We thank Cora H&#252;bner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.

윤리 문 : 모든 실험 절차는 연구에 동물의 사용에 대한 EU 지침에 따라이었고, 지역 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 (Regierungspräsidium 튀빙겐, 바덴 뷔 르템 베르크, 독일의 상태) 튀빙겐 대학에 대한 책임. 1. 정위 주입 절차 <ol><li> 멸균기를 사용하여 멸균 도구 (가위, 메스, 클램프, 드릴, 바늘, 봉합 재료)를 준비합니다. 이러한 무균 수술 드레이프에 멸균면 교환, 소독, 멸균 인산 완충 식염수 (PBS, pH를 7.4), 및 H 2 O 2와 같은 살균 도구 및 기타 필요한 솔루션 및 수술 용품을 정리하십시오. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 수평 미세 전극 풀러에 3 mm 폭 상자 필라멘트를 사용하여 주사에 대한 유리 Micropipette과 (그림 1A, 삽입)을 당깁니다. 주 : 깊은 주사제, 전극 테이퍼가 충분히 있어야복부 대부분의 좌표에 도달 할 길이 (약 5mm;. 좌표를 들면, 1.10 참조). </li><li> 프리믹스 바이러스 솔루션의 1 μL 멸균 PBS에서 0.1 % 빠른 그린 솔루션의 0.2 μL (유리 피펫의 솔루션의 더 나은 가시성). 좋은 팁 (그림 1A, 삽입)와 마이크로 리터 피펫을 사용하여 바이러스 솔루션과 빠른 녹색의 혼합물로 유리 피펫을 입력합니다. 참고 : 재조합 아데노 관련 바이러스 성 벡터 (rAAV)와 협력은 바이오 안전성 레벨 1 (BSL 1) 작업으로 간주하고 BSL (1) 실험실에서 수행 될 필요가있다. 이 연구 (그림 1C)에 사용 rAAVs이 있었다 : 1) mPFC : rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (혈청 형 2/9) (16) 2) MGM / PIN : rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (혈청 형 2/9) (23); 3) mpITC / BLA : rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (혈청 형 2/1) (23) </li><li> 작은 동물의 마취 기계 (: 유도 산소 3 % 아이소 플루 란)를 사용하여 마우스를 마취. 참고 :이 연구에 사용 된 마우스를 4이었다 -7 주 다음과 같은 균주 및 유전자형 (도 2A 및 3A-D에서 실험) C57BL6 / J 야생형; GAD67-GFP (24) (도 2b 및 3E-H의 실험); Tac2-Cre 호텔 (25) (도 2C 및 3I-J에서 실험). </li><li> 귀와 눈 사이의 머리를 면도. 면봉을 사용하여 면도 헤드 살균제 (기반 프로 비돈 요오드)를 적용합니다. </li><li> 마취 동안 눈의 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. 피하 진통로 (멜 록시 캄 계, 0.1 ml의 5 ㎎ / ㎖ 용액)를 주입 마우스. </li><li> (: 유지 보수를 위해 산소의 2 % 아이소 플루 란) 정위 프레임 (그림 1A)에 마우스를 올려 놓고 가스 마취 마스크를 통해 마취를 유지한다. 계속하기 전에 사지 철수 반사를 사용하여 마취 깊이를 확인합니다. 참고 : 전체 수술시 무균 조건뿐만 아니라 수를 유지; 일회용 안면 마스크를 착용, 수술 이동, 장갑 WN. </li><li> 가위를 사용하여 머리의 상단에 피부 절개를합니다. 부드럽게 H 2 O 2와 두개골 표면, 청소 두개골을 노출 클램프로 고정, 무딘 집게를 사용하여 옆으로 피부를 당기십시오. </li><li> 두 반구 (그림 1B)에 대한 좋은 팁 영구 마커 및 드릴 구멍을 사용하여 두개골에 마크 주사 부위. mPFC :이 연구에서 주사 (브레 그마 (mm)에서)입니다 좌표 전방 1.9, 0.3 ± 측면, 복부 2.1; MGM / PIN : 1.8 ± 측면, 3.0 뒤, 복부 3.8; mpITC / BLA : 3.35, 및 4.75 복부 ± 측면, 1.45 후방. </li><li> 가압 주입 장치에 접속 정위 프레임에 채워진 유리 피펫 마운트 정수리 위치로 피펫을 가져온다. </li><li> 미세 스트레이트 팁 집게를 사용하여 유리 피펫의 팁을 끊다. 바이러스 솔루션의 에어로졸 발생을 방지하기 위해 부드럽게이 작업을 수행합니다. 피펫 팁 몇 압력 펄스를 적용하고 비루 한 방울의 압출을 관찰하여 열려 있는지 확인합니다의 솔루션입니다. </li><li> 원하는 주입 좌표로 이동하여 압력 분사 장치에서 다음 설정을 사용하여 피펫 콘텐츠 (~ 0.5 μL)의 절반을 주입 : 압력 : 20 psi의 평균 펄스 길이 : 30 밀리 초, 펄스의 평균 : 50. </li><li> 를 후퇴 천천히 (1mm / 분) 전 ~ 1 분 동안 장소에서 피펫을 둡니다. 