그들의 기술 지원 및 임상 샘플 처리에 대 한 우리 감사 수잔 달리기 라 스무 센 및 Solvej Kolbjørn 젠 슨. 이 프로젝트는 혁신적인 의학 이니셔티브 2 공동 사업 보조금 계약 N ° 115843 아래에서 자금을 받고 있다 EbolaMoDRAD 컨소시엄의 일부입니다. 이 공동 사업 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램 EFPIA에서 지원을 받습니다.

생명 의학 연구 윤리 위원회, 수도권은 동의 그리고 여기에 설명 된 모든 방법을 분석 결과 개발 프로젝트에 덴마크 법률에 따라 윤리 위원회 시스템에 의해 검토에서 제외 된.
1. 바이러스 비활성화 및 빠른 나 추출을 위한 혈액 컬렉션 진공관의 준비
주의:이 프로토콜에 사용 되는 버퍼 guanidinium 안산 (GITC)과 비 이온 계면 활성 제, irritants을 포함 되어 있습니다. 적절 한 실험실 안전 조치, 흐름 후드를 사용 하 고 그것을 취급할 때 장갑을 착용. 어떤 피부와 눈 접촉을 피하십시오. 버퍼를 유출 하는 경우 오염 된 표면 해야 합니다 절대 소독 되어야 chloramine 또는 염소 ("표 백제"의 활성 성분)와 직접이 혼합물 독성 시안 화물의 형성으로 이어질 수 있기 때문에. 첫째, 흡수 성 조직으로 유출된 버퍼를 닦아냅니다. 다음, 물, 그리고 70% 에탄올으로 표면 청소 하 고 마지막으로, chloramine 또는 염소를 사용 합니다.
<ol><li>준비 하려면 혈액 컬렉션 진공관, 25 G x 1 바늘과 3 mL 주사기를 사용 하 여 튜브의 뚜껑을 puncturing 의해 특정 상업 세포의 용 해 버퍼의 1.6 mL 4 mL EDTA 진공 튜브로 주사. 참고: 진공 튜브의 뚜껑을 제거 하지 마십시오. 진공 유지 되어야 합니다.</li>
	<li>실 온에서 버퍼 사용까지 포함 된 진공 튜브를 저장 합니다. 참고: 튜브는 적어도 1 년의 준비 후 안정.</li>
</ol>2입니다. 나 추출에 대 한 버퍼의 준비
<ol><li>나 추출에 대 한 버퍼를 준비 하려면 랙에서 두 1.8 mL, 두 4.5 mL, 그리고 한 3.6 mL 튜브를 배치 합니다.</li>
	<li>Pipetting, 960 µ L 자석 유리 입자 (MGPs) 깨끗 한 1.8 mL 튜브와 라벨이 MGPs. 그것은 그것을 pipetting 전에 완전히 MGP 정지를 Resuspend 하 여 추가 합니다. 참고:는 MGPs는 튜브의 하단에 신속 하 게 수집 하는 경향이 있다.</li>
	<li>Pipetting, 워시 버퍼의 4 mL 나 깨끗 한 4.5 mL 튜브에 의해, 추가 하 고 WB-1로 그것을 분류. 주의: 워시 버퍼 나 자극성은 guanidinium 염화를 포함 합니다. 적절 한 실험실 안전 조치, 흐름 후드를 사용 하 고 그것을 취급할 때 장갑을 착용. 어떤 피부와 눈 접촉을 피하십시오.</li>
	<li>워시 버퍼 II 깨끗 한 3.6 mL 튜브 1.5 mL를 pipetting에 의해 추가 하 고 WB 2로 그것을 분류.</li>
	<li>Pipetting, 여 깨끗 한 4.5 mL 튜브에 워시 버퍼 III의 3 mL를 추가 하 고 레이블을 WB-3로.</li>
	<li>깨끗 한 1.8 mL 튜브에 차입 버퍼의 100 µ L pipetting으로 추가 하 고 레이블을 EB로.</li>
	<li>사용 될 때까지 실 온에서 aliquoted 버퍼를 저장 합니다. 참고: 튜브는 그들의 준비 후 적어도 1 달 동안 안정.</li>
</ol>3. 바이러스 감염의 징후와 증상을 가진 환자에서 혈
주의: 환자에서 전체 혈액을 수집 하는 때 적절 한 실험실 안전 조치를 취할. 장갑과 안경 착용. 환자 격리에서는, biosafety 수준 4 절차를 따르시기 바랍니다.
<ol><li>환자에서 정 맥 전 혈을 수집 작은-내경 확장 튜브와 나비 바늘과 혈액 컬렉션 진공관 포함 하는 세포/바인딩 버퍼를 사용 합니다. 하향 위치에 환자의 팔을 휴식 하 고 컬렉션 튜브 나비 바늘 보다 낮은 위치. 환자의 정 맥에 나비 바늘을 삽입 하 고 작은-내경 확장 혈액 컬렉션 진공관을 연결할. 참고: 이것은 역류를 방지 합니다.</li>
	<li>혈액 수집 후 5-10 시간 튜브를 틀 지 하 여 튜브의 내용을 혼합. 참고: 포함 하는 세포/바인딩 버퍼의 1.6 mL 혈액 컬렉션 튜브에 남아 있는 진공으로 인해 수집 된 샘플의 볼륨 자동으로 됩니다 1.6 mL.</li>
	<li>70% 에탄올을 사용 하 여 튜브의 외부를 소독.</li>
	<li>실 온에서 20 분 동안 튜브를 품 어. 참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다 및 전체 혈액 컬렉션 튜브-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C 또는 적어도 1 달7에 대 한 37 ° C에 저장 될 수 있다.</li>
	<li>단순화 된 나 추출 방법에 직접 계속.</li>
</ol>4. 간단 하 게 전체 혈액의 나 추출
<ol><li>세포/바인딩 버퍼 비활성화 수집 된 혈액, 믹스에서에서 나를 정화 진공을 틀 지 하 여 튜브의 내용을 손으로 5-10 x 튜브.</li>
