利用 Crispr-ca 在哺乳动物细胞系中进行基因组编辑

该协议使用CRISPR-Cas9创建淘汰线或敲打线。这种技术的主要优点是，它简单和高效遵循，特别是对于新手研究人员。对于细胞传传，在37摄氏度下用每盘0.25%的两毫升2毫升的通宵培养细胞治疗两分钟。

当细胞从板底提升时，用两毫升细胞培养中中和酶反应，将细胞悬浮液转移到锥形管中。通过离心收集细胞，并在五毫升新鲜细胞培养中重新供应颗粒进行计数。然后将1.8倍10至第五细胞播种到24井组织培养板的一个井中，在37摄氏度和5%的二氧化碳下进行隔夜培养。

对于细胞的转染，根据实验设计和制造商的说明，在适当体积的转染试剂中加入含有适当浓度的CRISPR质粒的适当转染混合物。在室温下在推荐的一段时间内孵育转染混合物后，以滴法方式将溶液添加到细胞中。然后轻轻旋转板，将板混合并放在加湿的 37 摄氏度培养箱中，并加5%的二氧化碳。

在转染结束时，添加150微升的三辛-EDTA，以分离细胞，正如刚刚演示的，通过离心收集分离的细胞。将颗粒重新在PBS中2%的胎儿牛血清中，并通过30微米网状滤网过滤细胞，进入5毫升荧光激活细胞分选或FACS管。然后使用非转染细胞在流动细胞仪上设置负控制门，根据用于转染的CRISPR质粒上的荧光标记对转染细胞进行排序，并放入含有100微升细胞培养基的管中。

收集所有转染细胞后，以最大速度离心，将细胞粒粒，并在300微升细胞培养培养的微升中重新下粒。将200微升细胞放入24井组织培养板的一个井中，使细胞在37摄氏度的培养箱中恢复几天。以最大速度将其余 100 微升的分拣细胞提取 5 分钟，然后根据标准 DNA 提取协议从生成的颗粒中提取基因组 DNA。

接下来，加入10微升聚合酶链反应缓冲液、1微升脱氧核苷酸混合物、2.5微升用户定义的反向底因、0.5微升DNA聚合酶、2至5微升提取的基因组DNA模板和足够的双蒸馏水，使反应最终达到50微升。在热循环器上运行混合物，根据标准协议使用 1X TAE 缓冲液解决 2% agarose 凝胶上的反应。使用干净、锋利的手术刀切除聚合酶链反应产品，并使用凝胶提取套件根据制造商的说明进行DNA纯化。

使用 260 纳米吸光度分光光度计测量产品的浓度。准备含有200纳米分离DNA的测定混合物、T7内核糖酶 I 反应缓冲液的两微升，以及足够的双蒸馏水，使混合物的最终体积达到 19 微升。将聚合酶链反应产品在热循环器中以指示参数进行，将5个T7内核糖酶 I 单元与再核糖核酸产品混合，在 37 摄氏度下孵育 50 分钟。

在孵育结束时，使用1X TAE缓冲液在2.5%的阿加罗斯凝胶上解析消化的DNA，并在适当的凝胶成像系统上对凝胶进行成像。打开 ImageJ 中的凝胶图像，并在带周围绘制一个尽可能靠近其边界的矩形框。单击"分析"和"设置测量"，确认已检查区域、平均灰色值和集成密度选项。

单击"确定"，然后选择"分析"和"测量"。均值或原始强度密度值表示波段强度。当培养的转染细胞开始成为汇合体时，如所证明的，用三头肌-EDTA分离它们，并在100毫米组织培养皿中稀疏地播种细胞，以便给单个菌落留出足够的空间，让个体菌落在将细胞返回到细胞培养箱之前生长。

当菌落开始形成时，使用四 X 放大倍率的显微镜挑选单个菌落转移到每个孔包含 500 微升细胞培养培养基的 24 孔板的单个孔中。注意您的尖端不会接触周围的殖民地，以防止个别井内菌落，或从稀疏的殖民地生长区域采摘。当所有克隆被挑选后，将板放在细胞培养培养箱中，直到培养物成为汇合。

由于未消化质粒是超线圈的，它们往往比线性质粒运行得更快。为了确定寡核苷酸是否已成功克隆到CRISPR质粒骨干中，在提取质粒并送去桑格测序之前，进行聚体PCR并接种阳性克隆。成功交付质粒后，荧光信号可在显微镜下轻松可视化，从而通过流式细胞仪对转染细胞进行排序。

T7内核糖酶 I 测定，以检查基因组DNA的裂解效率，根据在 agarose 凝胶上观察到的带子强度计算。此外，如果同源式修复实验设计为在目标位点合并一个限制位点，则可以使用相应的限制性酶进行限制片段长度多态性测定。为了进一步验证蛋白质编码基因是否已成功灭活，可以进行西方印迹，以确保不存在靶向蛋白。

转染后对细胞进行排序可消除不合并质粒的细胞，从而增加后期筛选的细胞具有敲除或敲入基因的百分比。随着这项技术的发展，我们现在能够产生敲出细胞系来研究基因功能和敲打细胞系来模拟特定疾病，以了解其机理。