El objetivo general de este protocolo es describir los procedimientos involucrados en el establecimiento de un modelo sintomático de ratón farmacológico para la distonía DYT/PARK-ATP1A3 mediante el uso de cánulas cerebrales en bombas osmóticas e induciendo el estrés a través de tareas motoras desafiantes. Este método detalla cómo establecer un modelo farmacológico de ratón utilizando la administración crónica de fármacos a través de bombas osmóticas a múltiples cánulas cerebrales y cómo inducir el fenotipo a través de tareas motoras desafiantes. El paradigma del estrés motor leve también proporciona información sobre el papel de las interacciones gen-ambientales en los trastornos del movimiento, y se puede aplicar a otros modelos de roedores.
Los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices nacionales e institucionales aplicables para el cuidado y uso de animales. Comience preparando las bombas osmóticas en un ambiente estéril. En primer lugar, llene una jeringa de un mililitro con una cánula de llenado de calibre 27 con solución de ouabain filtrada estéril o solución para vehículos.
Sujete la bomba osmótica en posición vertical, inserte la cánula hasta el final en la bomba y llene lentamente el depósito hasta que aparezca un exceso de solución en la parte superior. A continuación, inserte el moderador de flujo en la bomba. Retire cuidadosamente la brida blanca del moderador de flujo con tijeras y conecte una pieza de tubo de vinilo al moderador de flujo.
Sumergir cada bomba en tubos Eppendorf llenos a mitad de camino con solución salina y ponerlos en un termociclador 37 grados con el fin de asegurarse de que la tasa de bombeo alcanza un estado estable antes de comenzar la cirugía. Después de que el animal es profundamente anestesiado de acuerdo con los protocolos aprobados, coloque el animal en un marco estereotáctico y fije la cabeza usando puntas de goma o barras de oído no rotas. Después de una desinfección exhaustiva del área quirúrgica, utilice un bisturí para colocar la incisión en la parte superior de la cabeza y use tijeras para continuar la incisión hasta las extremidades delanteras.
Exponga el cráneo con la ayuda de abrazaderas de bulldog y limpie el periosteum con un aplicador estéril con punta de algodón. Alinee una pluma o la punta de un manchado cannular en tinta negra con bregma y utilice las coordenadas apropiadas para marcar los tres puntos de entrada para las cánulas cerebrales en el cráneo. A continuación, taladre cuidadosamente los orificios para el cannular doble designado para los ganglios basales y la cánula única designada para el cerebelo.
Taladre un cuarto agujero para un pequeño tornillo entre el estriado y el cerebelo. Este tornillo eventualmente se incrustará en el cemento dental y proporcionará sujeción adicional para las cánulas. Con el fin de crear un pequeño bolsillo para la bomba osmótica en cada lado de los animales de la espalda, utilice fórceps de tejido para separar las capas de tejido subcutáneo.
Avance los fórceps hacia una pata trasera y abra ligeramente los fórceps para ensanchar el bolsillo subcutáneo. Repita el mismo procedimiento para el otro lado, primero retirando los fórceps de la incisión y luego empujándolos suavemente hacia la segunda pata trasera. Con la ayuda de fórceps, inserte cuidadosamente las bombas y el catéter conectado en cada bolsillo subcutáneo.
El bolsillo debe permitir que la bomba se deslice fácilmente. Usando un mini soporte de bomba, introduzca una sola cánula osmótica con una longitud personalizada de 3,0 milímetros en el agujero perforado en la línea media del cerebelo. Separe el cabezal de la cánula con cuidado y fije la cánula, así como el pequeño tornillo con cemento dental, teniendo cuidado de no cubrir la pieza de conexión para el tubo de la bomba osmótica.
Asegúrese de que el cemento dentista que rodea la cánula se ha secado completamente antes de continuar con la cirugía. Antes de insertar la cánula doble en los agujeros perforados bilateralmente por encima de los ganglios basales, adjunte dos trozos de 0,5 centímetros de largo de tubo de vinilo a las dos piezas de conexión de la cánula doble. Conecte los tubos de vinilo con un adaptador de bifurcación y rellene cuidadosamente todo el sistema de tubos con solución de ouabain estéril o vehículo.
A continuación, repita los mismos pasos que se mostraron anteriormente para la cánula única y termine fijando la doble cánula con cemento dental. Conecte los catéteres de las bombas osmóticas al adaptador de bifurcación, así como a una sola cánula respectivamente. Ambas bombas tienen un caudal igual, así que tenga cuidado de conectar la bomba osmótica con una solución doble concentrada al adaptador de bifurcación para asegurarse de que la misma concentración alcance tanto los ganglios basales como el cerebelo.
