이 작품은 몬트리올 대학교에서 제공하는 머크 Frosst 시동 기금에 의해 지원되었다. 우리는 그들의 토론, 의견과 피드백을위한 면역학 및 암 연구를위한 연구소의 높은 처리량 플랫폼에서 박사 진 Duchaine와 도미닉 Salois에게 감사의 말씀을 전합니다. Moutih Rafei는 퐁 드 라 공들인 엉 상테 뒤 퀘벡 주니어 1 상을 보유하고있다.

모든 동물 프로토콜은 몬트리올 대학교의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다. 마우스가 더 활력 징후는 자궁 경부 전위 다음에하지 관찰 될 때까지 CO 2의 점진적 흡입에 의해 안락사시켰다. 절차는 동물이 인도적인 방법으로 안락사와 동물 관리에 캐나다위원회의 권고에 따라되었는지 확인하기 위해 인증 된 사람에 의해 수행되었다. 비장 매체와 흐름 - 세포 계측법 버퍼 1. 준비 <ol><li> 70 % 에탄올 세정 생물 후드 아래의 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 미리 예열 로스웰 파크 메모리얼 연구소의 70 ㎖ (RPMI) 멸균 튜브 (시판 여과 500ml의 볼륨 살균 병 제공) 및 장소 1640 1X 매체를 제거합니다. 제거 된 매체는 프로토콜의 뒷부분에 사용됩니다. </li><li> 50ml의 비활성화 소 태아 혈청 (FBS) 5 ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신 5 RPMI 나머지 430 mL의 1640 1X 보충용액 HEPES, 5 ㎖의 비 필수 아미노산, 5 ㎖ 피루브산 나트륨, 여과 0.05 ㎖ (1M) 2- 머 캅토 에탄올. 주 : 열 충격을 피하기 위해 세포를 37 ºC로 설정 한 수욕을 사용 전 따뜻한 비장 매체. 이 세포 사멸 유도를 방지하는 것이 중요하다. </li><li> , 유동 세포 계측법 버퍼를 준비하는 98 ml의 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에 FBS의 2 mL를 넣어 사용까지 (바람직하게는 내 삼일) 냉장 보관합니다. </li></ol> Nur77 GFP 마우스 비장의 비장 세포 현탁액의 2 세대 <ol><li> A는 septically 6 ~ 8 주 된 여성 Nur77 GFP 마우스에서 비장을 격리 할 것. <ol><li> 이를 달성하기 위해, 무균 후드하에 작동한다. 70 % 에탄올에 희생 마우스 모피, 가위와 집게를 만끽 해보세요. </li><li> 그 오른쪽에 마우스를 놓고 왼쪽 상단 복부 사분면의 피부와 근육을 잘라. 눈에 띄게 후 비장을 찾아 그것을 잘라하는 절개 영역을 검사합니다. 비장 유지전까지 얼음 비장 세포 배지에서 다음 단계를 수행한다. </li></ol></li><li> 예열 된 비장 세포 배지 5ml를 함유하는 10cm이 세포 배양 용 배양 접시에 비장 (들)을 놓는다. </li><li> 용액이 혼탁해질 때까지 멸균 주사기의 플런저를 사용하여 비장을 매쉬. 비장 콜라겐 매트릭스 절차의 종료에 의해 유지한다. </li><li> 비장 매체의 광범위한 숙성 후, 세포 현탁액을 수집하고 필터링 아웃하는 이물질이나 혈전을 50 mL의 관에 배치 된 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. </li><li> 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. 