	<li>신중 하 게 튜브의 뚜껑을 제거 하 고 뚜껑을 방전.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브에 직접 MGPs (1 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.</li>
	<li>샘플 포함 된 튜브에는 사용 하지 않는 혈액 컬렉션 튜브에서 새로운 뚜껑을 장소.</li>
	<li>튜브 긴밀 하 게 폐쇄 확인 혈액 컬렉션 튜브가 손으로 5-10 시간 틀 지 하 여 튜브의 내용을 혼합을 뚜껑에 손가락을 놓습니다.</li>
	<li>자석 홀더에 튜브를 놓고 튜브 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 유지 합니다.</li>
	<li>모든 MGPs는 자석으로 튜브의 측면에서 수집 되도록 손으로 튜브와 함께 자석 홀더는 몇 번을 플립. 참고: 자석 홀더는 길쭉한 자석 및 고무 밴드를 교체할 수 있습니다.</li>
	<li>튜브의 뚜껑을 제거 하 고 일회용 피 펫을 사용 하 여 또는 단순히 50 mL 수집 튜브에 내용을 붓는 하 여 튜브의 내용을 삭제 합니다. 참고: 튜브 뚜껑을 닫아서 50 mL 수집 튜브에서에 어로 졸을 피하십시오.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브에 직접 WB-1 (4 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.</li>
	<li>관에 뚜껑을 배치 하 고 튜브 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 놓습니다.</li>
	<li>자석 홀더, 뚜껑을 손가락으로 안전 하 게 강화 유지에서 튜브를 제거 합니다. 참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브를 내리고 손으로 5-10 시간 여를 MGPs resuspend.</li>
	<li>4.6 4.8 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브에 직접 WB-2 (1.5 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.</li>
	<li>관에 뚜껑을 놓고 자석 홀더에서 튜브를 제거 합니다. 참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서.</li>
	<li>튜브는 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 놓습니다.</li>
	<li>MGPs는 손으로 몇 초 동안 혈액 컬렉션 튜브를 내리고 여 resuspend.</li>
	<li>4.6 4.8 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브에 직접 WB-3 (3 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.</li>
	<li>관에 뚜껑을 놓고 자석 홀더에서 튜브를 제거 합니다. 참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서.</li>
	<li>튜브는 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 놓습니다.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브를 내리고 손으로 5-10 시간 여를 MGPs resuspend.</li>
	<li>4.6 4.8 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>EB의 준비 된 약 수를 부 어 (100 µ L) 혈액 컬렉션 튜브에 직접.</li>
	<li>관에 뚜껑을 놓고 자석 홀더에서 튜브를 제거 합니다. 참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브 5-10 배는 손가락으로 두 드려서는 MGPs는 EB에 resuspend. 참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다, 그리고 튜브-20 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	<li>Resuspended MGPs의 1.5 mL 일회용 피 펫 (모든 다운스트림 진단 나 증폭 시험 램프/RT-램프 또는 정량/RT-정량 분석을 사용할 수 있습니다와 같은)를 사용 하 여 다운스트림 나 증폭 반응 혼합 한 방울 (5-8 µ L)를 전송. 참고: NAs는 MGPs에 충실, 다운스트림 나 증폭 반응에는 MGPs를 사용 해야 됩니다. 혼합 사용 하기 전에 MGP 정지. 혼합 후, MGPs는 튜브의 아래쪽에 수집 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 보고서에서 우리는, 신속, 안전 하 고 간단한 수동 침대 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 다운스트림 분자 검출에 대 한 설명합니다. 직접 세포/바인딩 버퍼 (자료 테이블)7를 포함 하는 진공 혈액 컬렉션 튜브에 수집 된 전체 혈액 샘플에 수행 되어야 할 설명된 나 추출 방법 개발 되었다. 이 특정 버퍼 EBOV7 생긴...

