מודל עכברוש של זיהום מוחי EcoHIV

באמצעות חולדות, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להקים מודל חדש של זיהום HIV פעיל באמצעות HIV כימרי. עם חולדות, הקמת מודל זיהום EcoHIV למחקרים של שימוש בסמים והפרעות נוירוקוגניטיביות יכול להיות מועיל לחקר נוירו HIV ו- HIV-1 הקשורים הפרעות נוירוקוגניטיביות. הליך ההדרה יהיה Hailong לי, עמית מחקר מהמעבדה שלי.

עבור אריזה של הנגיף לתוך 293 תאי T, זרע חמש פעמים 10 כדי החמישי 293 תאי T למיליליטר של DMEM בתוספת 10%FBS לתוך כל אחד משני צלויי ג'לטין מצופה 75 ס"מ רבועים דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עד התרבויות להגיע 50% קונפלורציה. ביום של transfection, לדלל 22.5 microliters של reagent transfection ב 750 microliters של בינוני לכל בקבוק בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ומערבולת הפתרון במשך שלוש שניות. לדלל 20 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד EcoHIV כימרי ב 750 microliters של מדיום בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר השני לכל בקבוק עם ערבוב יסודי.

ערבבו את הדנ"א המדולל עם ריאגנט transfection מדולל עם ערבוב עדין לדגר את הפתרון וכתוצאה מכך במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, להוסיף כל השעיה וירוס 10 מיליליטר של בינוני DMEM לפני המלחמה ולהוסיף כל פתרון תוספת וירוס בקבוק אחד של 293 T-תאים. לאחר יומיים של תרבות תאים, בריכה supernatant מן הבקבוקים בצינור חרוט אחד 50 מיליליטר עבור צנטריפוגה ולהעביר את supernatant הבהיר לצינור חדש 50 מיליליטר.

הוסיפו שמונה מיליליטרים של רכז לנטי-X לסופרנאטנט המובהר וערבבו עם היפוך עדין. לאחר דגירה של יומיים בארבע מעלות צלזיוס, צנטריפוגה את התערובת בזהירות להסיר את supernatant, ולאחר מכן בעדינות resuspend גלולה עם 100 microliters של 100 PBS מילימולארי ולהשתמש בערכת אליזה P24 כדי titer ריכוז הנגיף. להזרקת EcoHIV-EGFP, לאחר אישור חוסר תגובה לרפלקס הדוושות, גילחו את השיער מאזור המוח ועקרו את העור החשוף פעמיים עם 70% אתנול וקרצוף מבוסס כלורקסידין.

לאבטח את החולדה בתנוחה נוטה במנגנון סטריאוטאקסי ולעשות חתך של חמישה עד שישה סנטימטרים דרך העור לאורך קו האמצע הקרקפת. סמן תנוחת קידוח אחת ב-0.8 מ"מ לרוחב ואחת של 1.2 מ"מ לרגמה וקדח חור בקוטר 0.4 מ"מ בכל מיקום גולגולת. לטעון 1.04 פעמים 10 ליחידות התמרה השישית לכל מיליליטר של פתרון EcoHIV Lentivirus מרופט לתוך מזרק הזרקת 10 מיקרוליטר ולאבטח את המזרק למנגנון סטריאוטאקסי.

להזיז את המחט קרוב לפני השטח של חור קידוח אחד ולהכניס את המחט 2.5 מיליליטר לתוך החור. להחדיר מיקרוליטר אחד של פתרון וירוס בקצב של 0.2 microliters של וירוס לדקה. כאשר כל הנגיף הוזרק, להשאיר את המחט בתוך אזור ההזרקה במשך חמש דקות לפני לאט חוזר המחט עד שהוא מחוץ לגולגולת החולדה.

סגור את החתך בעור עם תפר חוט משי 4-0 ועקר את הפתרון עם 70% אתנול, ולאחר מכן למקם את החולדה בתא התאוששות עם כרית חימום עם ניטור עד שיקום. שבוע עד שמונה שבועות לאחר עירוי ויראלי, לאחר אישור חוסר תגובה לרפלקס הדוושה, לתקן את החולדה בתנוחה סופית בתוך מכסה המנוע אדים ולהסית את העור לאורך קו האמצע של בית החזה. חותכים את הסרעפת כדי לפתוח את חלל בית החזה ולהכניס 20 מד על ידי מחט 25 מילימטר לתוך החדר השמאלי.

מיד לפתוח את האטריום הנכון עם מספריים לחלחל 50 מיליליטר של PBS מצונן מראש 100 מילימולאר בקצב זרימה של חמישה מיליליטר לדקה. כאשר כל PBS נמסר, לחלחל עם 100 מיליליטר של קר 4% paraformaldehyde. כאשר כל התיקון נמסר, להסיר את המוח מהגולגולת ולתקן את הרקמה לילה טרי 4% paraformaldehyde.

למחרת בבוקר, למקם את המדגם ב 40 מיליליטר של 30% סוכרוז ב PBS 100 מילימולאר בצינור 50 מיליליטר במשך כשלושה ימים עד המוח מתיישב לתחתית הצינור לפני הצמד הקפאת רקמת המוח במתיל butanol במשך שתי דקות במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר ההקפאה, יש להשתמש בהקפאה של מינוס 20 מעלות צלזיוס ובמברשת צבע עדינה כדי לרכוש 50 חלקי קורונל בעובי מיקרון. כאשר כל החלקים הושגו, לכסות את הדגימות עם 300 microliters של מדיום נגד עמעום ולהרכיב אותם עם 22 50 מיליליטר coverlips.

כאשר המדיום התייבש, צלם את החלקים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שבעה ימים לאחר הזרקת Lentivirus, תמונות פרוסת מוח coronal חולדה לחשוף נוכחות משמעותית של אותות EcoHIV-EGFP בכל רקמת המוח, במיוחד בתוך קליפת המוח ואת gyrus שקע ההיפוקמפוס. שתי תיוג עם Iba1 ו EcoHIV-EGFP בדיקות לספק ראיות חזקות כי microglia הם סוג התא השולט מחסה ביטוי EcoHIV במוח.

שמונה שבועות לאחר ההדבקה, EcoHIV הזריק בעלי חיים להפגין חוסר רגישות יחסית למניפולציה של מרווח interstimulus כפי שמעידים על ידי פונקציית מרווח מחמיא יחסית בהשוואה לבקרות מלוחים. בנוסף, חולדות מוזרקות EcoHIV מציגות שינויים עמוקים במורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטי שלהן, כפי שמעידות תדירות יחסית מוגברת של קוצים דנדריטיים קצרים יותר עם קטרים מוגברים של הראש והצוואר ביחס לבעלי חיים שולטים. הריכוז והטיטרטינג של מדיום המצב לפני הזרקה סטראוטקסית הוא קריטי כדי להבטיח את התוצאות עקביות שכפול על פני ניסויים.

הזרקה סטראוטקסית אזורית ספציפית זו של EcoHIV מספקת זיהום HIV יעיל בתוך המוח ומייצרת ליקויי עיבוד זמניים בחולדות. הניצול של זריקות HIV סטראוטקסי בחולדות כדי להרחיב את מודל זיהום EcoHIV מאפשר הזדמנות מפתח לטיפול בשאלות חדשניות הקשורות נוירו HIV בהישג יד.