인간 다능성 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오르가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역 염색에 의한 특성화

우리는 처음으로, 재현 가능하고 확장 가능한 생성을 위한 새로운 접근, 세노란lar Organoids에서 파생된 IPS 세포의 및 화학적 정의된 조건, 일회용 생물 반응기를 사용하여 제시합니다. 바이오 반응기를 파종하기 위한 세포를 얻으려면 인간 iPSC의 6개의 웰 플레이트에 세포 분리 배지 1밀리리터를 추가합니다. 접시를 섭씨 37도에서 7분간 배양하고, 부드러운 흔들림이 잘에서 세포를 쉽게 분리할 때까지 배양합니다.

P 1000 마이크로파이프를 사용하여 세포 분리 배지를 위아래로 피펫하여 세포가 단일 세포로 해리될 때까지 피펫합니다. 다음으로 각 웰에 완전한 세포 배양 배지의 2 밀리리터를 추가하여 효소 소화를 비활성화합니다. 그런 다음 파이펫을 사용하여 세포를 멸균 원문 튜브로 부드럽게 전달합니다.

3 분 동안 210 배 중력으로 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 배양 배지에서 세포 펠릿을 다시 중단한다. 혈전계와 트라이판 블루 염료를 사용하여 세포를 계산합니다.

밀리리터당 250, 000세포의 밀도로 iPSC의 생체 반응기 용기를 참조하십시오. 생체 반응기 선박을 유니버설 베이스 유닛에 넣고 섭씨 37도, 습도 95%, 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 넣습니다. iPSC 집계를 촉진하려면 기본 제어 장치의 교반 속도를 27 RPM으로 설정합니다.

첫날, 0일째는 생물반응기를 파종하는 날인 데, 생물반응기와 베이스 유닛을 멸균 유동 후드에 넣고, 혈청피펫을 사용하여 세포 현탁액의 1밀리리터 샘플을 수집합니다. 매우 낮은 부착, 24 웰 플레이트에 셀 서스펜션을 플레이트. 현미경을 사용하여 iPSC 파생 골체가 형성되어 있음을 확인합니다.

그렇다면, 40 X 또는 100 X.에서 응집물의 이미지를 캡처하여 iPSC와 생물 반응기를 계속 배양하고, 골재의 평균 직경이 100 마이크로미터까지, 배지의 80%를 암억제제 없이 신선한 MT01로 교체한다. 골재가 직경 200~250마이크로미터에 도달하면 모든 오르가노이드가 생체 반응기의 바닥에 정착한 다음 모든 소비된 매체를 gfCDM 분화 매체로 교체합니다. 기체와 생체 반응기를 인큐베이터에 배치하고 교반을 25 RPM으로 감소시다.

저장된 오르가노이드에서 상체를 제거 한 후 펠릿에 15 %의 자당 1 밀리리터를 넣고 부드럽게 소용돌이치면 잘 섞습니다. 하룻밤 동안 오르가노이드를 배양 한 후, 섭씨 4도에서 자당 용액을 제거 한 다음 15 % 자당, 7.5 %의 젤라틴1 밀리리터를 추가하고 부드럽게 소용돌이에 의해 빠르게 섞습니다. 오가노이드는 섭씨 37도에서 배양하는 동안 15% 자당 7.5%의 젤라틴 용액으로 플라스틱 용기를 반쯤 채우고 고화시킬 수 있습니다.

오르가노이드가 1 시간 동안 배양 한 후, 파스퇴르 파이펫을 사용하여 고화 된 자당과 젤라틴 위에 오르가노이드 자당 젤라틴 혼합물한 방울을 놓습니다. 드롭이 고화되기까지 15분을 기다린 후, 플라스틱 용기의 나머지 부분을 15% 더 많이 채우고 7.5%의 젤라틴을 사용하여 실온에서 완전히 고화한 다음 섭씨 4도에서 20분 동안 배양할 수 있습니다. 중앙에 오르가노이드가 있는 큐브를 큐브로 자르고, 큐브를 100억 파운드한 방울로 골판지에 고정한 다음, 500밀리리터 컵에 이스펜타네 250 밀리리터를 넣고 액체 질소로 적절한 용기를 채웁니다.