상청액을 폐기 한 후 자체 제작 또는 상업적 적혈구 용해 완충액 2-3 ㎖의 세포 펠렛을 다시 일시. 다음 피펫 (2-3 시간) 20 ~ 30 초 동안 정지 휴식을 할 수 있습니다. </li><li> g 다음 X 500에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리기 5 PBS의 용액 또는 선택의 적절한 버퍼를 추가합니다. </li><li> 붉은 색이어야한다 (상층 액을 제거 빨간색 B를 용해 포함로들 (100d) 세포) 및 재 정지 비장 세포 배지 2 ㎖의 세포 펠릿. </li><li> 혈구를 사용하여 라이브와 죽은 (괴사) 세포를 구분하는 트리 판 블루로 염색 된 세포의 수를 계산합니다. </li></ol> 비장 세포 현탁액 3. T 세포 분리 <ol><li> g X 500에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리기. 10 × 106 세포 / ㎖의 세포 농도를 얻기 위해, 무 혈청 RPMI 배지에서 세포 (단계 1.3 내지 50 ml)에 다시 대기. </li><li> 5 mL의 폴리스티렌 튜브에 세포 이동 및 정제 공정의 마지막에 별도로 순도 평가 / 비교 비장의 100 μL 분취를 설정한다. </li><li> T 세포 격리 항체 칵테일 (50 μL / mL)에 이어 50 μL / mL로의 세포 현탁액에 정상 쥐의 혈청을 추가합니다. </li><li> 세포 현탁액을 혼합하고 10 분 동안 휴식을 할 수 있습니다. 이 단계는 항체 칵테일 모든 원치 않는 세포를 결합 할 수 있습니다. </li><li> 스트렙 타비 딘 빠른 분야 추가 (자석2.5 분 동안 IC 비드) 다음 무 혈청 배지를 사용하여 2.5 mL의 부피를 가져온다. </li><li> 3 분에 대한 세포 분리 자석에 튜브를 놓습니다. </li><li> 자석을 잡고 하나의 움직임에 용액을 주입하여 새로운 폴리스티렌 튜브에 T 세포 현탁액을 전송합니다. 참고 : 격리 된 서스펜션은 정제 된 T 세포가 포함되어 있습니다. 모든 원하지 않는 세포는 자기 스트렙 타비 딘 비드에 결합 튜브 측에 유지된다. </li><li> 트립 판 블루 및 혈구를 사용하여 격리 된 T 세포를 카운트. 주 :이 단계에서 분리 된 T 세포의 순도 전에 유동 세포 계측법에 의한 T 세포의 분리 후 CD3 + 사건의 비율을 분석함으로써 (선택 사항) 검증 될 수있다. (13) <ol><li> 간단히, 원심 분리기 500 X g에서 비장 세포 현탁액 1 ㎖. 상층 액을 제거하고 1 × 106 세포 / ㎖의 농도로 유동 세포 계측법 버퍼 셀을 정지. </li><li> 형광 표지 된 항 MOUS 추가100 : 1의 농도로 전자 CD3 항체. 30 분 동안 4 ° C에서 품어. 한 번 세척, 원심 분리기 및 유동 세포 계측법에 의한 분석에 대한 흐름 세포 계측법 버퍼 (400 μL)에 다시 일시 중지합니다. </li></ol></li></ol> 비장 세포 현탁액 4. B 세포 분리 <ol><li> T 세포 (3.1-3.8 단계) 그러나 B 세포 분리 키트를 사용하여 설명한 것과 동일한 프로토콜을 따른다. 