참고 : 확인 피펫 다른 반구에 같은 피펫 절차를 반복하기 전에 차단되지되어 있는지 확인합니다. 차단 된 팁의 경우 청소하거나 다시 브레 그마에 팁과 제로 피펫 위치를 끊다. </li><li> PBS (산도 7.4) 청소 두개골, 부드럽게, 클램프를 제거 함께 피부를 당겨, 개별 버튼 봉합과 절개 봉합 (3-4 노트). 상처 주위에 살균제 (기반 프로 비돈 요오드)를 적용합니다. </li><li> 마취를 중지하고 완전히 깨어 때까지 무인 마우스를 두지 마십시오. 단일 보관되어 유지 또는 완전히 회복 만 다른 동물의 회사에 반환합니다. 수술 후는 건강 상태를 지속적으로 모니터링하고, adminis터 진통 필요한 경우. 지역 동물 관리 및 사용위원회가 제시 규칙에 따라 절차를 따르십시오. </li></ol> 급성 조각 2. 준비 <ol><li> ACSF, 절단 솔루션, 도구 (가위, 메스, 집게, 주걱, 파스퇴르 피펫), 한천 블록을 준비합니다. 참고 : 인공 뇌 - 척수 (ACSF)의 1 L 실험마다 필요하며, 이전에 16,23을 발표 한 두 번 증류 H 2 O에 화학 물질을 용해시켜 제조한다. 절단 용액을 2 M 황산 원액 0.87 ㎖로 ACSF 200 ㎖를 보충하여 제조된다. </li><li> 네이트 ACSF와 95 % O 2 5 % CO 2와 실험을 통해 절단 솔루션입니다. </li><li> 깊이 이소 플루 란을 이용하여 작은 동물 마취기 (산소 3 %)를 사용하여 마우스를 마취. 계속하기 전에 사지 철수 반사를 사용하여 마취 깊이를 확인합니다. </li><li> 큰 가위를 사용하여 마우스를 목을 벨 즉시 진정얼음처럼 차가운 절단 솔루션에 머리. </li><li> 꼬리에서 주동이와 하나의 중간 선 절개를 엽니 다 두개골 부드럽게 집게를 사용하여 측면에 두개골 조각을 밀어 넣습니다. 빠르게 부드럽게 작은 둥근 주걱을 사용하여 두개골 밖으로 들어 올려 머리를 제거합니다. 메스와 소뇌를 잘라. 얼음처럼 차가운 절단 솔루션에 머리를 놓습니다. </li><li> mPFC 주입 사이트 (mPFC 포함) 메스를 사용하여 뇌의 앞쪽 부분을 잘라 슬라이스 때까지 얼음처럼 차가운 절단 솔루션에 넣어. </li><li> 여과지로 과잉의 절단 용액을 제거하고 vibratome 스테이지 상 뇌의 후방 부를 접착제. </li><li> 기울어 진 편도 슬라이스를 들어, 35 ° 각도 (그림 1D, 중간)에 한천 블록 (4 %) 인하에 뇌 접착제. 관상 편도 조각, MGM / PIN 주입 사이트 및 mPFC 주입 사이트의 경우 (그림 1D가, 왼쪽 및 오른쪽) 무대에서 직접 뇌를 붙입니다. 슬라이스 동안 안정성을 위해 뇌 뒤에 추가 한천 블록을 배치합니다. </li><li> PLAC냉각 장치를 사용하여 39 ° C로 유지 빙냉 산소 절단 용액 챔버 절삭 E 단계. 사파이어 블레이드를 사용하여 편도체 (320 μm의)의 급성 슬라이스를 준비합니다. 실온에서 산소 ACSF와 함께 제공되는 인터페이스 챔버에서 슬라이스를 놓습니다. </li><li> 45 분 - 급성 편도 조각의 준비를 한 후, 35 조각을 복구하기 위해 36 ° C에서 수조의 인터페이스 챔버를 배치합니다. 이어서, RT에 인터페이스 챔버를 반환한다. 이 조각에서 녹화를 들어, 단계 3.2를 진행합니다. </li><li> 급성 편도 슬라이스 (- 2.9 2.8 단계)에 대해 전술 한 바와 같이 단계 2.10의 시작 동안, 주사 부위의 조각을 잘라. 수조에서 조각의 복구는 여기에 필요하지 않습니다. 선택 사항 : 빠르게 주사 부위의 위치를​​ 추정 형광등 적절한 필터 세트를 구비 입체경에 조각을 관찰. </li><li> 이 필터 서류 및 submer 사이를 끼워 혹 사후 분석을 위해 주사 부위를 포함하는 슬라이스를 수정PBS 용액에서 O / N의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에서 그들을 카. 주사 부위의 분석을 위해 단계 4.1를 진행합니다. </li></ol> 시냅스 섬유 3. 