הליך זה יכול לעזור לנו לזהות את הפונקציה של מעגל נוירו ספציפי המעורבים בוויסות ערנות השינה עם מניפולציה פולשנית פחות ורזולוציה זמנית גבוהה. שיטה זו מאפשרת לנו את פני השטח ניטור EEG בזמן אמת בשילוב עם מניפולציה של מעגל נוירו ספציפי כדי לבחון את הקשר הסיבתי בין מעגלים מצבי ערנות שינה. שוטה קודאני תדגים את הנוהל.
לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת הבוהן, יש למרוח משחה על עיני החיה ולהשתמש בפסי האוזן וסיבת האף למנגנונים הסטריאוטקטיים כדי לייצב את ראש העכבר הרדמה על כרית סופגת. כאשר הראש קבוע בעמדה, לעשות חתך באמצע sagittal בקרקפת כדי לאשר כי הצומת בין סאטורה sagittalis ו sutura coronalis או sutura lambdoidea נמצאים בקו אופקי באותה רמה. כדי למנוע פער מיקום, התאימו את קמצוץ האף ואת מוטות האוזן לפי הצורך.
לאחר מכן באמצעות מהדקי סרפין כדי להחזיק את העור פתוח לחטא את פני השטח החשופים של הגולגולת כדי לאפשר את התפרים הגולגולת להיות חזותיים בצורה ברורה יותר. כדי להזריק את וקטור וירוס אדנו הקשורים, לטעון מזרק אתנול מעוקר 10 מיליליטר עם שני microliters של שמן מינרלי, ואחריו נפח ניסיוני של וירוס להיות מוזרק. השתמש במשאבת microinjection כדי להתאים את קצה מחט microinjection על bregma ולציין את הקואורדינטות כנקודת המוצא.
לאחר מכן להעביר את הקצה לאתר ההזרקה המיועד ולמקם את קצה המחט על המיקום. סמן את הגולגולת באתר ההזרקה ולהשתמש במקדחה שיניים מצויד חותך קרביד 0.7 מילימטר לקדוח חור בקוטר של כשני מילימטר לתוך הגולגולת. לאחר הסרת דם מסביב לחור עם צמר גפן, לאט להזיז את המחט אל גרעין המיטה של terminalis סטריה או BSNT לאט להזריק את הנפח המיועד של פתרון וירוס.
ואז להשאיר את המחט במקום במשך חמש דקות כדי לאפשר לפתרון מספיק לחדור את רקמת BNST לפני בזהירות לסגת המחט. עבור אלקטרואנצפלוגרם, או EEG, ו electromyogram, או EMG, השתלת אלקטרודה, הלחמה הראשונה שני חוטי נירוסטה שממנו מילימטר אחד של בידוד הופשט משני הקצוות אל אלקטרודות EMG ולמקם את מרכז האלקטרודות על bregma. לאחר מכן סמן את המיקום עבור כל אלקטרודה EEG.
כדי לקבוע את המיקום של שתל הסיב האופטי, חבר סיב אופטי ferrule למניפולטור ולסובב את זרוע המניפולטור לזווית פלוס או מינוס 30 מעלות נגד קו אופקי. שים את קצה הסיבים על bregma ולהקליט את הקואורדינטות. הזז את הקצה לקו הכניסה הממוקד וסמן את המיקום על הגולגולת ואת המיקום של בורג העוגן ליד אתר הכניסה.
השתמש במקדחה שיניים כדי לקדוח את הגולגולת בכל אתר ולהשתמש מניפולטור בעדינות להכניס את הסיב האופטי עד שהוא מגיע מעל BNST. פרול צריך לנוח על הגולגולת הנותרת. לאבטח את הסיבים לגולגולת עם בורג עוגן, דואג לא לשבור את דורה או נזק כל רקמה.
ואז לכסות את הסיבים בורג עם מלט שיניים לריפוי צילום. לאחר מכן, לקדוח חורים עבור אלקטרודות EEG / EMG ולהכניס את קצה האלקטרודה הראשונה לתוך חור אחד. החזקת השתל ביד אחת, להחיל דבק cyanoacrylate על החלל בין הגולגולת לבין האלקטרודה ולהכניס את האלקטרודה שאר הדרך, דואג לא לפגוע בכל רקמה.
