Utilizzando ratti, questo protocollo può essere utilizzato per stabilire un nuovo modello di infezione attiva da HIV utilizzando l'HIV chimerico. con i ratti, l'istituzione del modello di infezione EcoHIV per gli studi sull'abuso di droghe e sui disturbi neurocognitivi potrebbe essere utile per lo studio dei disturbi neuro-HIV e HIV-1 associati alla neurocognizione. A dimostrare la procedura sarà Hailong Li, un ricercatore del mio laboratorio.
Per il confezionamento del virus in 293 cellule T, seminare cinque volte 10 alla quinta 293 cellule T per millilitro di DMEM integrato con 10%FBS in ciascuno dei due contenitori di 75 centimetri quadrati rivestiti di gelatina e incubare le cellule a 37 gradi Celsius fino a quando le colture non raggiungono il 50% di confluenza. Il giorno della trasfezione, diluire 22,5 microlitri di reagente di trasfezione in 750 microlitri di mezzo per pallone in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e vortice la soluzione per tre secondi. Diluire 20 microgrammi del DNA plasmide Chimerico EcoHIV in 750 microlitri di mezzo in un secondo tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri per pallone con miscelazione accurata.
Unire il DNA diluito con il reagente di trasfezione diluito con miscelazione delicata e incubare la soluzione risultante per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere ogni sospensione del virus a 10 millilitri di mezzo DMEM prebellica e aggiungere ogni soluzione integrata da virus a un pallone da 293 cellule T. Dopo due giorni di coltura cellulare, mettere in comune il supernatante dai contenitori in un unico tubo conico da 50 millilitri per la centrifugazione e trasferire il supernatante chiarificato in un nuovo tubo da 50 millilitri.
Aggiungere otto millilitri di Concentratore Lenti-X al supernatante chiarificato e mescolare con delicata inversione. Dopo un'incubazione di due giorni a quattro gradi Celsius, centrifugare la miscela e rimuovere con cura il supernatante, quindi rimescolare delicatamente il pellet con 100 microlitri di PBS millimolare e utilizzare un kit P24 ELISA per titolottare la concentrazione del virus. Per l'iniezione EcoHIV-EGFP, dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale, radere i capelli dalla regione cerebrale e sterilizzare la pelle esposta due volte con il 70% di etanolo e uno scrub a base di clorexidina.
Fissare il topo in una posizione incline in un apparato stereotassico e fare un'incisione da cinque a sei centimetri attraverso la pelle lungo la linea mediana del cuoio capelluto. Contrassegnare una posizione di foratura a 0,8 millimetri lateralmente e una da 1,2 millimetri rostrale a bregma e praticare un foro di 0,4 millimetri di diametro in ogni posizione del cranio. Caricare 1,04 volte 10 alla sesta unità di trasduzione per millilitro di soluzione di Lentivirus EcoHIV piastrellata in una siringa a iniezione da 10 microlitri e fissare la siringa all'apparato stereotassico.
Spostare l'ago vicino alla superficie di un foro di perforazione e inserire l'ago 2,5 millilitri nel foro. Infondere un microlitri di soluzione virale ad una velocità di 0,2 microlitri di virus al minuto. Quando tutto il virus è stato iniettato, lasciare l'ago all'interno dell'area di iniezione per cinque minuti prima di ritrarre lentamente l'ago fino a quando non è al di fuori del cranio del ratto.
Chiudere l'incisione cutanea con una sutura del filo di seta 4-0 e sterilizzare la soluzione con 70%etanolo, quindi posizionare il topo in una camera di recupero con una pastiglia riscaldante con monitoraggio fino a rimpasto. Da una a otto settimane dopo l'infusione virale, dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale, fissare il topo in posizione supina all'interno di un cappuccio dei fumi e incidere la pelle lungo la linea mediana toracica. Tagliare il diaframma per aprire la cavità toracica e inserire un ago da 20 misura per 25 millimetri nel ventricolo sinistro.
Aprire immediatamente l'atrio destro con forbici e perfondire 50 millilitri di PBS prerimorto da 100 millimolare a una portata di cinque millilitri al minuto. Una volta consegnato tutto il PBS, per infusione con 100 millilitri di paraformaldeide fredda al 4%. Una volta che tutto il fissatore è stato consegnato, rimuovere il cervello dal cranio e fissare il tessuto durante la notte in paraformaldeide fresca al 4%.
La mattina seguente, posizionare il campione in 40 millilitri di saccarosio al 30% in PBS millimolare in un tubo da 50 millilitri per circa tre giorni fino a quando il cervello si deposita sul fondo del tubo prima di scattare congelando il tessuto cerebrale in butanolo metile per due minuti a meno 80 gradi Celsius. Dopo il congelamento, utilizzare un criostato di meno 20 gradi Celsius e un pennello fine per acquisire sezioni coronali spesse 50 micron. Una volta ottenute tutte le sezioni, coprire i campioni con 300 microlitri di mezzo anti-dissolvenza e montarli con 22 coverlips da 50 millilitri.
Quando il mezzo si è asciugato, immagini le sezioni per microscopia confocale. Sette giorni dopo l'iniezione di Lentivirus, le immagini della fetta cerebrale coronale del ratto rivelano una presenza significativa di segnali EcoHIV-EGFP in tutto il tessuto cerebrale, specialmente all'interno della corteccia e del giro dentato ippocampale. La doppia etichettatura con le sonde Iba1 ed EcoHIV-EGFP fornisce una forte prova che le microglia sono il tipo di cellula predominante che ospita l'espressione EcoHIV nel cervello.
Otto settimane dopo l'infezione, gli animali iniettati ecoHIV mostrano una relativa insensibilità alla manipolazione dell'intervallo interstimolo come evidenziato da una funzione a intervalli relativamente più piatta rispetto ai controlli salini. Inoltre, i ratti iniettati ecoHIV mostrano profonde alterazioni nella loro morfologia dendritica della colonna vertebrale, come evidenziato da una maggiore frequenza relativa di spine dendritiche più corte con un aumento del diametro della testa e del collo rispetto agli animali di controllo. La concentrazione e il titrating del mezzo di condizione prima dell'iniezione stereotassica è fondamentale per garantire i risultati coerenti e replicabili tra gli esperimenti.
Questa specifica iniezione stereotassica regionale di EcoHIV fornisce un'efficiente infezione da HIV all'interno del cervello e produce deficit di elaborazione temporale nei ratti. L'utilizzo di iniezioni stereotassiche di HIV nei ratti per estendere il modello di infezione EcoHIV offre un'opportunità chiave per affrontare nuove questioni relative al neuro HIV a portata di mano.
