이 절차는 우리가 덜 침습적 조작과 높은 시간적 해상도와 수면 깨어 조절에 관여하는 특정 신경 회로의 기능을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법을 통해 특정 신경 회로의 조작과 함께 실시간으로 모니터링 표면 EEG를 통해 회로와 수면 깨어 상태 간의 인과 관계를 검사할 수 있습니다. 쇼타 코다니는 절차를 시연할 것입니다.
발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 동물의 눈에 연고를 적용하고 흡수 패드에 마취 마우스의 머리를 안정화하기 위해 스테레오 전술 장치에 이어 바 및 코 핀을 사용합니다. 머리가 제자리에 고정되면, 두피에 중간 처진 절개를 하여 수투라 시정과 수구 코로날리스 또는 수투라 람도이트 사이의 교차점이 동일한 수준에서 수평선에 있는지 확인한다. 위치 간격을 피하려면 필요에 따라 코 핀치와 이어 바를 조정합니다.
그런 다음 세라핀 클램프를 사용하여 피부를 열어 놓고 두개골의 노출된 표면을 소독하여 두개골 봉합사를 보다 명확하게 시각화할 수 있게 한다. 아데노 관련 바이러스 벡터를 주입하기 위해, 에탄올 살균 10 밀리리터 주사기를 미네랄 오일 의 2마이크로리터로 적재하고, 그 다음에 는 바이러스의 실험적 부피를 주입한다. 미세 주입 펌프를 사용하여 미세 주입 바늘의 끝을 bregma에 조정하고 좌표를 원점으로 주의하십시오.
그런 다음 팁을 지정된 주사 부위로 이동하여 바늘 끝을 위치에 놓습니다. 주입 부위에 두개골을 표시하고 0.7 mm 초경 커터가 장착 된 치과 드릴을 사용하여 약 2 밀리미터 직경의 구멍을 두개골에 드릴링하십시오. 면봉으로 구멍 주위에서 혈액을 제거 한 후, 천천히 stria 말단 또는 BSNT의 침대 핵에 바늘을 이동하고 천천히 바이러스 용액의 지정된 볼륨을 주입.
그런 다음 바늘을 조심스럽게 철회하기 전에 용액이 BNST 조직에 충분히 침투 할 수 있도록 5 분 동안 바늘을 제자리에 둡니다. 뇌전도, 또는 EEG, 및 전극 이식, 전극 이식, 1mm의 절연이 양쪽 끝에서 EMG 전극으로 제거되어 전극의 중심을 브레그마에 배치하는 두 개의 스테인레스 스틸 와이어를 먼저 납땜한다. 그런 다음 각 EEG 전극의 위치를 표시합니다.
광섬유 임플란트의 위치를 결정하기 위해, 광섬유 발효기를 조작기에 부착하고 조판에 대해 30도 각도를 더하거나 뺀 각도로 조작기 암을 회전시킨다. 섬유 팁을 브레그마에 놓고 좌표를 기록합니다. 팁을 표적 삽입 선으로 이동하고 두개골의 위치와 삽입 부위 옆에 있는 앵커 나사의 위치를 표시합니다.
치과 드릴을 사용하여 각 부위의 두개골을 드릴링하고 조작기를 사용하여 BNST 위에 도달할 때까지 광섬유를 부드럽게 삽입합니다. 발효는 나머지 두개골에 쉬어야합니다. 두라를 부러뜨리거나 조직을 손상시키지 않도록 주의를 기울여, 앵커 나사로 두개골에 섬유를 고정하십시오.
그런 다음 광섬유를 덮고 사진 치료 가능한 치과 시멘트로 나사를 덮습니다. 다음으로, EEG/EMG 전극을 위한 구멍을 뚫고 첫 번째 전극의 끝을 하나의 구멍에 삽입한다. 임플란트를 한 손으로 잡고, 두개골과 전극 사이의 공간에 청응을 적용하고 조직의 손상을 주지 않도록주의하여 나머지 방법으로 전극을 삽입합니다.
