O protocolo de resgate embrionário é obrigatório para a regeneração de embriões imaturos derivados de cruzamentos interespecíficos entre diferentes espécies de Cucurbita. É mais comumente usado para cruzamentos entre Cucurbita moschata e Cucurbita pepo. A principal vantagem desta técnica é a sua simplicidade.
O protocolo usa apenas meios de EM com antibióticos. Assim, ele pode ser facilmente replicado por qualquer laboratório. Seria possível modificar essa técnica para investigar diferentes barreiras à hibridização interespecífica ou intergenérica.
Prestar atenção aos detalhes durante cada etapa será útil para um resultado bem-sucedido. Comece com o plantio das plantas de Cucurbita enchendo 50 planos iniciais de células de 25 por 50 centímetros usando meio de envasamento suplementado com nitrogênio completo, fósforo e fertilizante de potássio, contendo 1,38 gramas por quilograma de nitrogênio, fósforo e potássio cada. Em seguida, semeie as sementes a uma profundidade igual ao seu comprimento e cubra-as com o meio de envasamento.
Regue as planícies sem criar água parada e mantenha a mídia úmida regando-as uma vez por dia. No final do segundo estágio de folha verdadeira, transplante as mudas em vasos de 30 centímetros de diâmetro suplementados com três colheres de sopa de fertilizante completo por vaso. Após cada sete dias, fertilize cada vaso com 500 mililitros de fertilizante líquido contendo 20, 20, 20 nitrogênio, fósforo e potássio em um grama adicionado a um galão de água.
Mantenha as plantas na estufa a temperaturas entre 22 a 28 graus Celsius sob o regime de luz natural. Para genótipos de vinha, forneça uma treliça de suporte na estufa. Realizar a hibridação ou polinização controlada assim que as plantas começarem a florescer em seis a oito semanas após a semeadura.
Verifique as flores fechadas com uma tonalidade amarela nas pétalas e identifique as flores masculinas e as flores femininas das cultivares Cucurbita pepo e Cucurbita moschata. Para evitar a polinização acidental de insetos, cole suavemente a flor fechada no topo usando fita adesiva. Na manhã seguinte, realize a polinização antes das 10:00 da manhã, removendo suavemente a porção superior colada da flor masculina e feminina.
Separar as pétalas da flor masculina e transferir os pólenes esfregando suavemente a antera no estigma da flor feminina. Após a polinização, feche imediatamente a flor feminina polinizada com fita adesiva e use uma etiqueta para registrar a data da polinização e indicar os pais paternos e maternos usados na cruz. Uma cruz bem sucedida indicada por um ovário expandido formará um pequeno fruto dentro de uma semana.
Colha o fruto após 45 a 55 dias de polinização. Prepare um estoque de cefotaxima. Filtre-o através de um filtro de seringa estéril de 0,22 mícron.
E faça alíquotas de 0,5 mililitro de 250 miligramas por mililitro de cefotaxima antes de armazená-las a menos 20 graus Celsius. Da mesma forma, prepare o estoque de ampicilina. Filtre-o através de um filtro de seringa estéril de 0,22 mícron e prepare alíquotas de um mililitro de 100 miligramas por mililitro de ampicilina antes de armazená-las a menos 20 graus Celsius.
Prepare Murashige e Skoog, ou meio MS, dissolvendo 2,45 gramas do meio em 500 mililitros de água destilada em uma garrafa de um litro. Adicione 1,5 gramas de goma gelana ao meio MS e autoclave-o a 121 graus Celsius por 20 minutos. Esfrie o meio colocando a garrafa em banho-maria a 50 graus Celsius.
Descongele os estoques de antibióticos dentro do gabinete de fluxo laminar. Transfira o frasco médio para o exaustor de fluxo laminar e adicione 0,6 mililitros de caldo de cefotaxima e 0,25 mililitros de caldo de ampicilina ao meio com mistura adequada. Despeje cerca de sete mililitros do meio em uma placa de Petri estéril de 60 por 15 milímetros.
