이 프로토콜은 기본 연구를 위한 프로브 또는 잠재적인 임상 화합물을 위한 조사로 ATPase 억제제 개발을 목표로 하는 광범위한 선별 프로젝트에 적용됩니다. 이 방법은 반 고처리량 스크리닝 애플리케이션에 최적화되어 있습니다. 또한 여러 가지 일반적인 유물을 피하도록 설계되었으며 유해 물질 취급이 필요하지 않습니다.
우리의 실험실에서 우리는 메담페타민 사용 장애의 치료를위한 새롭고 특정 비 근육 myosin II 억제제를 개발하기 위해이 분석체를 사용하고있다. 이론적으로, 이 방법은 ATP를 생성하는 모든 효소에 쉽게 적용될 수 있다. 시각적 데모는 모든 중요한 기술적 세부 사항을 명확히 하는 데 도움이 됩니다.
먼저 액틴 버퍼에 농축액틴 스톡 용액을 희석시킴으로써 각각 384웰 블랙 폴리스티렌 마이크로플레이트에 대해 20마이크로몰라 희석 액틴 액틴 용액4, 500 마이크로리터를 준비한다. 점도와 이질성을 줄이기 위한 액틴 필라멘트를 깨기 위해 30회 위아래로 파이프를 사용하여 솔루션을 철저히 섞습니다. 그런 다음 면소한 단백질을 제거하기 위한 용액을 원심분리합니다.
상체를 깨끗한 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮기십시오. 골격 근 근 근 II, 171.4 마이크로리터 및 PK 용액의 171.4 마이크로리터를 포함하는 분석법에 대한 미산 완충제의 3, 252.9 마이크로리터를 결합하여 각 분석 플레이트에 대한 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브에 마스터 효소 믹스를 준비한다. ATP 162.1 마이크로리터, PEP 162.1 마이크로리터, NADH 용액324.1 마이크로리터를 결합하여 각 플레이트에 대해 15밀리리터 원심분리기 튜브에 마스터 기판 믹스를 준비한다.
집계 및 침전을 피하기 위해 이 시점에서 액틴을 추가하지 마십시오. 교정을 위해 NADH의 7단계 직렬 1대2 희석제를 만들려면 8개의 1.5밀리리터 미세원심분리관을 준비하십시오. NADH 스톡 용액 12.3 마이크로리터를 첫 번째 튜브에 미오신 버퍼 257.7 마이크로리터와 혼합하여 250 마이크로몰라 용액을 만듭니다.
그런 다음 미오신 버퍼135마이크로리터를 나머지 7개의 튜브에 각각 넣습니다. 제1 튜브에서 두 번째로 용액의 135 마이크로리터를 옮기고 파이펫팅하여 혼합합니다. 일곱 번째 튜브에 도달할 때까지 반복합니다.
마지막 튜브를 버퍼만 사용하여 NADH 컨트롤이 없는 경우 를 사용합니다. 항상 화합물 플레이트에 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 포함하고, 분석 플레이트에 교정을 위한 NADH 희석제. 이러한 컨트롤은 데이터 분석 중에 아티팩트를 식별하는 데 매우 중요합니다.
8채널 파이펫을 사용하여 NADH 교정 솔루션의 20마이크로리터를 분석 플레이트의 첫 번째 행으로 옮킨다. 이제 효소 믹스에 골격 근 미오신 II의 4.2 마이크로 리터를 추가합니다. 소용돌이가 짧게.
분배 하기 직전에 효소 믹스에 myosin를 추가 합니다. 희석된 myosin 솔루션의 긴 잠복은 침수로 인한 활동 손실, 플라스틱 표면에 대한 비특이적 결합을 초래할 수 있습니다. 준비된 미오신 효소 믹스를 자동 디스펜서의 샘플 용기 중 하나에 적재합니다.
플레이트에서, 첫 번째 행을 제외하고, 미오신 효소의 8.4 마이크로리터를 분석 플레이트의 각 웰에 분배한다. 그런 다음 분석 플레이트와 복합 플레이트를 100 나노리터 핀 공구 헤드가 장착된 자동화된 액체 처리 시스템의 실험실웨어 포지셔너에 놓습니다. 그런 다음 소프트웨어에서 100 나노리터의 용액을 제조된 화합물 플레이트에서 분석 플레이트로 전송하는 적절한 방법을 실행한다.
다음으로, 마이크로 플레이트 셰이커에 분석 판을 놓고 실온에서 1 분 동안 흔들어 1, 200 rpm. 기판 혼합 및 소용돌이에 원심 분리 액틴 용액의 4, 052 마이크로리터를 간략하게 추가합니다. 효소 반응을 시작하려면, 첫 번째 행을 제외하고, 자동 디스펜서를 사용하여 분석 플레이트의 각 웰에 액틴 기판 믹스의 11.6 마이크로리터를 분배한다.
마이크로 플레이트 셰이커에서 1, 200 rpm에서 실온에서 1 분 동안 분석 판을 흔들어보십시오. 분석 플레이트를 101배 g에서 30초 동안 원심분리합니다. 380나노미터, 10나노미터 대역 폭 발산 필터, 470나노미터 대역 폭 방출 필터, 24나노미터 대역 폭 방출 필터를 425나노미터 컷오프 이차성 거울과 함께 사용한다.