순도 평가를 들어, 대신 CD3 항체의 CD19 항체를 사용합니다. (13) <ol><li> (선택 사항) 순도 평가를 들어, CD3 항체 대신 CD19 항체를 사용합니다. 500 X g에서 비장 세포 현탁액의 원심 분리기 1 mL를. 상층 액을 제거하고 1 × 106 세포 / ml의 농도로 유동 세포 계측법 버퍼 셀을 정지. </li><li> 추가 형광등 (1)의 농도로 항 - 마우스 CD19 항체에 태그 : 100, 30 분 동안 4 ℃에서 배양한다. 한 번 세척, 원심 분리기 및 유동 세포 계측법 버퍼 (400 μL) FO에서 다시 일시 중지유동 세포 계측법에 의해 연구 분석. </li></ol></li></ol> 5. T 세포 활성화 및 GFP 발현의 유도 <ol><li> / 웰 2.5 × 105 세포의 농도로, 둥근 바닥 96 웰 플레이트에, 서스펜션에서, T 세포를 시드. </li><li> 2 NG / mL의 CD3 / CD28 자석 구슬 (25 μL / 10 6 세포)에서 재조합 인터루킨 (IL)를 -7 추가합니다. 비 - 활성화 T 세포를 나타내는 이상 측정을위한 대조군으로 사용할 구슬 미처리 T 세포의 일부를 유지한다. </li><li> 12 시간 후, 부드럽게 각 세포 현탁액을 피펫 아니라 상하 어느 비드 세포 복합체 / 집계 침입하여 96- 웰 플레이트에서 T 세포를 수확. 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 모든 우물에서 정지를 수집합니다. </li><li> T 또는 B 세포의 정제를 위해 이전에 사용 된 동일한 세포 격리 자석 내부의 현탁액을 함유하는 튜브를 배치하고 5 분 동안 휴식을 허용한다. </li><li> T 세포 현탁액 INT 전송자석을 잡고 하나의 움직임에 용액을 주입하여 OA 새로운 폴리스티렌 튜브. </li><li> 5 분 동안 500 XG에 세포를 원심 분리기. 다시 중단 2 × 106 세포 / ml의 농도를 얻기 위해 새로운 비장 세포 배지에서 세포. </li><li> 비 - 활성화 T 세포와 비교하여 12 내지 24 시간 이후에 자극 (품질 관리 옵션) 유동 세포 계측법에 의한 GFP 발현 강도를 평가한다. (12) 주 : GFP 형광이 Nur77 GFP T 세포에 내재하고 TCR의 성공적인 활성화시에 발현된다. (12) </li><li> 현미경으로 생존 및 활성화 (선택 사항)의 평가를 들어, 0.2 μg의 / ㎖의 농도로 훽스트 30 분 전에 분석과 활성화 된 세포를 얼룩. 커버 슬라이드 또는 평저 블랙 양면 384- 웰 플레이트의 웰에 세포 현탁액의 적절한 양을 첨가하고 살아있는 세포를 평가하기 위해 형광 현미경으로 조사한다. 죽은 세포는 핵을 보유하지 않습니다더럽히는 것. (14) </li></ol> 6. B 세포 활성화 및 GFP 발현의 유도 <ol><li> 은 T-25 배양 플라스크를 사용하여, 1 × 106 세포 / ㎖에서 단리 된 B 세포를 다시 일시. </li><li> 200 NG / ml의 농도에서 10 μL / mL의에서 항 - 마우스 IgG / IgM의 (H + 1) 및 재조합 CD40L를 추가합니다. (비 - 활성화 된 B 세포를 나타냄) 후에 측정 대조군 역할을 미처리 상기 B 세포의 일부를 유지한다. </li><li> 비 - 활성화 된 B 세포와 비교하여 12 또는 24 시간 후 자극의 유동 세포 계측법에 의한 GFP 발현 강도를 평가한다. 