이 프로토콜의 전반적인 목표는 삼투성 펌프에 뇌 캐뉼라를 사용하고 도전적인 모터 작업을 통해 스트레스를 유도하여 DYT/PARK-ATP1A3 근긴장 이상증에 대한 증상, 약리학적 마우스 모델을 확립하는 데 관련된 절차를 설명하는 것입니다. 이 방법은 다중 뇌 캐뉼라에 삼투성 펌프를 통해 만성 약물 전달을 사용하여 약리학적 마우스 모델을 설정하는 방법과 도전적인 운동 작업을 통해 표현형을 유도하는 방법을 자세히 설명합니다. 가벼운 모터 스트레스 패러다임은 또한 운동 장애에서 유전자 환경 상호 작용의 역할에 대한 통찰력을 제공하고 다른 설치류 모델에 적용 할 수 있습니다.
동물 실험은 동물의 치료와 사용을 위한 해당 국가 및 제도적 지침에 따라 수행되었습니다. 멸균 환경에서 삼투압 펌프를 준비하여 시작합니다. 먼저, 멸균 여과 된 와뱅 용액 또는 차량 용액으로 27 게이지 충전 캐뉼라로 밀리리터 주사기를 채웁니다.
삼투압 펌프를 똑바로 세워 펌프에 넣을 수 있는 캐뉼라를 펌프에 삽입하고 여분의 용액이 위에 나타날 때까지 천천히 저수지를 채웁니다. 다음으로 흐름 중재자를 펌프에 삽입합니다. 흐름 중재자의 흰색 플랜지를 가위로 조심스럽게 벗고 비닐 튜브 조각을 흐름 중재자에 연결합니다.
각 펌프를 식염수 용액으로 반쯤 채워진 Eppendorf 튜브에 담그고 펌핑 속도가 수술을 시작하기 전에 정상 상태에 도달하도록 하기 위해 37도열사이클러에 넣습니다. 동물이 승인 된 프로토콜에 따라 심층 마취 된 후 동물을 고정 프레임에 넣고 고무 팁이나 파열되지 않은 이어 바를 사용하여 머리를 고정하십시오. 수술 부위를 철저히 소독한 후 메스를 사용하여 머리 꼭대기에 절개를 하고 가위를 사용하여 앞다리까지 절개를 계속합니다.
불독 클램프의 도움으로 두개골을 노출하고 멸균 면 팁 어플리케이터로 음막 통을 닦아. 펜또는 검은 잉크에 염색된 캐뉼러 끝을 브레그마로 정렬하고 적절한 좌표를 사용하여 두개골에 있는 뇌 캐뉼라의 세 가지 진입점을 표시합니다. 다음으로, 기저 신경교에 지정된 이중 통과 소뇌에 지정된 단일 캐뉼라에 대한 구멍을 신중하게 드릴한다.
줄무늬와 소뇌 사이에 작은 나사에 대한 네 번째 구멍을 드릴. 이 나사는 결국 치과 시멘트에 내장되어 있으며 캐뉼라에 대한 추가 보류를 제공합니다. 동물의 양쪽에 삼투압 펌프용 작은 주머니를 만들려면 조직 집게를 사용하여 피하 조직 층을 분리하십시오.
집안의 한 쪽 뒷다리쪽으로 전진하고 피하 포켓을 넓히기 위해 약간 포셉을 엽니다. 다른 쪽에 대해 동일한 절차를 반복하고 먼저 절개에서 집게를 제거한 다음 두 번째 뒷다리쪽으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 집게의 도움으로 펌프와 연결된 카테터를 각 피하 포켓에 조심스럽게 삽입하십시오.
포켓은 펌프가 쉽게 밀어 넣을 수 있도록해야합니다. 미니 펌프 홀더를 사용하여 소뇌의 중간선에 뚫린 구멍에 3.0밀리미터의 사용자 정의 길이가 있는 단일 삼투압 캐뉼라를 소개합니다. 캐뉼라 헤드를 조심스럽게 분리하고 캐뉼라와 작은 나사를 치과 시멘트로 고정하여 삼투성 펌프의 튜브를 덮지 않도록 주의하십시오.
캐뉼라를 둘러싼 치과 의사 시멘트가 수술을 계속하기 전에 완전히 건조되었는지 확인하십시오. 기저 간질 위의 양자 간 구멍에 이중 캐뉼라를 삽입하기 전에 0.5센티미터 길이의 비닐 튜브 두 개를 더블 캐뉼라의 두 개의 연결 조각에 부착하십시오. 비닐 튜빙을 양면 어댑터와 연결하고 멸균 우아베인 솔루션 또는 차량으로 튜브 시스템 전체를 조심스럽게 미리 작성합니다.
다음으로, 단일 캐뉼라에 대해 이전에 표시된 것과 동일한 단계를 반복하고 치과 시멘트로 이중 캐뉼라를 고정하여 끝납니다. 삼투압 펌프의 카테터를 각각 단일 캐뉼라뿐만 아니라 분면 어댑터에 연결합니다. 두 펌프 모두 동일한 유량을 가지므로 삼투성 펌프를 이중 농축 용액과 이중 농축 액액을 분기 어댑터에 연결하여 동일한 농도가 기저 신경리아와 소뇌 모두에 도달할 수 있도록 주의하십시오.
