Этот протокол применим к широкому кругу проектов скрининга, направленных на разработку ингибиторов ATPase, либо в качестве зондов для фундаментальных исследований, либо для потенциальных клинических соединений. Этот метод был оптимизирован для полу-высокой пропускной способности приложений скрининга. Он также был разработан, чтобы избежать нескольких распространенных артефактов, и это не требует обработки опасных материалов.
В нашей лаборатории мы использовали этот анализ для разработки новых и конкретных немишечных ингибиторов миозин II для лечения расстройства использования метамфетамина. Теоретически этот метод можно легко применить к любым ферментам, производящим АТФ. Визуальная демонстрация помогает прояснить все важные технические детали.
Для начала подготовьте 4500 микролитров 20 микромоляных разбавленных актиновых растворов для каждого 384-хорошого черного полистирола микроплея путем разбавления концентрированного раствора актиновых запасов в буфере актина. Смешайте раствор тщательно, трубя вверх и вниз 30 раз, чтобы сломать актин нити для снижения вязкости и неоднородности. Затем центрифуга раствор, чтобы удалить любой осажденный белок настоящее время.
Тщательно перенесите супернатант в чистую центрифугу. Подготовка мастер фермента смесь в 15-миллилитровой конической центрифуг трубки для каждой анализной пластины путем объединения 3, 252,9 микролитров миозин буфера для анализа с участием скелетных мышц миозин II, 171,4 микролитров раствора LDH, и 171,4 микролитров PK решения. Подготовьте мастер-смесь субстрата в 15-миллилитровой конической центрифуге для каждой пластины, объединив 162,1 микролитров АТФ, 162,1 микролитров ПЭП и 324,1 микролитров раствора NADH.
Не добавляйте актин в этот момент, чтобы избежать агрегации и осадков. Для создания семиступенчатых серийных разбавлений NADH для калибровки приготовьте восемь микроцентрифуговых трубок диаметром 1,5 миллилитра. Смешайте 12,3 микролитров раствора NADH с 257,7 микролитров миозин буфера в первой трубке, чтобы сделать 250 микромолярный раствор.
Затем aliquot 135 микролитров миозин буфера в каждой из оставшихся семи труб. Перенесите 135 микролитров раствора из первой трубки во вторую и перемешайте с помощью труб. Повторяйте до достижения седьмой трубки.
Используйте последнюю трубку в качестве управления no-NADH только с буфером. Всегда включают положительный и отрицательный контроль на сложных пластинах, и NADH разбавления для калибровки на анализе пластин. Эти элементы управления чрезвычайно важны для идентификации артефактов во время анализа данных.
Используя восьмиканарный пипетку, перенесите 20 микролитров калибровочные растворы NADH в первый ряд в три раза в анализной пластине. Теперь добавьте 4,2 микролитров скелетного мышечного миозина II в ферментную смесь. Вортекс кратко.
Добавьте миозин в ферментную смесь прямо перед раздачей. Длинная инкубация разбавленных растворов миозин может привести к потере активности из-за осадков и неспецифической привязке к пластиковым поверхностям. Загрузите подготовленную смесь фермента миозин в один из образцов контейнеров автоматического дозатора.
В пластине, за исключением первого ряда, обойтись 8,4 микролитров фермента миозин смеси в каждом хорошо анализа пластины. Затем поместите анализ пластины и составной пластины на лабораторных позиционеров автоматизированной жидкостной системы обработки, которая оснащена 100-нанолитровый контактный инструмент головы. Затем запустите соответствующий метод в программном обеспечении для передачи 100 нанолитров растворов из подготовленной пластины соединения на анализ пластины.
Затем поместите анализную пластину на шейкер микропластины, чтобы встряхнуть в течение одной минуты при комнатной температуре при температуре 1200 об/мин. Добавить 4, 052 микролитров центробежного раствора актина в субстрат смеси и вихря кратко. Чтобы начать энзиматические реакции, обойтись 11,6 микролитров актин субстрата смесь в каждом колодец анализ пластины с помощью автоматического дозатора, за исключением первого ряда.
На микропластирной шейкере встряхните анализную пластину в течение одной минуты при комнатной температуре 1 200 об/мин. Центрифуга анализ пластины в 101 раз г в течение 30 секунд. Используйте 380-нанометровый, 10-нанометровый фильтр для возбуждения полосы и 470 нанометров, 24-нанометровый фильтр для выбросов полосы в сочетании с 425-нанометровым дихроическим зеркалом для анализа.