참고 : GFP의 형광이 Nur77 GFP B 세포에 내재하고 BCR의 성공적인 활성화에 명시되어있다. (12) </li><li> 현미경으로 생존 및 활성화 (선택 사항)의 평가를 들어, 0.2 μg의 / ㎖의 농도로 훽스트 30 분 전에 분석과 활성화 된 세포를 얼룩. 세포 현탁액의에 적절한 볼륨을 추가형광 현미경 커버 슬라이드 또는 평면 바닥 검은 색면 384 웰 플레이트의 우물에와 검사는 살아있는 세포를 평가합니다. 죽은 세포는 핵 염색을 유지하지 않습니다. (14) </li></ol> 작은 분자 7. 높은 처리량 검열 <ol><li> 2 × 10 6 세포 / 활성화 된 T 또는 B 세포의 ㎖ (자석 구슬 또는 항체 / CD40L) 또는 비 활성화 그룹에서 세포 현탁액을 준비합니다. </li><li> 플레이트 75,000 세포 / 웰의 384 웰 플레이트 (40 μL 볼륨). 평평한 바닥 검은 색면 384 웰 플레이트 또는 훽스트 얼룩을 사용하여 형광 현미경 (이전 HTS에 대한 선택적 품질 관리 단계)에 의해 생존 및 활성화 평가를위한 현미경 커버 슬라이드를 사용하여 (단계 5.8 및 자세한 내용은 6.4 참조). (14) </li><li> 수동 또는 자동화 된 시스템을 사용하여, 잘 각각 (0.5 % DMSO에 용해) 선택의 약물을 추가 할 수 있습니다. </li><li> (활성화) 양성 및 음성 (비 ACTI에 차량 (DMSO)를 추가비활) 제어 우물. 0.5 %의 최대 DMSO 농도를 조정한다. </li><li> 24 시간 (또는 배양 선택의 시간) 37 ºC에서 5 % CO 2의 접시를 품어. </li><li> (. 1 : 3333; 예를 들어, 50 μL에 총 부피를 생성하기 위해 384- 웰 플레이트에서 세포에 10 μL를 추가) 스크리닝의 날, 훽스트 33342 염색 액을 희석한다. 0.2 μg의 / ml의 농도를 달성하기 훽스트 용액을 첨가하여 GFP 분석 전에 30 분 얼룩. </li><li> 부드럽게 웰 각각에서 균일 한 분포를 얻기 위해 상하 세포를 피펫. 주 :이 단계는 세포의 반대 흐름 방향으로 상기 웰의 일측에 축적되는 경향으로 자동화 된 시스템을 사용하여 약물 (단계 7.3)를 송출하는 경우에 중요하다. </li><li> 실온에서 3 분 동안 45 XG에 플레이트 스핀. </li><li> 실온에서 15 분 동안 나머지 판을 떠난다. </li><li> 자동화 된 공 초점 높은 콘텐츠 scre를 사용하여, 플레이트 (들) 읽기 아웃을 수행, 체결 (HCS) 시스템. (15) 기계에 플레이트를 넣습니다. 40X 이상 배율로 목표를 설정합니다. 훽스트 (UV 램프) 및 GFP를위한 카메라 # 1 (레이저 488)에 대한 카메라 # 4를 사용합니다. 물론 당 6-10 필드를 읽을 수있는 기계를 설정합니다. 488 nm의 (GFP를 읽을) 및 자외선 (훽스트을 읽을)에서 필드 당이 순차적으로 판독을 수행하는 기계를 조정합니다. 40X 이상 배율로 목표를 설정합니다. 주 : 시스템이 조정을 필요로하지 않는 컴퓨터 현미경입니다. 초점 거리, 입사광의 강도와 노출 시간은 시스템에 의해 자동으로 모두 설치된다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