시각화 및 자극 <ol><li> 섬유와 세포의 optogenetic 활성화를위한 패치 현미경을 준비 : <ol><li> 빛 전달 경로 상에 장착 된 발광 다이오드 (LED)를 중심으로. </li><li> 후 초점면에서 470 nm의 적절한 파장을 선택하는 전력 측정기와 각 목적의 출력에서​​의 LED의 광 강도를 측정한다. </li><li> mW의 / mm 2의 빛의 세기를 계산하고 470 nm 파장에 대한 측정 값에 대한 각각의 목적에 대해 (광 출력 (MW / mm 2) 대 LED 강도 (%)) 검량선을 작성합니다. </li></ol></li><li> 형광 램프를 구비 한 수직 현미경에 장착 슬라이스 챔버 내의 인터페이스 챔버 장소에서 급성 편도선 슬라이스 검색. SLIC가 같은 조각의 위치를​​주의하십시오인터페이스 챔버 위로 향하게 E면은 상기 기록 챔버 내에서 위로 향하게된다. ~ 31 ° C의 온도에서 2 ㎖ / 분 - 1의 비율로 신선한 산소 ASCF와 슬라이스 관류. </li><li> 발현 특정 형광 단백질에 적합한 필터 세트와 함께 상기 형광 램프를 사용하여 슬라이스 내의 연접 섬유를 관찰한다. 개요 (그림 1E), 대상 지역 내의 섬유 밀도의 평가를위한 60 배 목표를 얻기 위해 5 배 목표를 사용합니다. GFP 및 YFP를 들어, 사용 필터는 지정된 mCherry는 &quot;빨간색&quot;(여진 40분의 560, 빔 스플리터 (585), 배출 70분의 630)를 설정 필터를 사용하기위한 &quot;녹색&quot;(여진 20분의 472, 빔 스플리터 (495), 배출 (490) LP)로 설정 : 참고 재료 / 장비 테이블입니다. </li><li> 열거 나 실험 (그림 2D)에 대해 원하는대로 현미경 빛의 경로에서 조리개를 제한 할 수 있습니다. </li><li> 패치 녹음을 얻으려면, 내부 솔루션 패치 피펫을 작성하고 난 마운트n 개의 전극 홀더. 패치 피펫에 긍정적 인 압력을 적용 천천히 미세 조작기를 사용하여 슬라이스로 시각적 통제하에 먼저 목욕 솔루션으로 다음을 낮 춥니 다. <ol><li> 측면과 상단에서 패치 피펫 관심의 신경 세포에 접근. 피펫 (세포 표면에 딤플 표시) 세포의 표면 상에있을 때 양의 압력을 해제하고 부압을 적용하여 &quot;기가 시일&quot;를 얻었다. </li><li> 전 세포 기록을 얻기 위해, 막 패치 파열 상기 흡입을 적용한다. 이어서, 셀의 전기 응답을 기록하는 동안 CHR (470 나노 미터)를 활성화시키기위한 적절한 파장을 사용하여 접속 된 LED 표지 섬유를 자극한다. </li><li> 시냅스 자극 낮은 LED 휘도 시작하여 원하는 시냅스 전류 진폭에 도달 할 때까지 증가한다. 상기 타이밍 펄스 길이를도에서 (예를 제어하기 위해 상기 데이터 수집 소프트웨어에 디지털 출력을 구성하여, LED 트리거3). 주의 : 다른 소프트웨어 및 / 또는 TTL 발생 장치는 LED 트리거 할 수있다. </li></ol></li><li> 및 / 또는 특정 약물의 존재 하에서 그 다음에 기록 된 셀에 대한 원하는 현미경 광 통로의 개방 또는 제한 개구 (단계 3.4)을 반복 자극. </li><li> 기록 후,이 필터 종이 사이를 사이에두고 4 % PFA O / N에서 그들을 잠수하여 혹 사후 분석을위한 슬라이스를 수정합니다. </li><li> 전기 생리 데이터를 분석 할 수 있습니다. 참고 : 사용하여 해당 소프트웨어는 각각의 자극 오프라인 기록 된 스윕 데이터를 시각화 할 수 있습니다. 약물의 효과를 분석 할 때, 모든 개별 스윕에 대한 시냅스 전류 진폭에 약물 효과의 시간 경과를 얻기 위해 피크 검출 루틴을 사용합니다. 약물의 효과는 정상 상태에 도달 할 때 결정합니다. 실험 조건 당 평균 ≥10 개별 스윕에 소프트웨어를 사용, 인물에 대한 대표적인 평균 응답을 준비하는 CF (그림 3B-D, FH, J 오른쪽 패널). 주 : 여러 대안적인 소프트웨어 패키지가 데이터 분석에 사용될 수있다. </li></ol> 사출 사이트 4. 사후 분석 <ol><li> 및 (재 이미징 단계 3.7에서, 원하는 경우) PBS에 세 번 사이트를 기록한다 (단계 2.12에서) 주사 부위의 조각을 씻으십시오. 이 반복을 10 분 동안 회전 진탕 기에서 신선한 PBS로 3 회 용액을 대체함으로써 수행된다. </li><li> PBS의 2 % 한천 솔루션을 준비하고 ~ 65 ° C로 냉각 할 수 있습니다. 작은 30mm 직경의 페트리 접시의 바닥에 평평하게 배치 조각, 한천 슬라이스를 포함하고 고체까지 냉각 할 수 있습니다. </li><li> vibratome의 무대에 내장 된 조각 또는 조각으로 한천 블록 접착제 및 PBS와 실을 절단 무대를 놓습니다. </li><li> 절제술 70 μm의 두께로 슬라이스를 포함. 옵션 : resectioning 후, 조각은 cytoarchitecture (그림 3A, C)를 공개 Neurotrace으로, 즉, 스테인드 할 수 및 / 또는 bYFP 또는 mCherry에 대한 y를 면역 형광 염색은 CHR 융합 단백질의 신호를 증폭한다. </li><li> 설치 미디어 슬라이드와 커버 슬립에 산 조각. 이미지 주사 부위와 원하는 경우, 형광 현미경 또는 공 초점 레이저 주사 현미경 (도 2A-C)를 이용하여 투영 영역에있는 섬유를 함유 또한 이미지 조각. </li></ol>

