쥐를 사용하여, 이 프로토콜은 키메라 HIV를 사용하여 활성 HIV 감염의 새로운 모형을 확립하기 위하여 이용될 수 있습니다. 쥐와 함께, 약물 남용 및 신경 인지 장애의 연구에 대 한 EcoHIV 감염 모델의 설립 신경 HIV와 HIV-1 관련 된 신경 인지 장애의 연구에 도움이 될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 연구 동료 인 하이롱 리 (Hailong Li)가 될 것입니다.
293 T 세포로 바이러스의 포장을 위해, DMEM의 밀리리터 당 다섯 번째 293 T 세포에 5 번 10 을 종자 10% FBS로 보충 두 젤라틴 코팅 75 평방 센티미터 플라스크와 배양이 도달 할 때까지 섭씨 37도에서 세포를 배양하 50% 수렴성. 트랜스펙트 당일, 플라스크당 750마이크로리터의 미약재 22.5마이크로리터를 1.5밀리리터 마이크로센트심분리기 튜브로 희석하고 3초 동안 용액을 소용돌이시다. 플라스크당 1.5 밀리리터 마이크로센심분리기 튜브에 750마이크로리터의 키메라 에코HIV 플라스미드 DNA 20마이크로그램을 철저한 혼합으로 희석시킵니다.
희석된 DNA와 희석된 형질 전환 시약을 부드러운 혼합과 결합하고 실온에서 15분 동안 생성된 용액을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, prewarm DMEM 배지의 10 밀리리터에 각 바이러스 현탁액을 추가하고 293 T 세포의 한 플라스크에 각 바이러스 보충 솔루션을 추가합니다. 세포 배양 이틀 후, 원심분리를 위해 플라스크에서 상체를 풀고 명확한 상체를 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮긴다.
렌티-X 농축기 8밀리리터를 명확히 된 상체에 넣고 부드러운 반전과 섞으세요. 섭씨 4도에서 2일 간 배양한 후 혼합물을 원심분리하고 상체를 조심스럽게 제거한 다음, 100밀리머 PBS의 100 마이크로리터로 펠릿을 부드럽게 재연하고 P24 ELISA 키트를 사용하여 바이러스 농도를 자극합니다. EcoHIV-EGFP 주사의 경우 페달 반사에 대한 반응부족을 확인한 후 뇌 부위에서 모발을 면도하고 노출된 피부를 70%에탄올과 클로르헨시딘 기반 스크럽으로 두 번 살균합니다.
스테레오탁스 장치에서 쥐를 수습된 자세로 고정하고 두피 미드라인을 따라 피부를 통해 5~6센티미터 절개를 합니다. 1개의 드릴링 위치를 측면 0.8밀리미터, 1.2밀리미터 로스트랄로 표시하여 각 두개골 위치에서 직경 0.4mm의 구멍을 뚫습니다. 10 마이크로리터 주사 주사기에 titered EcoHIV Lentivirus 용액의 밀리리터 당 1.04 배 10 ~ 여섯 번째 트랜스듀싱 유닛을 로드하고 스테레오탁스 장치에 주사기를 고정시킵니다.
바늘을 하나의 드릴링 구멍의 표면에 가깝게 이동하고 구멍에 바늘 2.5 밀리리터를 삽입합니다. 분당 0.2 마이크로리터의 바이러스 속도로 하나의 마이크로리터의 바이러스 용액을 주입합니다. 모든 바이러스가 주입되었을 때, 쥐 두개골 이밖에있을 때까지 천천히 바늘을 철회하기 전에 5 분 동안 주사 영역 내부에 바늘을 둡니다.
4-0 실크 실 봉합사로 피부 절개를 닫고 70 %에탄올로 용액을 살균 한 다음 쥐를 가열 패드에 놓고 방수까지 모니터링하십시오. 바이러스 주입 후 1~8주 후, 페달 반사에 대한 반응이 부족하다는 것을 확인한 후, 연기 후드 내부의 척추 자세로 쥐를 고정하고 흉부 미드라인을 따라 피부를 절개합니다. 격막을 잘라 흉부 구멍을 열고 왼쪽 심실에 20 게이지를 삽입합니다.
즉시 가위로 오른쪽 아트리움을 열고 분당 5 밀리리터로 미리 냉각된 100 밀리리터 PBS의 50밀리리터를 견딜 수 있습니다. 모든 PBS가 전달되면 100 밀리리터의 차가운 4 % 파라 포름알데히드가 제공됩니다. 모든 고정이 전달되면 두개골에서 뇌를 제거하고 신선한 4 %의 파라 포름 알데히드에서 하룻밤 조직을 수정합니다.
다음 날 아침, 뇌가 메틸 부타놀에서 뇌 조직을 영하 80도에서 2분 동안 동결하기 전에 약 3일 동안 50 밀리리터 튜브에 100 밀리미터 PBS의 30%의 30%의 자당40밀리리터에 샘플을 놓습니다. 동결 후 영하 20도의 냉동 저온과 미세 한 페인트 브러시를 사용하여 50 미크론 두께의 관상 섹션을 획득하십시오. 모든 단면을 얻을 때, 300 마이크로리터의 페이드 방지 매체로 샘플을 덮고 22 50 밀리리터 커버립으로 장착하십시오.
매체가 건조되면, 공초점 현미경검사법에 의해 단면을 이미지. 렌티바이러스 주입 후 7일 후, 쥐 관상 동맥 뇌 슬라이스 이미지는 뇌 조직 전반에 걸쳐 EcoHIV-EGFP 신호의 상당한 존재를 드러냅니다, 특히 피질과 해마 의 장축 자이루스 내에서. 이중 라벨링 및 이바1 및 EcoHIV-EGFP 프로브는 마이크로글리아가 뇌에서 에코HIV 발현을 수용하는 주요 세포 유형이라는 강력한 증거를 제공합니다.
8 주 감염 후, EcoHIV 주입 동물은 식염수 대조군에 비해 상대적으로 아첨 간격 기능에 의해 입증 된 바와 같이 상호 자극 간격의 조작에 상대적 무감각을 나타낸다. 또한, EcoHIV 주입 쥐는 대조동물에 비해 머리와 목 직경이 증가하는 짧은 수지상 척추의 상대적 빈도증가에 의해 입증된 바와 같이 수지상 척추 형태에 심오한 변화를 표시합니다. 스테레오탁스 주입 전에 조건 매체의 농도 및 적정은 실험 전반에 걸쳐 일관되고 복제 가능한 결과를 보장하는 데 중요합니다.
EcoHIV의 이 특정 지역 입체 주사는 두뇌 내의 능률적인 HIV 감염을 제공하고 쥐에 있는 시간 적 처리 적자를 일으킵니다. 에코 HIV 감염 모델을 확장 하기 위해 쥐에 스테레오 탁스 HIV 주사의 활용은 손에 신경 HIV와 관련 된 새로운 질문을 해결 하기 위한 중요 한 기회를 제공.