집게와 두꺼운 장갑을 사용하여 액체 질소 표면에 이스펜탄 컵을 조심스럽게 놓습니다. 이스펜탄과 액체 질소는 유해 시약입니다. 이 두 시약을 사용하려면 두꺼운 장갑과 적절한 환기를 포함한 개인 보호 장비가 필요합니다.

이스토펜탄이 음수 섭씨 80도까지 냉각되면 젤라틴 큐브를 이스토탄에 놓아 얼때까지 놓습니다. 잘 냉동 된 큐브는 가볍게 집게로 도청 할 때 금속 사운드를 생성하여 저장할 준비가되었음을 나타냅니다. 50 밀리리터 1X PBS를 5분 동안 아구노이드 섹션으로 담은 현미경 슬라이드를 세척한 다음 슬라이드를 신선한 1X PBS를 포함하는 코플린 항아리로 옮겨냅니다.

새로 준비된 글리신 50밀리리터를 함유한 코플린 항아리로 슬라이드를 옮기고 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 다음 슬라이드를 0.1%트리톤의 50밀리리터를 함유한 코플린 항아리로 옮기고 실온에서 10분 동안 투과를 처리합니다. 슬라이드를 1X PBS로 두 번 세척하여 매번 5분간 세척합니다. 1X PBS에 담근 3mm 종이로 면역 염색 접시를 준비합니다.

슬라이스 주위에 티슈로 슬라이드를 건조하고 3 밀리미터 종이에 놓습니다. 파스퇴르 파이펫을 사용하면 각 슬라이드를 블로킹 용액 0.5 밀리리터로 덮습니다. 실온에서 30분 동안 배양한 후, 과도한 차단 용액을 제거하고 슬라이스 주변의 조직으로 슬라이드를 운전하십시오.

희석 된 1 차 항체 50 마이크로 리터를 각 슬라이드에 놓고 덮개 전표로 덮습니다. 슬라이드를 레이스, 이전에 준비 된 면역 염색 접시에, 4 섭씨에서 그들을 배양. 하룻밤 동안 잠복 한 후, 코플린 항아리에 슬라이드를 전송, 와 50 TBST의 밀리리터, 커버 슬립을 떠나시키는, 다음 TBST와 함께 슬라이드를 세 번 세척, 5 시간 마다.

각 슬라이드에 희석 된 이차 항체 50 마이크로 리터를 놓고 커버 슬립으로 덮습니다. 슬라이드를 이전에 준비된 면역 스테인딩 접시에 놓고, 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 배양합니다. 슬라이드를 코플린 항아리로 다시 옮기고 TBST 50 밀리리터로 매번 5분 간 세 번 씻습니다.

파스퇴르 파이펫을 사용하여 0.5 밀리리터의 dappy 용액을 각 슬라이드의 전체 표면에 걸쳐 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 생물 반응기에서 24 시간 후, iPSC의 효율적으로 형성 스페로이드 모양의 골재. 형태는 5일째까지 잘 유지되었고, 점차 크기가 증가했습니다.

동질성의 높은 수준을 시연. 현미경 검사법에 의한 정량적 분석은 또한 정상 분포, 1일별 집계 크기, 두 세포주 모두 둘째 날까지 최적의 골재 크기를 달성했다. 원하는 골체 직경이 달성된 후, 신경 약정이 유도되었고, 그 후 다른 소뇌 선조의 생성이 촉진되었다.

분화 오르가노이드 동안, 발광 공간을 가진 신경관 같이 구조물과 유사한 더 뚜렷한 상피화를 보여주었습니다. 또한, 오르가노이드 직경 분포는 14일째까지 초기 소뇌 약정 중에 균질했다. 면역형광분석은 iPSC 유래 오르가노이드의 효율적인 신경 약념이 이미 7일째까지 달성되고 있음을 뒷받침한다.

면역 염색은 또한 소뇌 유기체의 능률적인 소뇌 약정 및 능률적인 성숙을 보여주었습니다. 더욱이, 생물 반응기에서 80 일 후에, 유기체의 살아있는 죽은 염색은 높은 세포 생존력을 보여주었고, 괴사 영역의 아무 기록도 보여주지 않았습니다. 이 기술은 병리학적 경로를 연구하기 위한 중요한 도구를 나타내며, 신약의 치료 효과를 평가하고 관찰된 소뇌의 변성에 관여합니다.