여러 판독 방법은 민감하고 안정적인 HTS 분석의 개발에 이용되고있다. 이러한 색채, 발광 또는 형광 방법을 포함한다. 비색 방법은 설정이 간단하지만, 그들은 방해하거나 세포가 테스트되고 중단시킬 수있는 화학 물질의 다수의 추가가 필요합니다. 약리 효과는 특정 포인트에서 평가 된 바와 같이 (23) 또한, 이들은 생물학적 반응의 동적 평가를 허용하지 않는다. 자동화 된 HTS ?...

높은 처리량 스크리닝 (HTS)을 널리 새로운 치료 분자의 식별을 위해 또는 새로운 의료 적응증에 FDA 승인 약물의 재배치 채택 입증 된 전략이다. 하나는 지금까지 달성 HTS 성공은 이전에 발견 된 약물의 과다에 의해 측정 될 수있다. 예를 들어, 티로신 키나제 억제제 라파티닙 유방암, 시타 글 립틴의 치료에 사용; 디펩 티딜 펩 티다 제 -4 (DPP-4) 억제제 항 혈당 약물로 사용하고, 만성 골수성 백혈병의 치료에 사용되는 경구 체 Bcr-Abl의 티로신 키나제 억제제 프라이 셀은 원래 발견 승인 된 약물의 긴리스트의 몇 가지 예를 나타내는 HTS. 제약 업계의 생산성 최근 새로운 화학 실체의 발견의 부족으로 고생하고 있지만 2 성공적인 약물 발견 가능성은 전임상 칸디다 수의 증가를 통해 향상시킬 수있다조절 성 생물 / 생화학 적 특성을 표시 TES. 따라서, 표현형 선별하도록 새로운 HTS 분석법의 개발은 신약 히트 발견 중요한 약리학 적 도구를 제공 할 수있는 가능성을 제공 할 수있다. 3, 4, 5, 6 더욱이, HTS 해주기 때문에 주문 설계된가요 로봇 설비, 신규 한 판독 기술 광범위한 소형화 포함한 최근의 상당한 기술적 변형으로 빠른 속도로 수행 될 수있다. 표현형 검사 (일명 앞으로 약리학)의 사용에 대한 관심이 증가에 기여하는 요인 중 2, 7은 기능적인 효과보다는 분자 표적 (목표 기반 검사 / 생화학 반응)에 대해 과도하게 단순화 환원 가정에 집중하는 것이 더 가능성이 있다는 인식이다 SHO하기<html> w 임상 효능. 따라서, 표현형 검사는 새로운 잠재적 치료 화합물 및 현재 치료가 질병의 분자 경로를 발견 할 수있는 약속을 보유하고있다. 이 제대로 주어진 분자 대상 또는 세포 기능에 대한 억제제 또는 활성제를 확인하려면, 매우 민감하고 신뢰할 수있는 분석은 선의의 히트와 오탐 (false positive)을 구별하기 위해 필요합니다. 그럼, 좋은 분석한다? 주어진 분석의 질은 제 (a 인자 Z를 통해 반사 된) 신호 대 잡음비에 의해 판단되어야한다. 여덟 번째로, 타겟 효과 나 화면의 목적은 명확 확립되어야한다. 특이 적으로 결합하는 리간드 - 수용체를 평가하도록 설계된 분석 반대로 예를 들면, 기능성 세포 기반 접근법 수용체 스크리닝 상당한 이점을 제공 할 수있다. 그 이유는 후자의 방법은 작용제 및 길항제 리간드를 구별 할 수 없다는 것이다.SS = &quot;외부 참조&quot;대조적&gt; 9 세포 - 기반 접근법은 수용체 기능 직접 생물학적 표현형에서 평가 될 수있는 더욱 효과적인 것으로 보인다 (증식, 세포주기 억류, 아폽토시스 및 / 또는 분화). 그러나, 그들 특정 대상 세포 침해 생화학 분석법 표현형 분석에 비해 상당한 이점을 제공 할 수 있음에 유의해야한다. 이후 행동의 약물 분자 메커니즘에 관한 조사를 단순화 잘 최적화 된 생화학 적 분석은 일반적으로 표현형 검사보다 적은 데이터 분산을해야합니다. 그러나, 타겟 기반 또는 생화학 적 분석의 주요 단점은 생물학적 시스템 (원래 생화학 적 분석에서 연구 된 특이성을 손실)에서 시험 할 때 비특이적 목표에 영향을 미칠 수있는 거짓 양성 히트의 속도를 증폭의 가능성이다. (10) 음성 및 양성 사이에 히트 노포 컷오프 포인트 위양성의 수를 최소화 할 수 있지만 난N 차 스크리닝은 이러한 손상 세포, 조직 전체의 전부 또는 동물로 네이티브 셀룰러 환경을 흉내 낸 생리 관련 시스템의 사용은 분석의 디자인 진자의 코어 남아있다. 따라서, 표현형 검사는 화합물의 활동이나 행동의 모드에 대한 사전 지식없이 어떤 확인 된 약물 표적과 질병에 대한 바람직한 / 생물학적 표현형 효과를 리드 발견 할 수 있습니다. (11) 시판되는 마우스 모델, 화학적 화합물의 클러스터 서브 가족 : 본원의 연구는 두 가지 중요한 구성 요소를 기반으로 최적의 재현성 표현형 선별 개발 및 테스트에 관한 것이다. 동물 모델에 대하여, 상기 분석은 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현 번째로 구동되는 마우스 스트레인 (Nur77 GFP) 카세트를 함유하는 세균 인공 염색체를 보유하는 유래의 림프구의 사용에 의존전자 Nur77 프로모터. (12)이 자극의 특징은 Nur77는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 B 세포 수용체 (BCR) 자극 다음 상향 조절 즉각적인 초기 유전자라는 사실에 기초한다. 스크리닝 방법 자체로서 12 접근법은 큰 화학 라이브러리 (&gt; 105 화합물)를 평가하는 데 필요한 시간을 최소화하면서 사소한 동족체의 선별을 방지하는 데 도움이되었다. 이를 위해 가상 스크리닝 도구를 사용하여 의약 화학자에 의해 선택된 화학적 화합물의 데이터베이스를 참조로 알려진 활성 종 구조를 사용하여 토폴로지와 유사한 화합물을 식별하는 데 이용 하였다. 이러한 접근 방식은 우리가 136,000 이상의 화학 실체의 전체 라이브러리를 나타내는 4398 화합물을 스크리닝 할 수있었습니다.

