O objetivo geral deste protocolo é descrever os procedimentos envolvidos no estabelecimento de um modelo de rato farmacológico sintomático para distonia DYT/PARK-ATP1A3 usando cânulas cerebrais em bombas osmóticas e induzindo o estresse através de tarefas motoras desafiadoras. Este método detalha como estabelecer um modelo de rato farmacológico usando a entrega crônica de drogas através de bombas osmóticas para múltiplas cânulas cerebrais e como induzir o fenótipo através de tarefas motoras desafiadoras. O leve paradigma do estresse motor também fornece insights sobre o papel das interações gene-ambientais em distúrbios de movimento, e pode ser aplicado a outros modelos de roedores.
Os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais e institucionais aplicáveis para o cuidado e o uso dos animais. Comece preparando as bombas osmóticas em um ambiente estéril. Primeiro, encha uma seringa de um mililitro com uma cânula de enchimento de 27 bitolas com solução de ouabain filtrada estéril ou solução de veículo.
Segure a bomba osmótica na posição vertical, insira a cânula até a bomba e encha lentamente o reservatório até que o excesso de solução apareça por cima. Em seguida, insira o moderador de fluxo na bomba. Retire cuidadosamente a flange branca do moderador de fluxo com uma tesoura e conecte um pedaço de tubo de vinil ao moderador de fluxo.
Submergir cada bomba em tubos Eppendorf preenchidos no meio do caminho com solução salina e colocá-las em um termociclador de 37 graus, a fim de garantir que a taxa de bombeamento atinja um estado estável antes do início da cirurgia. Depois que o animal for profundamente anestesiado de acordo com os protocolos aprovados, coloque o animal em um quadro estereotático e fixe a cabeça usando pontas de borracha ou barras de ouvido não rompidas. Após a desinfecção completa da área cirúrgica, use um bisturi para colocar incisão na parte superior da cabeça e use uma tesoura para continuar a incisão até os membros da frente.
Exponha o crânio com a ajuda de grampos de buldogue e limpe o periósteo com um aplicador de ponta de algodão estéril. Alinhe uma caneta ou a ponta de um cannular manchado em tinta preta com bregma e use as coordenadas apropriadas para marcar os três pontos de entrada para as cânulas cerebrais no crânio. Em seguida, faça cuidadosamente os furos para o cannular duplo designado para o gânglio basal e a única cânula designada para o cerebelo.
Faça um quarto furo para um pequeno parafuso entre o estriado e o cerebelo. Este parafuso será eventualmente incorporado em cimento dental e fornecerá um porão adicional para as cânulas. Para criar um pequeno bolso para a bomba osmótica de cada lado dos animais para trás, use fórceps teciduais para separar as camadas de tecido subcutânea.
Avance os fórceps em direção a uma perna traseira e abra ligeiramente os fórceps, a fim de ampliar o bolso subcutâneo. Repita o mesmo procedimento para o outro lado, primeiro removendo os fórceps da incisão e, em seguida, empurrando-os suavemente em direção à segunda perna traseira. Com a ajuda de fórceps, insira cuidadosamente as bombas e o cateter conectado em cada bolso subcutâneo.
O bolso deve permitir que a bomba deslize facilmente. Usando um mini suporte de bomba, introduza uma única cânula osmótica com um comprimento personalizado de 3,0 milímetros no orifício perfurado na linha média do cerebelo. Retire a cabeça da cânula cuidadosamente e conserte a cânula, bem como o pequeno parafuso com cimento dental, tomando cuidado para não cobrir a peça de conexão para o tubo da bomba osmótica.
Certifique-se de que o cimento dentista ao redor da cânula secou completamente antes de continuar com a cirurgia. Antes de inserir a cânula dupla nos orifícios bilaterais perfurados acima do gânglio basal, conecte duas peças de 0,5 centímetros de comprimento de tubo de vinil às duas peças de conexão da cânula dupla. Conecte as tubulações de vinil com um adaptador de bifurcação e preenchi cuidadosamente todo o sistema de tubulação com solução ouabain estéril ou veículo.
Em seguida, repita os mesmos passos mostrados anteriormente para a cânula única e final mediante fixação da cânula dupla com cimento dental. Conecte os cateteres das bombas osmóticas ao adaptador de bifurcação, bem como a uma única cânula, respectivamente. Ambas as bombas têm uma taxa de fluxo igual, por isso tenha cuidado para conectar a bomba osmótica com uma solução dupla concentrada ao adaptador de bifurcação para garantir que a mesma concentração atinja tanto o gânglio basal quanto o cerebelo.