Deixe o meio solidificar nas placas de Petri por aproximadamente 15 a 20 minutos. Feche as placas de Petri com um invólucro de vedação e coloque-as numa caixa de armazenamento à temperatura ambiente até nova utilização. Colha o fruto da abóbora cortando-o da videira principal e desinfete o fruto lavando a sua superfície no lavatório do laboratório usando um detergente líquido como 0,3% de cloroxilenol.
Lave a fruta com água da torneira e seque-a com toalhas de papel limpas antes de transferir a fruta para o armário de fluxo de ar laminado. Esterilize a superfície da fruta dentro do armário pulverizando etanol a 70%. Bissecte o fruto com uma faca estéril e extraia as sementes.
Use pinças estéreis ou mãos com luvas estéreis para abrir assepticamente o revestimento da semente e expor os embriões imaturos antes de colocá-los em uma placa de Petri contendo MS Medium suplementado com antibióticos. Sele as placas de Petri usando filme de embalagem e coloque-as em uma câmara de crescimento com temperatura de 25 graus Celsius, período de foto de 16 horas e 70% de umidade relativa. Em caso de contaminação, subcultura imediatamente os embriões não contaminados em uma nova placa com o mesmo meio.
Uma vez que as raízes são desenvolvidas após 10 a 14 dias, e os cotilédones são desenvolvidos após 15 a 21 dias, remova as plântulas das placas de Petri e lave suavemente o meio presente ao redor das raízes usando água da torneira. Coloque as plântulas limpas em um recipiente de plástico de 14 por 9 por 4 centímetros e cubra as raízes com toalhas de papel molhadas. Cubra o recipiente e umedeça novamente as toalhas de papel quando necessário.
Mantenha os recipientes de plástico a 25 a 28 graus Celsius, e em um período de foto de 16 horas para aclimatar as plântulas, mantendo a condição úmida de toalhas de papel. Após 7 a 10 dias de aclimatação, transfira as mudas de três a quatro centímetros de comprimento para 50 planas celulares contendo mistura comercial de vasos alterada com fertilizante e mova-as para a estufa. Evite o excesso de água para evitar o apodrecimento e adicione aproximadamente 10 a 20 mililitros de água por célula, conforme necessário.
Na segunda à terceira etapa foliar verdadeira, transplante as mudas para vasos de 25 centímetros de diâmetro preenchidos com meio de envasamento alterado com adubo e realize hibridização controlada quando as plantas iniciarem a floração. Mantenha as plantas na estufa a 22 a 28 graus Celsius sob o regime de luz natural. E avaliar as plantas quanto às características dos frutos e sementes.
Quatro Cucurbita pepo e 11 Cucurbita moschata foram escolhidas para hibridização interespecífica. Das 24 combinações cruzadas interespecíficas tentadas, obteve-se um conjunto de frutos para 22 cruzamentos representando mais de 92% de sucesso na frutificação. Os cruzamentos entre Cucurbita moschata e Cucurbita pepo envolvendo genótipos O e M, e genótipos E e J, não produziram frutos maduros.
Considerando que o cruzamento entre Cucurbita moschata e Cucurbita pepo envolvendo os genótipos F e J, produziu seis frutos. O número de flores polinizadas para diferentes combinações cruzadas variou de 1 a 11. E a taxa de sucesso da polinização variou de 0% a 100%Dos 44 frutos produzidos a partir de todas as combinações cruzadas, apenas um fruto de um cruzamento entre Cucurbita moschata e Cucurbita pepo, genótipos C e J produziu embriões imaturos que puderam ser resgatados.
Para o desenvolvimento desses embriões pouco desenvolvidos, eles foram cultivados usando o meio de resgate embrionário, o que resultou em uma taxa de sucesso de 80% para o resgate de embriões. Os dois procedimentos mais importantes são a identificação de cruzamentos compatíveis entre duas espécies, a saber, Cucurbita moschata e Cucurbita pepo, e regeneração embrionária bem-sucedida. Como a técnica de resgate embrionário é simples e facilmente replicável, criadores de abóbora em todo o mundo podem usar essa técnica para resgatar embriões imaturos derivados de cruzamentos interespecíficos entre diferentes espécies de Cucurbita.