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C., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+marking+and+characterization+of+Tac2-expressing+neurons+in+the+central+and+peripheral+nervous+system.">Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system.</a> Mol Brain. 5, (2012).</li><li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission.">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> J Neurosci. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li><li>Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+modification+of+a+central+amygdala+fear+circuit.">Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit.</a> Nat Neurosci. 16 (3), 332-339 (2013).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li><li>Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLA+to+vHPC+inputs+modulate+anxiety-related+behaviors.">BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors.</a> Neuron. 79 (4), 658-664 (2013).</li><li>Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-specific+suppression+of+GABA+release+from+parvalbumin+interneurons+in+the+basolateral+amygdala+by+dopamine.">Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine.</a> J Neurosci. 32 (42), 14815-14820 (2012).</li><li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel.">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li><li>Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+and+behavioral+profile+of+multiple+glutamatergic+inputs+to+the+nucleus+accumbens.">Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens.</a> Neuron. 76 (4), 790-803 (2012).</li><li>Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity.">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li><li>Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+suppression+of+plasticity+in+amygdala+inputs+from+temporal+association+cortex+by+the+external+capsule.">Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule.</a> J Neurosci. 31 (1), 339-345 (2011).</li><li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364 (2003).</li><li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transduction+efficiency,+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1,+2,+5,+6,+8,+and+9+in+the+mouse+brain.">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), (2013).</li><li>Salegio, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+adeno-associated+viral+vectors+is+serotype-dependent.">Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent.</a> Gene Ther. 20 (3), 348-352 (2013).</li><li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala.">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neurosci. 15, (2014).</li><li>McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transduction+efficiency+of+recombinant+AAV+serotypes+1,+2,+5,+and+8+in+the+rat+nigrostriatal+system.">Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system.</a> J Neurochem. 109 (3), 838-845 (2009).</li><li>Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+channelrhodopsin-2+(ChR2)+expression+can+induce+abnormal+axonal+morphology+and+targeting+in+cerebral+cortex.">Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex.</a> Front Neural Circuits. 7, (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

