Este protocolo es aplicable a una amplia gama de proyectos de cribado destinados al desarrollo de inhibidores de ATPasa, ya sea como sondas para la investigación básica o para posibles compuestos clínicos. Este método se ha optimizado para aplicaciones de cribado de rendimiento semi-alto. También ha sido diseñado para evitar varios artefactos comunes y no requiere el manejo de materiales peligrosos.
En nuestro laboratorio hemos estado utilizando este ensayo para desarrollar nuevos y específicos inhibidores de la miosina II no muscular para el tratamiento del trastorno del uso de metanfetaminas. En teoría, este método se puede aplicar fácilmente a cualquier enzima que produzca ATP. La demostración visual ayuda a aclarar todos los detalles técnicos importantes.
Para empezar, prepare 4.500 microlitros de 20 micromolares diluidos de actina por cada microplaca de poliestireno negro de 384 pocillos diluyendo la solución concentrada de actina en tampón de actina. Mezclar bien la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo 30 veces para romper los filamentos de actina para reducir la viscosidad y la heterogeneidad. A continuación, centrifugar la solución para eliminar cualquier proteína precipitada presente.
Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio. Preparar la mezcla de enzimas maestras en un tubo de centrífuga cónica de 15 mililitros para cada placa de ensayo combinando 3, 252,9 microlitros de tampón de miosina para el ensayo que involucra miosina muscular esquelética II, 171,4 microlitros de solución LDH y 171,4 microlitros de solución PK. Prepare la mezcla de sustrato maestro en un tubo de centrífuga cónica de 15 mililitros para cada placa combinando 162,1 microlitros de ATP, 162,1 microlitros de PEP y 324,1 microlitros de solución NADH.
No agregue actina en este punto para evitar la agregación y la precipitación. Para crear diluciones seriales de uno a dos pasos de NADH para calibración, prepare ocho tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Mezclar 12,3 microlitros de solución de material DE NADH con 257,7 microlitros de tamampón de miosina en el primer tubo para hacer una solución de 250 micromolares.
A continuación, aliquot 135 microlitros de tamampón de miosina en cada uno de los siete tubos restantes. Transfiera 135 microlitros de la solución desde el primer tubo al segundo y mezcle por pipeteo. Repita hasta llegar al séptimo tubo.
Utilice el último tubo como control sin NADH con solamente buffer. Incluya siempre controles positivos y negativos en placas compuestas y diluciones NADH para calibración en placas de ensayo. Estos controles son extremadamente importantes para identificar artefactos durante el análisis de datos.
Con una pipeta de ocho canales, transfiera 20 microlitros de las soluciones de calibración NADH a la primera fila en triplicados en una placa de ensayo. Ahora agregue 4.2 microlitros de miosina del músculo esquelético II a la mezcla enzimática. Vórtice brevemente.
Añadir miosina a la mezcla enzimática justo antes de dispensar. La incubación prolongada de soluciones de miosina diluida puede resultar en la pérdida de actividad debido a la precipitación, y la unión inespecífico a las superficies de plástico. Cargue la mezcla de enzimas de miosina preparadas en uno de los recipientes de muestra de un dispensador automático.
En la placa, a excepción de la primera fila, dispensar 8,4 microlitros de la mezcla de enzimas de miosina en cada pote de ensayo. A continuación, coloque la placa de ensayo y la placa compuesta en los posicionadores de material de laboratorio de un sistema automatizado de manipulación de líquidos que está equipado con un cabezal de herramienta de 100 nanter. A continuación, ejecute el método adecuado en el software para transferir 100 nanolitros de soluciones desde la placa compuesta preparada a la placa de ensayo.
A continuación, coloque la placa de ensayo en una coctelera de microplacas para agitar durante un minuto a temperatura ambiente a 1.200 rpm. Añadir 4.052 microlitros de la solución de actina centrifugada a la mezcla de sustrato y al vórtice brevemente. Para iniciar la reacción enzimática, dispensar 11,6 microlitros de mezcla de sustrato de actina en cada pozo de la placa de ensayo utilizando un dispensador automático, excepto la primera fila.
En un agitador de microplacas, agitar la placa de ensayo durante un minuto a temperatura ambiente a 1.200 rpm. Centrifugar la placa de ensayo a 101 g durante 30 segundos. Utilice un filtro de excitación de ancho de banda de 380 nanómetros y ancho de banda de 10 nanómetros y un filtro de emisión de ancho de banda de 470 nanómetros junto con el espejo dicroico de corte de 425 nanómetros para los ensayos.
Optimice el número de destellos, la ganancia del detector, las dimensiones de la placa y la altura de medición antes de ejecutar los ensayos. Ejecute la medición en modo de alta concentración. Asegúrese de que la temperatura interior del lector de placas se haya estabilizado a 25 grados centígrados.
