 10분 동안 순차적인 솔루션을 인큐베이션한 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플랫폼 셰이커의 실온에서 배양합니다. 마지막 인큐베이션 후 각 바이알에서 100% PBT를 MABT의 500 마이크로리터로 교체하십시오.
이 과정을 각각 5분 동안 두 번 반복합니다. 먼저 각 유리병에서 MABT를 제거하고 15밀리리터 원뿔형 튜브 중 하나에서 미리 혼합된 차단 용액으로 범람하십시오. 양유리를 양수 믹서에 4시간 동안 실온에서 놓습니다.
준비된 차단 용액의 두 번째 튜브에 항체 조각의 마이크로리터 2개를 추가하고 잠시 소용돌이를 냅니다. 그런 다음 각 유리병을 블로킹 용액으로 거의 완전히 채우고 섭씨 4도의 냉장고에 하룻밤 동안 누두믹서에 놓습니다. 시작하려면 MABT에서 10 % NGS의 주식 바이알을 준비하십시오.
각 유리병의 차단 솔루션을 이 NGS 솔루션의 500 마이크로리터로 교체합니다. 플랫폼 셰이커의 실온에서 25분 동안 배양합니다. 그 후 NGS 혼합물을 100%MABT의 500 마이크로리터로 교체하십시오.
실온에서 플랫폼 셰이커를 30분 동안 배양합니다. 이 헹구는 것을 하루 종일 11 번, 30 분마다 반복하십시오. 그런 다음 각 유리병을 100 % MABT로 채우고 섭씨 4도의 냉장고에 하룻밤 동안 누두믹서에 놓습니다.
먼저 각 유리병의 MABT를 AP 버퍼 1밀리리터로 교체하고 5분간 세척합니다. 이 세척을 두 번 반복하여 MABT를 완전히 제거하십시오. 그런 다음 AP 버퍼를 BCIP 3.5 마이크로리터와 MBT의 4.5 마이크로리터를 포함하는 신선한 AP 버퍼 1밀리리터로 교체합니다.
반응이 완료될 때까지 매시간 BCIP 및 MBT를 포함하는 AP 버퍼의 신선한 혼합물로 교체하여 반응을 면밀히 모니터링하고 원하는 수준의 염색이 이루어질 때까지 15분마다 확인하십시오. 프로토콜에 설명된 바와 같이 AP 버퍼에서 1X PBT의 농도가 증가함에 따라 배아를 헹구어 착색 반응을 중단한다. 원하는 최소 배경 염색에 도달할 때까지 영양가 믹서에 100% PBT의 약 5밀리리터에서 배아를 헹구는다.
헹구는 것이 완료되면 플랫폼 셰이커에 멸균 PBS 500 마이크로리터로 배아를 세척하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표본을 후지합니다. 배아를 헹구고 100% 멸균 PBS의 4밀리리터에 배치하고 필요한 경우 섭씨 4도에서 장기 보관하십시오. 이 연구에서 배아 Astyanax 표본은 고품질 유전자 발현 분석을 위해 표지됩니다.
이 과정은 파촌 동굴물고기와 표면 물고기 배아 모두에서 성공적으로 구현되었습니다. Sox9 발현에 표지된 Cavefish 배아는 개발 된 분기 아치와 가슴 지느러미에서 명확한 라벨을 보여줍니다. 노른자 낭이나 측면의 개발 중인 솜트에는 얼룩이 거의 없습니다.
유사하게, Tfap2a 발현은 배아의 등쪽 측면 영역을 따라 조기 이주 신경 문장 세포로서 개발 헤드의 부분에서 분명하다. 동굴 배아인 Phf20a를 위해 제시된 세 번째 유전자는 뼈 조직을 야기할 운명인 체세포 중구및 후방 머리의 부분에서 보입니다. CXCR에 표지된 표면 물고기 배아는 머리와 측면의 고립된 부위뿐만 아니라 노른자 낭을 덮치는 몇몇 개별 세포에서 양성 라벨을 표시합니다.
유전자 Adcyap1a는 뇌하수체 세포를 포함하는 중추 신경계의 영역에서 발현된다. 배아의 등쪽 양상에 있는 세포의 쌍쌍 양측 클러스터에 있는 높게 특정한 발현, 뿐만 아니라 중간선 발현의 더 큰 지구에 주의하십시오. 동굴 배아를 위해 검토된 마지막 유전자인 Sox10은 등쪽 배아의 왼쪽과 오른쪽에 있는 신경 문장의 초기 마커로서 분명합니다.
시투에서 완료 한 후, 우리는 일반적으로 가벼운 현미경 을 사용하여 결과를 이미지. 염색의 저하를 피하기 위해 완료 후 2 주 이내에이 작업을 수행하는 것이 가장 좋습니다.