모든 전극이 배치되면, 추가 적인 시아노아크레이트 접착제 및 시아노아크릴레이트 가속제와 함께 전극및 광섬유의 둘레를 덮어 광케이블및 전극에 대한 ferrule에 중단을 일으키지 않도록 전선 연결 영역을 리드한다. 이제 목 근육을 노출하고 근육 아래에 EMG 전극에 대한 와이어를 삽입합니다. EMG 전극의 길이를 조정하여 핵 근육 바로 아래에 맞고 임플란트를 더 많은 시아노아릴레이트 접착제와 가속으로 채웁니다.
그런 다음 마우스를 완전한 보상이 될 때까지 모니터링하여 열 패드에 놓습니다. 표적 뉴런의 사진 엑소시터 동안 EEG/EMG 모니터링의 경우 먼저 스칼라를 사용하여 레이저 강도를 조정하고 레이저 케이블의 끝을 사용하지 않는 광섬유에 밧줄로 묶습니다. 섬유와 케이블 사이의 접합에 공간이 없는지 확인합니다.
20분 후, 워밍업된 레이저를 강도 체커에 방출하고 밀리미터 제곱당 10밀리와트로 강도를 조절합니다. 광 펄스 지속 시간을 10밀리초로 설정하고, 나머지 기간은 40밀리초로, 사이클은 20초로, 반복을 20으로 설정합니다. 레이저 모드를 트랜지스터 로직으로 변경하고 패턴 레귤레이터에 의해 제어되는 섬유에서 광 펄스가 방출되는지 확인합니다.
이식된 전극과 케이블 어댑터를 연결한 다음, 레이저 누출을 방지하기 위해 가벼운 불투과성 재료로 접합을 덮습니다. 그리고 레이저가 준비되면, EEG/EMG 레코딩을 위한 실험 챔버로 마우스를 이동한다. 비급속 눈 운동 또는 빠른 눈 운동 수면에서 절각을 위한 대기 시간을 평가하기 위해, 기록 시간을 제한하고 최적화된 부위 획득 시간을 제한하고 마우스가 적어도 한 시간 동안 실험 챔버에서 자유롭게 움직일 수 있도록 한다.
실험 기간 동안 동일한 기록 화면에서 EEG 및 EMG 신호를 모니터링합니다. 각 상태를 구별하기 쉽기 위해 각 파도에 대한 게인 제어를 사용하여 마우스의 상태를 깨어, 비 급속한 눈 운동 수면 또는 빠른 눈 운동 수면으로 평가합니다. 비급속 눈 운동 수면을 측정하여 절전 모드 대기 시간을 측정하고, 40초 동안 안정적인 비급속 눈 운동 수면을 관찰한 다음, 패턴 생성기를 켜서 사진 자극을 위해 켜고 이식된 광섬유에 레이저 방출을 확인합니다.
그런 다음 수면 상태가 깨어날 때까지 EEG/EMG 신호를 기록합니다. 여기서 는 비급속 눈 운동 수면 동안 사진 자극 전후EEG/EMG 흔적을 나타내고 있다. EMG 신호가 없는 고전압 및 느린 주파수 EEG는 비빠른 눈 이동 수면을 나타냅니다.
사진 자극은 제어 마우스가 이 전이를 보여주지 않는 동안 channelrhodopsin-2 표현 마우스에 있는 자극 후에 대략 2 초 후에 깨어에 심각한 전환을 트리거했습니다, 비 급속한 눈 운동 도중 BNST GABA 신경의 흥분이 깨어의 급속한 유도를 트리거한다는 것을 건의합니다. 반대로, 급속한 눈 운동 수면 중 사진 자극은 효과가 없었기 때문에 비급속 눈 운동 수면에서만 전환 효과가 나타났습니다. 바이러스 주입 및 광섬유 이식 단계에 대한 정밀한 조정에 주의를 기울이는 것이 중요합니다.
수면 분석 중에 포착된 EEG/EMG 추적은 마우스의 다른 경계 상태에 대한 사진 조작의 결과를 평가하는 데 사용될 수 있다. 이 기술은 또한 우리가 수면 깨어 상태를 조절에 관여하는 그밖 분대 및 회로를 확인하는 것을 도울 것입니다. 보호 고글을 사용하여 눈에 레이저 손상을 방지하고 사용 후 아데노 관련 바이러스 벡터 용기를 항상 자동 복제해야 합니다.