이 프로토콜은 모든 경우 쉽게, 가장에 구현 될 수있는 신경 회로와 지역 연결의 생체 optogenetic 조사하는 방법을 설명은 표면 형광 빛 포트에서 LED가 ~ 470 nm의 그들을 무장하여 수직 조각 패치 클램프 기록 설정. 조각의 축삭 돌기의 optogenetic 자극의 가장 큰 장점은 해당 섬유 책자는 알려져 있지 명확하게 정의되지 않은, 또는에서 보존되지 않은 있기 때문에, 특정 활성화 및 기존의 전기 자?...

시각화 및 뇌 영역 및 신경 세포의 특정 유형과 특정 연결의 동시 활성화를위한 정확한 도구는 기능 연결 기본 건강한 뇌 기능과 질병 상태를 이해하는 데 더 중요 해지고있다. 이상적으로,이 신경 세포 통신 확인되는 정확한 시냅스 속성의 생리 학적 조사를 수반한다. 이는 단일 급성 뇌 조각에 보존 할 수없는 뇌 영역 간의 연결에 특히 사실이다. 과거에는 주로 별도 실험에서 달성되었다. 한편, 신경 추적자 주입 생체 후속 광 또는 사전 및 시냅스 파트너 전자 현미경 분석과 함께 사용되어왔다. 원래 영역에서 섬유 책자가 보존되고, 슬라이스 조제에서 액세스하는 경우 한편, 전기 자극은 대상 영역의 세포와 시냅스 통신 메커니즘을 평가하기 위해 사용되어왔다. 자신의 시각화 및 사후 해부학 적 분석 1을 허용하면서 optogenetics의 출현으로, 같은 형광 단백질에 융합 Channelrhodopsins (CHRS)와 같은 빛 문이 양이온 채널의 대상으로 표현, 지금은 신경과 축삭 궤적의 활성화를 가능하게 4. 섬유 책자가 특정 궤도를 분리하지 않거나 때문에, 1) 기존의 전기 자극에 액세스 할 수 없다는 뇌 영역에서의 입력을 평가 : 부모 인 somata 5에서 절단 할 때 CHR 발현 축색 돌기도 자극 할 수 있기 때문에 뇌 조각에서 가능하다 불명이고; 2) 명백하게 가정하지만 불완전하게 이해하고 특정 입력에 대한 기원의 영역을 식별; 3) 로컬 및 장거리 예측에 정의 된 세포 유형 사이의 기능적 연결을 조사합니다. 이 때문에 다수의 장점의 뇌 슬라이스 회로 optogenetic이 매핑은 전체되었다LY은 지난 몇 년 동안 사용하고, 형광 태그 CHRS의 발현에 대한 바이러스 벡터의 다양한 상용 공급 업체에서 쉽게 사용할 수 있습니다. 전기 자극은 또한 통로 또는 주변의 다른 세포와 똑같이 신속하고 일시적으로 정확한 자극의 섬유를 보충 할 수 있기 때문에 기존의 전기 자극을 통해 optogenetic 활성화의 일부 주요 장점으로 인해 자극 전극, 섬유 자극의 특이성의 배치로 조직에 손상이 없습니다. 또한, 바이러스 벡터의 정위 주사 용이 Cre 호텔 의존성 발현 및 / 또는 특이 적 프로모터 (7)을 이용하여 달성 될 수있는 특정 뇌 영역 (6) 조건 또는 세포 타입 특이 적 발현을 타겟팅 할 수있다. 여기,이 기술은 두려움 시스템에서 장거리의 매핑 및 로컬 회로에 적용된다. 편도체는 공포와 감정적 인 기억 8,9의 수집 및 두려움의 표현 및 저장을위한 핵심 영역이다. 외에도 이리저리편도을 해요, 내측 전두엽 피질 (mPFC)와 해마 (HC)는 왕복 편도에 연결되어있는 구조는, 공포와 멸종 메모리 10, 11의 수집, 통합 및 검색의 측면에 연루되어있다. mPFC의 하위 활동은 12, 13를 말한다 높고 낮은 두 두려움을 제어 이중 역할을 할 것으로 보인다. 이것은 부분적으로 편도체의 활동과 출력을 제어 할 편도체에 mPFC에서 직접 연결에 의해 매개 될 수있다. 따라서, 최근 몇 년 동안, 여러 연구에서 편도 14-17 mPFC 구심 특정 대상 세포와 시냅스 상호 작용을 조사하기 위해 생체 슬라이스 실험을 시작했다. 공포 학습하는 동안, 에어컨과 무조건 자극에 대한 감각 정보는 특정 시상과 대뇌 피질의 영역에서 전망을 통해 편도에 도달한다. basol의 측면 부분 (LA)에있는 뉴런이 입력의 소성ateral 편도체 (BLA)는 공포 조건화 9,18의 기초가 중요한 메커니즘이다. 증가 증거는 편도에 평행 플라스틱 프로세스가 공포 메모리 (19)를 제어 할 수 저해 요소를 포함 할 것을 제안합니다. 클러스터 억제 뉴런의 그룹은 GABA 성 중간 paracapsular 인터 셀 (mpITCs)하지만 자신의 정확한 연결 및 기능은 불완전 20-22을 알 수있다. 여기에, optogenetic 회로 매핑은 mpITCs가 시상과 대뇌 피질의 중계국 (23)에서 직접 감각 입력을받을 것으로 보여, 구 심성 및 원심성 이러한 세포의 연결 및 편도의 대상 신경 세포에 미치는 영향을 평가하는 데 사용됩니다. mpITCs 또는 BLA 뉴런에 CHR의 특이 적 발현을 효과적으로 BLA 활동을 제어하는​​ 새로운 피드 포워드와 피드백 억제 회로에 배치, mpITCs이 억제 것을 공개, 로컬 상호 작용의 매핑을 할 수 있습니다뿐만 아니라, 상호 BLA 교장 뉴런에 의해 활성화된다23.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic frame</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>51670</td>
			<td rowspan="2">can be replaced by other stereotactic frame for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steretoxic frame mouse adaptor</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>51625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia mask for mice</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>50264</td>
			<td>no longer available, replaced by item no. 51609M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure injection device, Toohey Spritzer</td>
			<td>Toohey Company, USA</td>
			<td>T25-2-900</td>
			<td>other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Fill glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments, Germany</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine, IsoFlo</td>
			<td>Eickemeyer, Germany</td>
			<td>213261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controler and heating pad</td>
			<td>FHC, USA</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal Micropipette Puller Model P-1000</td>
			<td>Sutter Instruments, USA</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75</td>
			<td>Melag, Germany</td>
			<td>08754200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-9-26973P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)&#160;</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-9-20938M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)&#160;</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-1-20298P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fast green</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>0301.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)</td>
			<td>CP Pharma, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiseptic, Betadine (providone-iodine)</td>
			<td>Purdure Products, USA</td>
			<td>BSOL32</td>
			<td>can be replaced by other disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by other analgesics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen eye ointment</td>
			<td>Bayer, Germany</td>
			<td>0191</td>
			<td>can be replaced by other eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)</td>
			<td>Nouvag, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutranox Suture Needle</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>12050-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>18020-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Recordings, light stimulation, and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td>
			<td>for composition see references #16 and #23</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>internal patch solutions</td>