<table><tbody><tr><td>Nur77&lt;sup&gt;GFP&lt;/sup&gt; mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Mouse strain No. 016617</td><td>An in house colony was established at our animal facility&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>96 wells-U culture plates, sterile</td><td>VWR International</td><td>10062-902</td><td>T-cell activation using the magnetic beads</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cell strainer, sterile</td><td>Corning Inc.</td><td>352350</td><td>Generation of splenocytes cell suspension</td></tr><tr><td>5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile</td><td>Corning Inc.</td><td>352058</td><td>Generation of splenocytes cell suspension</td></tr><tr><td>50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile</td><td>VWR International</td><td>89039-656&amp;nbsp;</td><td>Generation of splenocytes cell suspension</td></tr><tr><td>10 ml syringe without needle, sterile</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305482</td><td>To mash the spleen</td></tr><tr><td>T-25 culture flask</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690 175</td><td>To incudabte B cells during activation</td></tr><tr><td>5 ml cell culture dish, sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627 160</td><td>To mash the spleen</td></tr><tr><td>Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>WISENT Inc.</td><td>450-200-EL&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Component of the splenocyte media</td></tr><tr><td>RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine</td><td>WISENT Inc.</td><td>350-002-CL&amp;nbsp;</td><td>Component of the splenocyte media</td></tr><tr><td>MEM non-essential amino acids</td><td>WISENT Inc.</td><td>321-010-EL&amp;nbsp;</td><td>Component of the splenocyte media</td></tr><tr><td>HEPES free acid 1 M</td><td>WISENT Inc.</td><td>330-050-EL&amp;nbsp;</td><td>Component of the splenocyte media</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution (100mM)</td><td>WISENT Inc.</td><td>600-110-EL&amp;nbsp;</td><td>Component of the splenocyte media</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>WISENT Inc.</td><td>080-910&amp;nbsp;</td><td>Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>WISENT Inc.</td><td>311-010-CL</td><td>Component of flow-cytometry buffer</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td>Component of the splenocyte media</td></tr><tr><td>T-Cells isolation kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19851</td><td>To isolate T cells</td></tr><tr><td>B-Cells isolation kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19854</td><td>To isolate B cells</td></tr><tr><td>Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11452D</td><td>To activate T cells&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cell isolation magnet</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td>To isolate T cells and remove the magnetic beads&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>AffiniPure F(ab&#039;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>115-006-068</td><td>To stimulate B cells</td></tr><tr><td>Recombinant Murine IL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17&amp;nbsp;</td><td>To support T-cell survival during activation</td></tr><tr><td>Recombinant CD40L</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>8230-CL/CF</td><td>To stimulate B cells</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3 antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>561799</td><td>To stain T cells for flow-cytometry</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD19 antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553786</td><td>To stain B cells for flow-cytometry</td></tr><tr><td>Biomek FX&lt;sup&gt;p&lt;/sup&gt;</td><td>PerkinElmer Inc.</td><td>A31842</td><td>To re-suspend cells after 24 h incubation</td></tr><tr><td>Opera Phenix High Content Screening System</td><td>PerkinElmer Inc.</td><td>HH14000000</td><td>To analyze GFP/Hoechst signal</td></tr></tbody></table>