כאשר כל האלקטרודות הוצבו, לכסות את היקף האלקטרודות ואת הסיבים האופטיים עם דבק cyanoacrylate נוספים מאיץ cyanoacrylate כדי למנוע גרימת כל הפרעה בפרולה לכבל אופטי ואלקטרודה להוביל אזורי חיבור חוט. עכשיו לחשוף את שרירי הצוואר, ולהכניס את החוטים לאלקטרודה EMG מתחת לשריר. התאימו את אורך האלקטרודה EMG כך שתתאים ממש מתחת לשרירי הנוכל וממלאים את השתלים בהיבקות ומאיץ יותר של ציאנואקרילאט.
לאחר מכן מניחים את העכבר על כרית חום עם ניטור עד פיצוי מלא. לניטור EEG/EMG במהלך עירור הצילום של נוירונים ממוקדים, השתמש תחילה בסקלאר כדי לכוונן את עוצמת הלייזר ולהשתמש בפרול כדי לקשור את קצה כבל הלייזר לסיבים אופטיים שאינם בשימוש. ודא שאין מקום בצומת שבין הסיב לכבל.
לאחר 20 דקות, פולטים את הלייזר החם אל בודק העוצמה ומתאימים את העוצמה ל-10 מילי-וואט למילימטר בריבוע. הגדר את משך הדופק הקל ל- 10 אלפיות השניה, את תקופת המנוחה ל- 40 אלפיות השניה, את המחזור ל- 20 ואת החזרה ל- 20. שנה את מצב הלייזר ללוגיקה טרנזיסטורית ואשר שפולסים של אור נפלטים מהסיבים הנשלטים על ידי וסת הדפוס.
חבר את האלקטרודה המושתלת ואת מתאם הכבלים, ולאחר מכן לכסות את הצומת עם חומר אטום אור כדי למנוע דליפת לייזר. וכאשר הלייזר מוכן, להעביר את העכברים לתא הניסוי להקלטת EEG / EMG. כדי להעריך את ההשהיה ערנות מתנועת עיניים לא מהירה או שינה מהירה של תנועת עיניים, להגביל את זמן ההקלטה ואת האתר אופטימיזציה להרוויח זמן ולתת לעכברים לנוע בחופשיות בתא הניסוי לפחות שעה אחת.
במהלך תקופת הניסיון, לפקח על אותות EEG ו- EMG באותו מסך הקלטה. להעריך את מצב העכבר כמו ערנות, תנועת עיניים לא מהירה לישון, או תנועה מהירה של העין לישון באמצעות שליטה לקבל עבור כל גל כדי להקל על הבחנה בין כל מדינה. למדידת השינה הלא מהירה של תנועת העיניים להשהיית ערנות, יש להתבונן בשינה יציבה של תנועת עיניים לא מהירה למשך 40 שניות, ולאחר מכן הפעל את מחולל הדפוסים לגירוי תמונות ואשר את פליטת הלייזר לסיבים האופטיים המושתלים.
לאחר מכן הקליטו את אותות EEG/EMG עד ש מצב השינה ישתנה להתעוררות. כאן מיוצגים עקבות EEG / EMG לפני ואחרי גירוי תמונה במהלך שינה תנועת עיניים לא מהירה מוצגים. EEG במתח גבוה ותדר איטי ללא אותות EMG, מייצג שינה לא מהירה בתנועת העין.
גירוי צילום עורר מעבר חריף ערנות כשתי שניות לאחר גירוי channelrhodopsin-2 הבעת עכברים תוך כדי שליטה עכברים לא להדגים את המעבר הזה, מה שמרמז כי עירור של נוירונים BNST גאבא במהלך שינה לא מהירה בתנועה העין מפעילה אינדוקציה מהירה של ערנות. לעומת זאת, גירוי צילום במהלך שינה תנועת עיניים מהירה לא הייתה השפעה ולכן אפקט המעבר הופיע רק בשנת תנועת עיניים לא מהירה. חשוב לדאוג לתיאום מדויק של הזרקת הנגיף וצעדי השתלת סיבים אופטיים.
עקבות EEG / EMG שנתפסו במהלך ניתוח השינה ניתן להשתמש כדי להעריך את ההשלכות של מניפולציה תמונה על מצבים ערניים שונים בעכברים. טכניקה זו גם תעזור לנו לזהות רכיבים ומעגלים אחרים המעורבים בוויסות מצבי ערנות השינה. השתמש משקפי מגן כדי למנוע נזק לייזר לעין הקפד תמיד autoclave לעקר את מיכל וקטור וירוס הקשורים אדנו לאחר השימוש.