			<td>for composition see references #16 and #23</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnesiumSulfate Heptahydrate</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>P027.1</td>
			<td>prepare 2M stock solution in purified water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer, Microm HM650V</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>920120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling unit for tissue slicer, CU65</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>770180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire blade</td>
			<td>Delaware Diamond Knives</td>
			<td></td>
			<td>custom order, inquire with company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope, SZX2-RFA16</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492)</td>
			<td>Lumen Dynamics Group, Canada</td>
			<td>2012-12699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch microscope, BX51WI</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp 700B patch amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitdata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PClamp software, Version 10</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to control data acquisition and stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath temperature controler, TC05</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, Germany</td>
			<td>200-100 500 0145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three axis micromanipulator Mini 25</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, Germany</td>
			<td>210-100 000 0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator controller SM7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, Germany</td>
			<td>200-100 900 7311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass capillaries for patch pipettes</td>
			<td>World Precision Instruments, Germany</td>
			<td>GB150F-8P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber&#160;</td>
			<td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td>
			<td>13006--50----ACN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED unit, CoolLED pE</td>
			<td>CoolLED, UK</td>
			<td>244-1400</td>
			<td rowspan="4">CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolLED 100 Dual Adapt</td>
			<td>CoolLED, UK</td>
			<td>pE-ADAPTOR-50E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED unit, USL 70/470</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td>L70-000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual port adapter</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td>inquire with company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set red (excitation)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F49-560</td>
			<td rowspan="3">Filters can be bought as set F46-008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (beamsplitter)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F48-585</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (emission)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F47-630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set green (excitation)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F39-472</td>
			<td rowspan="3">Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (beamsplitter)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F43-495W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (emission)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F76-490</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaserCheck, handheld power meter</td>
			<td>Coherent, USA</td>
			<td><a>1098293</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgorPro Software, Version 6</td>
			<td>Wavemetrics, USA</td>
			<td></td>
			<td rowspan="2">for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuromatic suite of macros for IgorPro</td>
			<td><a href="http://www.neuromatic.thinkrandom.com/">http://www.neuromatic.thinkrandom.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Post hoc analysis of injections and projections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde powder (PFA)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>0335.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N-21479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar-agar for embedding and resectioning</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 x 10 mm petri dishes for embedding</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides, Super Frost</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>61303802</td>
			<td>alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>3000302</td>
			<td>alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vecta Shield mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories, USA</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>alternative mounting media can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation</td>
			<td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td>
			<td>11406--25------N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices

Optogenetic 방법이 널리 빛에 의해 빛 활성화 단백질과 신경 활동의 후속 조작의 대상으로 표현을 결합하여 신경 인구 및 회로의 기능을 연구하는 데 사용됩니다. Channelrhodopsins (CHRS)는 빛 문이 양이온 채널이며 형광 단백질에 융합 할 때 자신의 표현은 시각화 및 특정 세포 유형의 동시 활성화와 뇌의 정의 된 영역에서의 축삭 돌기 수 있습니다. 바이러스 벡터의 정위 주사 통해 CHR 융합 단백질을 구성 적 또는 조건 적으로 정의 된 뇌 영역의 특정 세포에서 발현 될 수 있고, 자신의 축삭 돌기이어서 뇌 조각의 생체 optogenetic 활성화를 통해 해부학 적 및 기능적으로 연구 될 수있다. 종래의 전기 자극 방법으로 해결 될 수없는 시냅스 연결의 특성을 이해하는 것을 목표로 할 때, 또는 새로운 원숭이를 식별하는데 특히 중요임대 및 이전에 제대로 이해하고 원심성 연결. 여기 몇 가지 예는이 기술이 편도체에 공포 관련 회로를 해명에 이러한 질문을 조사하기 위해 적용 할 수있는 방법을 보여줍니다. 편도체는 공포와 감정적 인 기억의 수집 및 두려움의 표현 및 저장을위한 핵심 영역이다. 증거의 많은 라인은 내측 전두엽 피질 (mPFC)이 두려움 수집 및 멸종의 다양한 측면에 참여하지만, 편도선과의 정확한 연결은 단지 이해되기 시작하는 것이 좋습니다. 생체 활성화 optogenetic 편도는 기저 (BLA)에 mPFC 구심과 목표 셀 간의 통신 시냅스의 양상을 연구하기 위해 사용하는 방법 먼저, 도시된다. 또한,이 생체 optogenetic 접근법 편도선에 GABA 성 뉴런의 그룹을 사용하여 신규 접속 패턴을 평가하기 위해 적용 할 수있는 방법을 도시하고, 예로서 paracapsular 인터 셀 클러스터 (mpITC).