피부를 과도하게 펴지 않고 가능한 한 바늘로 동물의 뒤쪽절개를 닫습니다. 탈수증을 피하기 위해 체온이 있어야하는 멸균 식염수에 피하시 주입하십시오. 스테레오전술 프레임에서 동물을 제거하고 복구 케이지에 넣습니다.
근긴장 이상과 같은 운동을 유도하기 위해, 와베인 퍼진 마우스는 수술 후 4 시간 동안 가벼운 스트레스 패러다임으로 도전적인 운동 작업에 노출되어야하며 그 후 24 시간마다 반복적으로. 여기에는 동물의 행동 특성화가 포함되지 않습니다. 우리는 50센티미터 의 거친 표면 나무 기둥에 배치되는 차량 으로 퍼진 동물의 예를 여기에서 보여 주며, 코가 아래쪽을 향하고 있습니다.
낙상 시 극 기슭에 충분한 침구를 제공합니다. ouabain perfused 마우스에 대 한, 동물 은 수술 후 4 시간 같은 첫 번째 증상을 제시 하기 시작 한다. 그러나 수술 후 24 시간, 당신은 하강 하는 동안 근 긴장 증 같은 운동의 표시로 앞 팔 다리 또는 뒷다리의 무의식적인 hyperextension을 볼 수 있어야 합니다.
마우스는 극을 세 번 하강해야하며 각 하강 사이에 적어도 2 분 동안 회복할 수 있습니다. 하강의 시간을 측정할 필요가 없습니다. 폴 테스트다음에 회전로드를 사용하여 두 번째 모터 작업이 따라야 합니다.
로타로드 성능 테스트와 마찬가지로 응력 그룹에서 나온 와아베인 및 차량 침투 마우스를 회전 막대에 배치합니다. 늦을 대기 시간을 측정할 필요가 없습니다. 이전 테스트에 대해 수행한 것처럼 마우스를 회전 막대에 세 번 배치하여 2분간의 회복이 진행됩니다.
수정된 근긴장 이상 등급 척도는 마우스의 근긴장 이상 과 같은 운동의 주파수, 엄격 및 바디 분포를 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 동물은 플라스틱 또는 나무 상자에 배치해야하며 움직임은 4 분 동안 기록해야합니다. 평가자는 그룹 할당에 눈을 멀게 해야 합니다.
근긴장 장애로 간주되는 운동이나 자세는 앞 사지의 비자발적 인 하이퍼 확장, 넓은 자세, 또는 뒷다리의 하이퍼 확장뿐만 아니라 kyphosis입니다. 한 신체 부위만 영향을 받는 경우 근긴장 이상은 초점으로 간주되어야 합니다. 트렁크와 적어도 두 개의 다른 신체 부위가 영향을 받는 경우 근긴장 이상은 일반화된 것으로 간주되어야 합니다.
0에서 8점까지 새로 개발된 두 번째 득점 시스템은 테일 서스펜션 테스트 중 근긴장 이상과 같은 움직임의 존재와 심각도를 평가합니다. 테스트를 위해, 2 분 동안 베이스 근처 꼬리에 의해 마우스를 잡아. 테일 서스펜션 테스트를 기록하고 푸티지의 후속 분석에 점수를 할당하는 것이 좋습니다.
앞팔다리는 0에서 4점으로 득점됩니다. 전면 사지 중 하나의 반복되거나 지속적인 강장제 회수뿐만 아니라 앞 사지의 교차와 결합 된 확장은 근긴장 이상과 같은 것으로 득점됩니다. 뒷다리의 근긴장이상과 같은 움직임은 후퇴와 클렌칭을 의미하며 지속적인 하이퍼익스텐션은 0에서 3점으로 점수가 매겨집니다.
기록된 시간의 80% 이상이 존재하는 트런칼 왜곡은 추가 포인트로 득점됩니다. 뒷다리 걸쇠는 모터 손상에 대한 비특이적 징후이며 득점해서는 안됩니다. 이 그래프는 근긴장 이상 등급 척도의 결과를 보여줍니다.
와베인을 가중한 스트레스마우스는 비응우스트레스와 백아베인 퍼퓨즈 그룹, 차량 동물보다 72시간 의 관측 기간 동안 훨씬 더 많은 근긴장증 같은 움직임을 존재한다. 이 이미지는 꼬리 서스펜션 테스트의 결과를 묘사하고 근긴장 이상 등급 척도와 유사한 결과를 보여줍니다. 각 시간 지점에 대한 각 동물의 총 점수에서 평균의 결과가 유의하시기 유의하십시오.
이 비디오를 시청 한 후, 당신은 고정 관제 여러 뇌 캐뉼라를 이식하는 방법과 피하 삼투성 펌프를 피형적으로 이식하는 방법을 잘 이해해야합니다. 이 방법의 주요 장점은 반복적이고 스트레스가 많은 주사를 피할 수 있으며, 그렇지 않으면 시스템 전체의 부작용이 있는 우아베인과 같은 기판이 특정 뇌 구조로 직접 전달될 수 있다는 것입니다.