Cargue la placa en el lector de placas y agite durante otros 30 segundos para hacer que la forma de la superficie líquida sea similar en cada pozo y permitir que la placa alcance la temperatura de medición. Escanee la placa en intervalos de 45 segundos y registre la fluorescencia NADH durante 30 minutos. Con los datos exportados, trazar la intensidad de fluorescencia observada contra el tiempo para cada pozo.
Realice una regresión lineal simple para determinar la pendiente y la interceptación de las respuestas de fluorescencia para cada pozo. La pendiente es proporcional a la tasa de consumo de NADH que se puede utilizar como una muy buena aproximación de la tasa de consumo de ATP. La interceptación es proporcional a la concentración de NADH al principio de la medición.
A continuación, construya una curva de calibración para NADH trazando las interceptaciones obtenidas para la primera fila de la placa contra la concentración de NADH. Las interceptaciones estiman las intensidades reales de fluorescencia al principio con mucha más confianza que el promedio de la intensidad de fluorescencia cruda se lee al principio. Realice una regresión lineal simple para obtener la pendiente y la interceptación de la línea de calibración NADH.
Aquí, las interceptaciones describen la señal de fondo de fluorescencia sin NADH presente, mientras que la pendiente corresponde a la intensidad teórica extrapolada de fluorescencia de una solución NADH de un molar. Para convertir los cambios de fluorescencia en las tasas de consumo de ATP, divida la pendiente de la respuesta de fluorescencia obtenida para el resto de los pozos por la pendiente de la línea de calibración NADH. A continuación, trazar las tasas de consumo de ATP contra la concentración del inhibidor.
Para determinar las constantes inhibitorias, utilice cualquier software estadístico adecuado capaz de ajustar la curva no lineal, como Origin 2017. Seleccione el ajuste de curva no lineal para ajustar los datos de dosis-respuesta a una ecuación cuadrática correspondiente a un modelo de equilibrio de unión simple uno a uno. Y es la tasa de consumo de ATP.
Mínimo Y es la tasa de consumo de ATP en ausencia de inhibidor. Y-máximo es la tasa teórica de consumo de ATP en 100%inhibición. t y t son la concentración total de la enzima e inhibidor de la miosina, respectivamente.
KI es la constante inhibitorio. En este estudio, las reacciones de miosina II de miosina esquelética y cardiaca ATPasa mostraron trazas lineales de intensidad de fluorescencia independientemente de la miosina utilizada o la presencia de inhibidores. Las tasas de ATPasa basales y activadas por actina mostraron dependencia lineal de la concentración de miosina de cribado esquelética o cardiaca II.A o factor Z de 0,78 indicaron un ensayo fiable con controles positivos y negativos muy bien separados.
Blebbistatin, para-Aminoblebbistatin, y para-Nitroblebbistatin mostraron curvas regulares de dosis-respuesta en o por debajo de sus valores de solubilidad reportados. Las constantes inhibidoras para los IIs de miosina cardiaca y esquelética se determinaron ajustando una ecuación cuadrática que representa un modelo de unión de equilibrio simple a los datos. Los rastros de intensidad de fluorescencia para la blebbistatina obtenida en un ensayo de ATPase utilizando miosina muscular esquelética II mostraron una señal normal de disminución lineal dependiendo de la cantidad de inhibidor presente.
Sin embargo, por encima de la solubilidad de la blebbistatina se observó un aumento inesperado de la señal probablemente debido a la formación de cristales de blebbistatina brillantemente florescente. En el caso de para-Nitroblebbistatina con trazas normales de intensidad de fluorescencia cruda, las tasas de reacción obtenidas por encima de la solubilidad se desviaron de la curva de dosis-respuesta determinada debido a la precipitación. Mediante el uso de este método, hemos desarrollado nuevos, potentes, y selectivos inhibidores de la miosina que podrían ser utilizados como herramientas científicas en la investigación básica o como candidatos directos en el futuro.
Siempre se recomienda utilizar un ATPase diferente u otro ensayo funcional específico de la enzima de interés para distinguir entre golpes positivos reales y falsos. Todas las proteínas unen superficies plásticas. Este problema puede afectar altamente a los resultados, especialmente si la proteína está presente a bajas concentraciones.
Evite siempre el manejo innecesario de líquidos y utilice tubos que no sean de unión. Los ensayos alternativos de ATPasa generalmente requieren el manejo de ácido sulfúrico, sustancias tóxicas o materiales radiactivos. Por el contrario, el ensayo ATPase vinculado a NADH requiere reactivos con poca toxicidad o muy baja.