이 섹션에서는 감각과 조절 성 BLA에 대한 장기 계획과 mpITC 신경 세포뿐만 아니라 mpITC와 BLA 사이의 로컬 연결의 속성의 생리 학적 특성을 조사하기 위해 체외 optogenetic 접근 방법과 다른 실험적인 전략에서 대표적인 결과의 워크 플로우를 보여줍니다. 마우스의 뇌에 원하는 좌표 선택된 바이러스 벡터의 정위 주사 후 <s...

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Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부

Optogenetic 방법이 널리 신경 활동을 조작하고 뇌 기능에 대한 영향을 평가하기 위해 사용된다. 여기서, 기술은 광학 활성 Channelrhodopsin의 생체 내 발현에 두려움 관련 회로의 특정 장거리 및 지역 신경 연결의 시냅스 속성의 생체 분석을 위해 수 있다는 설명이다.

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

15.8K 조회수.  University of Tuebingen.  Optogenetic 방법이 널리 신경 활동을 조작하고 뇌 기능에 대한 영향을 평가하기 위해 사용된다. 여기서, 기술은 광학 활성 Channelrhodopsin의 생체 내 발현에 두려움 관련 회로의 특정 장거리 및 지역 신경 연결의 시냅스 속성의 생체 분석을 위해 수 있다는 설명이다. 

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Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

연구

신경과학

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

뇌 슬라이스 바이오 티 닐화 :<em&gt; 전의 VIVO</em성인 뉴런에서 지역 고유의 플라즈마 막 단백질 인신 매매를 측정하는&gt; 접근

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

동시<em&gt; 생체</em두 망막의&gt; 기능 테스트로<em&gt; 생체</em&gt; 전위도 시스템

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding diseases, and future therapies hinge on fundamental understandings about how different retinal cells function normally. Gaining such information with biochemical methods has proven difficult because contributions of particular cell types are diminished in the retinal cell milieu. Live retinal imaging can provide a view of numerous biological processes on a subcellular level, thanks to a growing number of genetically encoded fluorescent biosensors. However, this technique has thus far been limited to tadpoles and zebrafish larvae, the outermost retinal layers of isolated retinas, or lower resolution imaging of retinas in live animals. Here we present a method for generating live ex vivo retinal slices from adult zebrafish for live imaging via confocal microscopy. This preparation yields transverse slices with all retinal layers and most cell types visible for performing confocal imaging experiments using perfusion. Transgenic zebrafish expressing fluorescent proteins or biosensors in specific retinal cell types or organelles are used to extract single-cell information from an intact retina. Additionally, retinal slices can be loaded with fluorescent indicator dyes, adding to the method&#39;s versatility. This protocol was developed for imaging Ca2+ within zebrafish cone photoreceptors, but with proper markers it could be adapted to measure Ca2+ or metabolites in M&#252;ller cells, bipolar and horizontal cells, microglia, amacrine cells, or retinal ganglion cells. The retinal pigment epithelium is removed from slices so this method is not suitable for studying that cell type. With practice, it is possible to generate serial slices from one animal for multiple experiments. This adaptable technique provides a powerful tool for answering many questions about retinal cell biology, Ca2+, and energy homeostasis.

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Imaging retinal tissue can provide single-cell information that cannot be gathered from traditional biochemical methods. This protocol describes preparation of retinal slices from zebrafish for confocal imaging. Fluorescent genetically encoded sensors or indicator dyes allow visualization of numerous biological processes in distinct retinal cell types.

Ex Vivo 실험 이미징에 대 한 성인 제 브라에서 준비 신선한 망막 조각

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic 쥐 행동에 Hippocampal 세타 진동의 유입

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Neurodegeneration Ex Vivo 쥐 두뇌 분할 영역을 사용 하 여 기본 이벤트를 공부 하는 양자 택일 접근

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 (ChR2), is expressed by a virus vector in a particular type of neuronal cells in various Cre-driver mice. Activation of these opsins is triggered by application of light pulses which are delivered by laser or LED through optic cables, and the effect of activation is observed with very high time resolution. Experimenters are able to acutely stimulate neurons while monitoring behavior or another physiological outcome in mice. Optogenetics can enable useful strategies to evaluate function of neuronal circuits in the regulation of sleep/wakefulness states in mice. Here we describe a technique for examining the effect of optogenetic manipulation of neurons with a specific chemical identity during electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) monitoring to evaluate the sleep stage of mice. As an example, we describe manipulation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis (BNST). Acute optogenetic excitation of these neurons triggers a rapid transition to wakefulness when applied during NREM sleep. Optogenetic manipulation along with EEG/EMG recording can be applied to decipher the neuronal circuits that regulate sleep/wakefulness states.

Here, we describe methods of optogenetic manipulation of particular types of neurons during monitoring of sleep/wakefulness states in mice, presenting our recent work on the bed nucleus of the stria terminalis as an example.

마우스에서 수면/각성 상태를 모니터링하는 동안 신경 회로의 광유전학 적 조작

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부

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