Cierre la incisión en la parte posterior de los animales con puntos de sutura en la medida de lo posible sin estirar demasiado la piel. Inyecte por vía subcutánea solución salina estéril, que debe tener temperatura corporal para evitar la deshidratación. Retire el animal del marco estereotáctico y colóquelo en la jaula de recuperación.
Con el fin de inducir movimientos similares a la distonía, los ratones perfundidos con ouabain deben estar expuestos a tareas motoras desafiantes como paradigma de estrés leve cuatro horas después de la cirugía y repetitivamente cada 24 horas después. Esto no incluye una caracterización conductual de los animales. Aquí mostramos el ejemplo de un animal perfundido por vehículos, que se coloca sobre un poste de madera de superficie rugosa de 50 centímetros, nariz orientada hacia abajo.
Proporcione suficiente ropa de cama en la base del poste en caso de caídas. En el caso de los ratones con piel de ouabain, los animales deben comenzar a presentar los primeros síntomas como bradiquinesia cuatro horas después de la cirugía. Sin embargo, 24 horas después de la cirugía, usted debe ver la hiperextensión involuntaria de las extremidades delanteras o posteriores como un signo de movimientos similares a la distonía durante el descenso.
Los ratones deben descender el polo tres veces, permitir al menos dos minutos de recuperación entre cada descenso. No es necesario medir el tiempo de descenso. La prueba del poste debe ir seguida de una segunda tarea motora, utilizando una varilla giratoria.
Como se hace para la prueba de rendimiento de Rotarod, los ratones perfundidos de ouabain y vehículo de los grupos de estrés se colocan en la varilla giratoria. No es necesario medir la latencia a caída. Como se hace para la prueba anterior, los ratones deben colocarse en la varilla giratoria tres veces, permitiendo dos minutos de recuperación entre carreras.
La escala de clasificación de distonía modificada se puede utilizar para evaluar la frecuencia, gravedad y distribución corporal de los movimientos similares a la distonía de los ratones. Los animales deben colocarse en una caja de plástico o madera y los movimientos deben registrarse durante un período de tiempo de cuatro minutos. Los calificadores deben cegarse a la asignación de grupo.
Los movimientos o posturas que se consideran similares a la distonía son la hiperextensión involuntaria de las extremidades frontales, una postura amplia o hiperextensión de las extremidades posteriores, así como la cifosis. Si solo se ve afectada una parte del cuerpo, la distonía debe considerarse como focal. Si el tronco y al menos otras dos partes del cuerpo se ven afectados, la distonía debe considerarse generalizada.
Un segundo sistema de puntuación recientemente desarrollado de cero a ocho puntos, evalúa la presencia y gravedad de los movimientos similares a la distonía durante una prueba de suspensión de cola. Para la prueba, sostenga el ratón por la cola cerca de su base durante dos minutos. Se recomienda grabar la prueba de suspensión de cola y asignar una puntuación al análisis posterior del material de archivo.
Las extremidades delanteras se anotan de cero a cuatro puntos. Las retracciones tónicas repetidas o sostenidas de una de las dos extremidades frontales, así como la hiperextensión combinada con el cruce de las extremidades delanteras se puntúen como distonía. Los movimientos similares a la distonía de las extremidades posteriores, lo que significa retracción y apretamiento, así como la hiperextensión sostenida, se anotan de cero a tres puntos.
Una distorsión truncal presente sobre el 80% del tiempo registrado se anota con un punto adicional. El cierre de las extremidades traseras es un signo inespecífico para el deterioro del motor y no debe puntuarse. Este gráfico muestra los resultados de la escala de clasificación de distonía.
Los ratones estresados con oabaína presentan movimientos significativamente más similares a la distonía durante un período observacional de 72 horas que el grupo no estresado de ouabain-pered, así como los animales del vehículo. Esta imagen representa los resultados de la prueba de suspensión de la cola y muestra un resultado similar a la escala de clasificación de distonía. Tenga en cuenta que los resultados de la media de la puntuación total de cada animal para cada punto de tiempo.
Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo implantar estereotácticamente múltiples cánulas cerebrales y cómo implantar por vía subcutánea bombas osmóticas. La principal ventaja de este método es que se pueden evitar inyecciones repetitivas y estresantes y que un sustrato como la ouabain, que de lo contrario tendría efectos secundarios en todo el sistema se puede entregar directamente a una estructura cerebral específica.