Feche a incisão na parte de trás dos animais com pontos o mais longe possível sem esticar demais a pele. Injete subcutâneamente soro fisiológico estéril, que deve ter temperatura corporal para evitar a desidratação. Retire o animal do quadro estereotático e coloque-o na gaiola de recuperação.
A fim de induzir movimentos semelhantes à distonia, os camundongos com perfumados de ouabain devem ser expostos a tarefas motoras desafiadoras como um leve paradigma de estresse quatro horas após a cirurgia e repetidamente a cada 24 horas depois. Isso não inclui uma caracterização comportamental dos animais. Demonstramos aqui o exemplo de um animal perfumado de veículo, que é colocado em um poste de madeira de superfície áspera de 50 centímetros, nariz voltado para baixo.
Forneça roupas de cama suficientes na base do poste em caso de quedas. Para camundongos com ouabaina, os animais devem começar a apresentar os primeiros sintomas como a bradiquinia quatro horas após a cirurgia. No entanto, 24 horas após a cirurgia, você deve ver a hiperextensão involuntária dos membros dianteiros ou traseiros como um sinal de movimentos semelhantes à distonia durante a descida.
Os ratos devem descer o polo três vezes, permitir pelo menos dois minutos de recuperação entre cada descida. O tempo de descida não precisa ser medido. O teste do polo deve ser seguido por uma segunda tarefa motora, usando uma haste giratória.
Como feito para o teste de desempenho Rotarod, os camundongos ouabain e perfusados de veículos dos grupos de estresse são colocados na haste rotativa. A latência para cair não precisa ser medida. Como feito para o teste anterior, os ratos devem ser colocados na haste rotativa três vezes, permitindo dois minutos de recuperação entre as corridas.
A escala de classificação de distonia modificada pode ser usada para avaliar a frequência, gravidade e distribuição corporal dos movimentos semelhantes à distonia de camundongos. Os animais devem ser colocados em uma caixa de plástico ou madeira e os movimentos devem ser registrados por um período de tempo de quatro minutos. Os avaliadores devem ficar cegos para a atribuição do grupo.
Movimentos ou posturas que são considerados como distonia são a hiperextensão involuntária dos membros dianteiros, uma postura ampla, ou hiperextensão de membros traseiros, bem como a cifose. Se apenas uma parte do corpo for afetada, a distonia deve ser considerada focal. Se o tronco e pelo menos duas outras partes do corpo forem afetadas, a distonia deve ser considerada generalizada.
Um segundo sistema de pontuação recém-desenvolvido de zero a oito pontos, avalia a presença e a gravidade dos movimentos semelhantes à distonia durante um teste de suspensão de cauda. Para o teste, segure o mouse pela cauda perto de sua base por dois minutos. Recomenda-se gravar o teste de suspensão da cauda e atribuir uma pontuação à análise subsequente da filmagem.
Os membros da frente são marcados de zero a quatro pontos. Retrações tônicas repetidas ou sustentadas de um dos dois membros da frente, bem como a hiperextensão combinada com a travessia dos membros da frente são pontuadas como distonia. Movimentos semelhantes à distonia dos membros traseiros, o que significa retração e aperto, bem como hiperextensão sustentada, são pontuados de zero a três pontos.
Uma distorção truncal presente em mais de 80% do tempo registrado é pontuada com um ponto adicional. O aperto do membro traseiro é um sinal inespecífico para o comprometimento motor e não deve ser pontuado. Este gráfico mostra os resultados da escala de classificação da distonia.
Os camundongos estressados com ouabaina apresentam movimentos significativamente mais parecidos com a distonia durante um período observacional de 72 horas do que o grupo não-estressado ouabain-perfused, bem como os animais do veículo. Esta imagem mostra os resultados do teste de suspensão da cauda e mostra um resultado semelhante à escala de classificação da distonia. Observe que os resultados da média a partir da pontuação total de cada animal para cada ponto de tempo.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como implantar estereotaxicamente múltiplas cânulas cerebrais e como implantar subcutânea bombas osmóticas. A principal vantagem deste método é que injeções repetitivas e estressantes podem ser evitadas e que um substrato como a ouabaina, que de outra forma teria efeitos colaterais em todo o sistema, pode ser diretamente entregue a uma estrutura cerebral específica.