a fluorescence-based lymphocyte assay suitable for high-throughput screening of small molecules

높은 처리량 스크리닝 (HTS)는 현재 생화학 반응 또는 세포 과정을 조절할 수있는 화학 엔티티의 식별을위한 대들보이다. 바이오 기술의 진보 및 작은 분자의 병진 높은 전위, 신약 혁신적인 접근 방법은 HTS의 사용에 관심을 부활 설명하는 진화 해왔다. 종양학 필드는 현재 이식 관련 합병증 또는자가 면역 질환을 대상으로 새로운 면역 조절 화합물의 식별을 위해 만든 더 큰 혁신과 약물 검사에 대한 가장 활발한 연구 분야이다. 여기서는 관내 뮤린 형광 계 분석에서 림프구 신규 쉽게 새로운 면역 조절 화합물을 동정하도록 제안한다. 상기 분석은 Nur77 프로모터 T- 또는 B 세포 수용체 자극에 GFP 발현을 구동하는 트랜스 제닉 마우스로부터 유도 된 T 세포 또는 B를 사용한다. GFP의 강도가 반영하는 바와 같이,표적 세포의 활성화 / 전사 활성은, 우리의 분석은 셀룰러 / 생물학적 반응에 대한 특정 화합물 (들)의 효과를 연구하기위한 신규 도구를 정의한다. 예를 들어, 차 스크리닝은 면역 활동 전위를 디스플레이 (160)의 히트 식별되었다 「타겟 가설 &quot;의 부재 하에서 4,398 화합물을 사용하여 수행 하였다. 따라서, 이러한 분석의 사용은 시험 관내 / 생체 내 유효성 연구를 촉진하기 전에 큰 화학 라이브러리를 탐색 신약 프로그램에 적합하다.

고온 초전도 분석의 디자인 본원 형광 분석법을 설계 할 때 중요한 두 가지 요인을 고려 하였다. 먼저, T- 또는 B 세포 활성화는 질병 (예를 들어, 이식편 대 숙주 병)을 나타내는 것이되는 생리 학적 상태를 재현 할 필요가 있었다. 둘째, 세포 활성에 대한 평가가 민감하고 정량적 인 방법을 이용하여 수행되어야한다. 그것?...

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A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

우리는 현재의 연구에서 형질 전환 마우스에서 파생 된 림프구를 사용하여 새로운 형광 기반의 분석을 제시한다. 이 분석은 억제 또는 림프구의 활성을 촉진하거나 용량을 부여 소분자의 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 적합하다.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

a-fluorescence-based-lymphocyte-assay-suitable-for-high-throughput

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.3K 조회수.  Université de Montréal.  우리는 현재의 연구에서 형질 전환 마우스에서 파생 된 림프구를 사용하여 새로운 형광 기반의 분석을 제시한다. 이 분석은 억제 또는 림프구의 활성을 촉진하거나 용량을 부여 소분자의 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 적합하다. 

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A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

연구

의학

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

면역학 및 감염병학

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

T 세포 반응의 평가를위한 형광 대상 배열의 사용<em&gt; 생체 내</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

생물학

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

<meta charset="utf8"></head><body>Dual Reporters를 사용한 Mycobacterium abscessus 에 대한 High-Throughput Screening Assay

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: M. abscessus 치료법의 효율적인 발견을 위한 확장 가능한 약물 스크리닝 프로토콜

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

요약

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배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

T 세포 반응의 평가를위한 형광 대상 배열의 사용

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발