에세이를 실행하기 전에 깜박임, 검출기 게인, 플레이트 치수 및 측정 높이수를 최적화합니다. 고농도 모드에서 측정을 실행합니다. 플레이트 판독기의 내온이 섭씨 25도에서 안정되었는지 확인하십시오.
플레이트 판독기에 플레이트를 적재하고 30초 동안 흔들어 액체 표면의 모양을 각 우물에서 유사하게 만들고 플레이트가 측정 온도에 도달할 수 있도록 합니다. 45초 간격으로 플레이트를 스캔하고 NADH 형광을 30분 동안 기록합니다. 내보낸 데이터를 사용하여 각 웰에 대해 시간에 대해 관찰된 형광 강도를 플롯합니다.
간단한 선형 회귀를 수행하여 각 웰에 대한 형광 반응의 경사 및 가로채기를 결정합니다. 경사는 ATP 소비속도의 근사치로 사용될 수 있는 NADH 소비속도에 비례한다. 요격은 측정 의 시작 부분에 NADH 농도에 비례한다.
이어서, NADH의 농도에 대하여 플레이트의 첫 번째 행에 대해 얻어진 요격을 플로팅하여 NADH에 대한 교정 곡선을 구성한다. 요격은 처음에 읽는 원시 형광 강도의 평균보다 훨씬 더 자신감으로 처음에 실제 형광 강도를 추정합니다. 간단한 선형 회귀를 수행하여 NADH 교정 선의 경사 및 가로채기를 가져옵니다.
여기서, 차단은 NADH가 없는 형광 배경 신호를 설명하고, 경사는 하나의 어금음 NADH 용액의 추정된 이론형 형광 강도에 해당한다. 형광 변화를 ATP 소비속도로 변환하기 위해 NADH 교정 라인의 경사에 의해 나머지 우물에 대해 얻어진 형광 반응의 경사를 나눕니다. 다음으로, 억제제의 농도에 대해 ATP 소비속도를 플롯한다.
억제 상수를 확인하려면 Origin 2017과 같이 비선형 곡선 피팅이 가능한 적절한 통계 소프트웨어를 사용하십시오. 간단한 일대일 결합 평형 모델에 대응하는 이차 방정식에 용량 반응 데이터에 맞게 비선형 곡선 을 선택합니다. Y는 ATP 소비율입니다.
Y-최소는 억제제가 없는 경우 ATP 소비율이다. Y-최대는 이론ATP 소비율 100%억제이다. t 와 t는 각각 미신 효소 및 억제제의 총 농도이다.
KI는 억제 상수입니다. 이 연구에서는, 골격 및 심장 근육 myosin II ATPase 반응은 사용된 미오신 또는 억제제의 존재에 관계없이 선형 형광 강도 의 흔적을 보였다. 기저 및 액틴 활성화 ATPase 속도는 골격 또는 심장 근육 myosin II.A 스크리닝 윈도우 계수 또는 0.78의 Z 계수의 농도에 선형 의존성을 보였다 매우 잘 분리 된 긍정적이고 부정적인 제어와 신뢰할 수있는 분석법을 나타냈다.
Blebbistatin, 파라 아미노블비스타틴, 그리고 파라 니트로블비스타틴은 보고된 용해도 값 이하의 정기적인 투여량 반응 곡선을 보였습니다. 심장 및 골격 근 근 근 모두에 대한 억제 상수는 데이터에 간단한 평형 결합 모델을 나타내는 이차 방정식을 피팅하여 결정되었다. 골격 근 근 근 II를 사용 하 여 ATPase 분석에서 얻은 blebbistatin에 대 한 형광 강도 추적 존재 억제제의 양에 따라 정상적인 선형 감소 신호를 보였다.
그러나, 블리스타틴의 용해도 이상으로 신호의 예기치 않은 증가가 밝은 플로레스센트 블비스타틴 결정의 형성으로 인해 가장 가능성이 높은 것으로 관찰되었다. 정상적인 생 형광 강도 추적을 가진 파라-니트로블비스타틴의 경우, 강수량으로 인해 결정된 투여량 반응 곡선으로부터 용해도 이상으로 얻어진 반응 속도가 발산된다. 이 방법을 사용하여, 우리는 기본 연구에서 과학 도구로 또는 미래에 직접 후보로 사용될 수있는 새로운, 강력하고 선택적 myosin 억제제를 개발했다.
그것은 항상 다른 ATPase 또는 실제와 거짓 긍정적인 안타를 구별 하는 관심의 효소에 특정 다른 기능 적인 분석 사용 하는 것이 좋습니다. 모든 단백질은 플라스틱 표면을 결합합니다. 이 문제는 특히 단백질이 낮은 농도에서 존재하는 경우에 결과에 크게 영향을 미칠 수 있습니다.
항상 불필요한 액체 처리를 피하고 구속력이 없는 튜브를 사용하십시오. 대체 ATPase 어약은 일반적으로 황산, 독성 물질 또는 방사성 물질의 취급이 필요합니다. 대조적으로, NADH 연결 ATPase 분석법은 독성이 없거나 매우 낮은 시약을 필요로합니다.
