En utilisant des rats, ce protocole peut être utilisé pour établir un nouveau modèle d’infection active par le VIH à l’aide du VIH chimérique. chez les rats, l’établissement du modèle d’infection EcoHIV pour les études sur l’abus de drogues et les troubles neurocognitifs pourrait être bénéfique pour l’étude des troubles neurocognitifs associés au VIH et au VIH-1. La démonstration de la procédure sera Hailong Li, un associé de recherche de mon laboratoire.
Pour l’emballage du virus en 293 lymphocytes T, ensemencez cinq fois 10 à la cinquième 293 lymphocytes T par millilitre de DMEM complétés par 10% fbs dans chacun des deux flacons de 75 centimètres carrés enduits de gélatine et incuber les cellules à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cultures atteignent 50% de confluence. Le jour de la transfection, diluer 22,5 microlitres de réactif de transfection dans 750 microlitres de milieu par fiole dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et vortex la solution pendant trois secondes. Diluer 20 microgrammes de l’ADN plasmidique chimérique EcoHIV dans 750 microlitres de milieu dans un deuxième tube microcentrifuge de 1,5 millilitre par flacon avec un mélange complet.
Mélanger l’ADN dilué avec le réactif de transfection dilué avec un mélange doux et incuber la solution résultante pendant 15 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, ajouter chaque suspension virale à 10 millilitres de milieu DMEM d’avant-guerre et ajouter chaque solution complétée par le virus à une fiole de 293 lymphocytes T. Après deux jours de culture cellulaire, regrouper le surnageant des fioles dans un seul tube conique de 50 millilitres pour la centrifugation et transférer le surnageant clarifié dans un nouveau tube de 50 millilitres.
Ajoutez huit millilitres de concentrateur Lenti-X au surnageant clarifié et mélangez avec une inversion douce. Après une incubation de deux jours à quatre degrés Celsius, centrifuger le mélange et retirer soigneusement le surnageant, puis ressusciter doucement le granulé avec 100 microlitres de PBS 100 millimolaires et utiliser un kit ELISA P24 pour titrer la concentration de virus. Pour l’injection EcoHIV-EGFP, après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale, rasez les cheveux de la région du cerveau et stérilisez la peau exposée deux fois avec de l’éthanol à 70% et un gommage à base de chlorhexidine.
Fixez le rat en position couchée dans un appareil stéréotaxique et faites une incision de cinq à six centimètres à travers la peau le long de la ligne médiane du cuir chevelu. Marquez une position de forage à 0,8 millimètre latéral et une position rostrale de 1,2 millimètre à bregma et percez un trou de 0,4 millimètre de diamètre à chaque position du crâne. Chargez 1,04 fois 10 jusqu’aux sixièmes unités de transduction par millilitre de solution de lentivirus EcoHIV titré dans une seringue d’injection de 10 microlitres et fixez la seringue à l’appareil stéréotaxique.
Déplacez l’aiguille près de la surface d’un trou de forage et insérez l’aiguille de 2,5 millilitres dans le trou. Infuser un microlitre de solution virale à raison de 0,2 microlitres de virus par minute. Lorsque tout le virus a été injecté, laissez l’aiguille à l’intérieur de la zone d’injection pendant cinq minutes avant de rétracter lentement l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit à l’extérieur du crâne du rat.
Fermez l’incision de la peau avec une suture de fil de soie 4-0 et stérilisez la solution avec de l’éthanol à 70%, puis placez le rat dans une chambre de récupération avec un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à la réamence. Une à huit semaines après la perfusion virale, après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale, fixer le rat dans une position couchée sur le décubitus dorsal à l’intérieur d’une hotte et inciser la peau le long de la ligne médiane thoracique. Coupez le diaphragme pour ouvrir la cavité thoracique et insérez une aiguille de calibre 20 par 25 millimètres dans le ventricule gauche.
Ouvrez immédiatement l’oreillette droite avec des ciseaux et parcourez 50 millilitres de PBS 100 millimolaires pré-refroidis à un débit de cinq millilitres par minute. Lorsque tout le PBS a été livré, perfuser avec 100 millilitres de paraformaldéhyde froid à 4%. Lorsque tout le fixateur a été délivré, retirez le cerveau du crâne et fixez le tissu pendant la nuit dans du paraformaldéhyde frais à 4%.
Le lendemain matin, placez l’échantillon dans 40 millilitres de saccharose à 30% dans du PBS 100 millimolaires dans un tube de 50 millilitres pendant environ trois jours jusqu’à ce que le cerveau se dépose au fond du tube avant de casser le tissu cérébral dans du butanol méthylique pendant deux minutes à moins 80 degrés Celsius. Après la congélation, utilisez un cryostat à moins 20 degrés Celsius et un pinceau fin pour acquérir des sections coronales de 50 microns d’épaisseur. Lorsque toutes les sections ont été obtenues, couvrez les échantillons avec 300 microlitres de milieu anti-fondu et montez-les avec 22 lamures de 50 millilitres.
Lorsque le milieu a séché, imagez les sections par microscopie confocale. Sept jours après l’injection de Lentivirus, les images coronales de tranche cérébrale de rat indiquent une présence significative des signaux EcoHIV-EGFP dans tout le tissu cérébral, en particulier dans le cortex et le gyrus dentelé hippocampal. Le double étiquetage avec et les sondes Iba1 et EcoHIV-EGFP fournit des preuves solides que la microglie est le type de cellule prédominant hébergeant l’expression d’EcoHIV dans le cerveau.
Huit semaines après l’infection, les animaux injectés par EcoHIV présentent une relative insensibilité à la manipulation de l’intervalle interstimulus, comme en témoigne une fonction d’intervalle relativement plus plate par rapport aux témoins salins. En outre, les rats injectés ecoHIV montrent des changements profonds dans leur morphologie dendritique d’épine comme en témoigne une fréquence relative accrue des épines dendritiques plus courtes avec des diamètres accrus de tête et de cou par rapport aux animaux témoins. La concentration et le titrage du milieu de condition avant l’injection stéréotaxique sont essentiels pour assurer des résultats cohérents et reproductibles à travers les expériences.
Cette injection stéréotaxique régionale spécifique d’EcoHIV fournit une infection efficace par le VIH dans le cerveau et produit des déficits de traitement temporel chez les rats. L’utilisation d’injections stéréotaxiques de VIH chez le rat pour étendre le modèle d’infection EcoHIV offre une occasion clé de répondre à de nouvelles questions liées au neuro-VIH à portée de main.