Оптимизируйте количество вспышек, увеличение детектора, размеры пластин и высоту измерения перед запуском анализов. Вы запустите измерение в режиме высокой концентрации. Убедитесь, что внутренняя температура считыватель пластины стабилизировалась на 25 градусов по Цельсию.
Загрузите пластину в считыватель пластины и встряхните еще 30 секунд, чтобы сделать форму жидкой поверхности похожей в каждой хорошо и позволить пластине достичь температуры измерения. Сканирование пластины в 45-секундных интервалах и запись NADH флуоресценции в течение 30 минут. С экспортируемыми данными, участок наблюдаемой интенсивности флуоресценции со временем для каждой хорошо.
Выполните простую линейную регрессию для определения наклона и перехвата реакций флуоресценции для каждой колодец. Склон пропорционален скорости потребления NADH, которая может быть использована в качестве очень хорошего приближения скорости потребления АТФ. Перехват пропорционален концентрации NADH в начале измерения.
Затем создайте кривую калибровки для NADH, наметив перехваты, полученные для первого ряда пластины против концентрации NADH. Перехваты оценивают реальную интенсивность флуоресценции в начале с гораздо большей уверенностью, чем средняя интенсивность сырой флуоресценции читает в начале. Выполните простую линейную регрессию для получения наклона и перехвата калибровочной линии NADH.
Здесь перехват описывает фоновый сигнал флуоресценции без настоящего времени NADH, в то время как наклон соответствует экстраполированной теоретической интенсивности флуоресценции одного молярного решения NADH. Для преобразования изменений флуоресценции на показатели потребления АТФ разделить наклон реакции флуоресценции, полученной для остальных скважин по наклону калибровочной линии NADH. Далее, участок ставки потребления АТФ против концентрации ингибитора.
Для определения ингибирующей константы используйте любое соответствующее статистическое программное обеспечение, способное к установке нелинейной кривой, например Origin 2017. Выберите нелинейную кривую, соответствующую данным о дозах и ответе, к квадратному уравнению, соответствующему простой модели соответствующего равновесия один на один. Y является уровень потребления АТФ.
Y-минимум - это уровень потребления АТФ при отсутствии ингибитора. Y-максимум - это теоретическая скорость потребления АТФ на уровне 100% ингибирования. t и t являются общей концентрацией фермента миозин и ингибитора, соответственно.
KI является ингибирующей константой. В этом исследовании, скелетных и сердечной мышцы миозин II ATPase реакции показали линейные следы интенсивности флуоресценции, независимо от используемого миозин или наличие ингибиторов. Базальные и актин-активированные ставки ATPase показали линейную зависимость от концентрации скелетных или сердечных мышц миозин II.A коэффициент окна скрининга или коэффициент 0,78 указал надежный анализ с очень хорошо разделенных положительных и отрицательных элементов управления.
Blebbistatin, пара-Aminoblebbistatin, и пара-Nitroblebbistatin показали регулярные кривые дозы реакции на или ниже их сообщили значения solubility. Ингибиторные константы как для сердечного, так и для скелетного мышечного миозин-ИИ были определены путем установки квадратного уравнения, представляющего простую модель связывания равновесия с данными. Следы интенсивности флуоресценции для блефистатина, полученные в анализе ATPase с использованием скелетного мышечного миозина II, показали нормальный линейно уменьшаемый сигнал в зависимости от количества присутствуют ингибиторы.
Однако выше растворимости блефистатина наблюдалось неожиданное увеличение сигнала, скорее всего, из-за образования ярко флуоресцентных кристаллов блефнистатина. В случае пара-нитроблбистатина с нормальными необработанными следами интенсивности флуоресценции, скорость реакции, полученная выше solubility, расходилась с обусловленной кривой реакции дозы из-за осадков. Используя этот метод, мы разработали новые, мощные и селективные ингибиторы миозин, которые могут быть использованы в качестве научных инструментов в фундаментальных исследованиях или в качестве прямых кандидатов в будущем.
Всегда рекомендуется использовать различные ATPase или другие функциональные анализы, характерные для фермента интерес различать реальные и ложноположительные хиты. Все белки связывают пластиковые поверхности. Эта проблема может сильно повлиять на результаты, особенно если белок присутствует при низких концентрациях.
Всегда избегайте ненужной обработки жидкости и используйте необязательные трубки. Альтернативные анализы ATPase обычно требуют обработки серной кислоты, токсичных веществ или радиоактивных материалов. В отличие от этого, NADH-связанных ATPase анализ требует реагентов без или очень низкой токсичности только.