바이러스 발생 상황에서 환자 병원 격리 병 동 또는 때 빠른 진단이 필요 하 고에 수감 되는 때, 간단 하 고, 안전 하 고 정확한 포인트의 케어 분자 진단 환자 관리 및 위험 포함에 대 한 필수적입니다. 에볼라 바이러스 (EBOV) 서 부 아프리카 (2013) 및 남미 (2015), Zika 바이러스의 2 개의 최근 바이러스 발생, 향상 된 관리 포인트 분자 진단 테스트, 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 등에 대 한 관심 증가 증폭 (RT-램프)1,2 , recombinase 중 합 효소 증폭 (RPA)3,4. RT-램프와 RPA는 단순화 된 샘플 준비에 수행할 수 있는 빠른, 민감한, 그리고 특정 분자 테스트. Zika 바이러스에 대 한 실시간 램프는 측면 흐름 분석 결과 (LFA), 30 분1; 내 정화 비 전체 혈액 샘플에서 Zika 바이러스를 검출할 수 있는 결합 되었습니다. 그러나, 위험 그룹 4 병원 체로 분류 되는 매우 전염성이 EBOV 샘플 biosafety 아래 처리 될 필요 레벨 4 (BSL-4) 조건 및 안전 진단 절차를 수행할 수 있습니다 전에 비활성화.
단순화 된 비활성화 방법 EBOV, 샘플2,3,,45에 세포의 용 해 버퍼의 추가 같은 발발; 하는 동안 사용 되었다 그러나, 이러한 방법을 BSL-3 biosafety 캐비닛, 원심 분리기, 난방 블록 및 펫, 최소한 같은 실험실 장비와 BSL-4 조건 하에서 처리를 해야합니다. 이 장비는 격리 병 동에 또는 필드 병원에 일반적으로 존재. 이 문제를 해결 하려면 시도에 가방3, 진단 수행 되었습니다 되며 여러 휴대용 장치 및 기계 개발 [예를 들어, (나) 핵 산 추출에 대 한 휴대용 장치]6. 그러나, EBOV 긍정적인 샘플 여전히이 장치를 사용할 수 있습니다 비활성화 될 필요 합니다.
우리가 이전에 보고 된 EBOV7, Vaccinia 바이러스 및 Cowpox 바이러스8 에 대 한 신속한 머리 맡 바이러스 비활성화 방법 상업 세포/바인딩 버퍼의 추가 의해 일반 진공 혈액 컬렉션 튜브를 직접 허용 양도 혈액 환자에서 비활성화 버퍼7에. 어떤 엄격한 봉쇄, BSL-4 조건7, 등을 사용 하 여 샘플 처리에 대 한 필요성을 제거 하는 닫힌된 시스템에서이 직접적이 고 즉각적인 비활성화 하 고 샘플 정상적인 BSL-2 조건 하에서 처리 될 수 있습니다. 이 비활성화 방법은 여러 나 추출 시스템, 로봇 등 손 정화 키트7;와 호환 그러나, 이러한 방법은 항상 병원 격리 병 동 내부 또는 필드 설정에 존재 하지 않는 로봇, 원심 분리기, 전기, 등 실험실 장비가 필요 합니다.
이 보고서에서 우리는, 신속, 안전 하 고 단순화 된 수동 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 후속 분자 검출에 대 한 설명합니다. 나 추출 방법에는 어떤 장비의 자석/자석 홀더 필요 하지 않습니다. 아니 원심 분리기, 블록, 또는 전기 난방 나 추출 필요 합니다. 따라서,이 방법은 실험실 시설에 의존 하지 않습니다 하 고 쉽게 될 수 있다 (예를 들어, 필드 병원, 병원 격리 병 동, 또는 낮은 리소스 설정을) 어디서 나 사용할. 나 추출 방법 신속 하 고 간단 하 고 모든 다운스트림 나 테스트, 정량, 실시간 정량, 램프, 또는 RT 램프 등에서 직접 사용할 수 있습니다. 이 나 추출 방법은 램프와 휴대용 배터리 구동 등온선 악기와 결합 하면 머리 맡 진단 혈액 컬렉션의 40 분 이내 얻어질 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>368861</td><td></td></tr><tr><td>Plus Blood Collection</td><td>Becton Dickinson</td><td>362725</td><td></td></tr><tr><td>23G x 1 needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>LUER LOK syringe (3 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309658</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly needle with small-bore extension tubing</td><td>J&amp;oslash;rgen Kruuse A/S</td><td>121714</td><td></td></tr><tr><td>1% Virkon</td><td>Nomeco A/S</td><td>849265</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>03246752001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>3038505001</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379189</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379146</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag&amp;trade;-5 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette (3.5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade; Samco&amp;trade; Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade; Nunc&amp;trade; 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples

감염의 급속 한 진단 발발 관리, 위험 봉쇄, 그리고 환자 치료를 위해 필수적 이다. 우리 이전 진공 혈액 컬렉션 튜브에 직접 상업 세포/바인딩 버퍼를 추가 하 여 안전한 핵 산 (나) 테스트를 위한 혈액 샘플링 동안 에볼라 바이러스의 급속 한 머리 맡 비활성화 하는 방법을 나타났습니다. 이 침대 비활성화 접근을 사용 하 여, 신속, 안전 하 고 단순화 된 머리 맡 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 후속 검색에 대 한 개발 했습니다. 나 추출 혈액 컬렉션 튜브에서 직접 수행 하 고 아무 장비 또는 전기를 요구 한다.
혈액 세포/바인딩 버퍼에 수집 후 내용을 손으로 튜브를 틀 지 하 여 혼합 하 고 혼합물은 실 온에서 20 분 동안 알을 품을. 자석 유리 입자 (MGPs) 튜브에 추가 되 고 내용을 손으로 컬렉션 튜브를 틀 지 하 여 혼합 됩니다. MGPs는 다음 자석 홀더 또는 자석 및 고무 밴드를 사용 하 여 혈액 컬렉션 튜브 측에 수집 됩니다. MGPs는 세 번 씻어 그리고 컬렉션 튜브에 직접 차입 버퍼의 추가, NAs 나 테스트, 정량 등의 반응에서 MGPs 제거 없이 등온선 루프 증폭 (램프)에 대 한 준비가. 나 추출 메서드는 모든 실험실 시설에 의존 하지 않으며 쉽게 될 수 있다 (예를 들어, 필드 병원 및 병원 격리 병 동에서) 어디서 나 사용할. 이 나 추출 방법은 램프 및 휴대용 악기와 결합 하면 진단 혈액 컬렉션의 40 분 이내 얻어질 수 있다.

여기에 제시 된 프로토콜 간단 하 고 효율적 이며 세포/바인딩 버퍼와 비활성화 전염 성 전체 혈액 샘플에 수행 되어야 할 모든 분자 분석 결과에 광범위 하 게 적용할 수 있습니다. 혈액 비활성화 및 나 추출에 대 한 워크플로 나온 그림 1혈액 컬렉션 진공관7 (그림 1A), 혈액 컬렉션7 (<strong clas...

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Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

여기, 우리는 바이러스 비활성화 전체 혈액에서 급속 한 바이러스 핵 산 추출에 대 한 프로토콜을 제시. 추출 혈액 컬렉션 튜브에 직접 수행 되 고 필요 없는 장비 또는 전기. 방법과 실험실 시설에 의존 하지 않습니다 수 있습니다 어디서 나 (예를 들어, 필드 병원에서) 사용.

전체 혈액 샘플에서 바이러스의 검출, 안전, 신속 하 고 간단한 수동 침대 핵 산 추출

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

rapid-safe-simple-manual-bedside-nucleic-acid-extraction-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.3K 조회수.  Statens Serum Institut. 여기, 우리는 바이러스 비활성화 전체 혈액에서 급속 한 바이러스 핵 산 추출에 대 한 프로토콜을 제시. 추출 혈액 컬렉션 튜브에 직접 수행 되 고 필요 없는 장비 또는 전기. 방법과 실험실 시설에 의존 하지 않습니다 수 있습니다 어디서 나 (예를 들어, 필드 병원에서) 사용.

비디오: Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

엔테로 바이러스 및 문화와 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 파트 III. RT-qPCR에 의한 바이러스 검출

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

연구

환경과학

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

면역학 및 감염병학

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. The geometry of the monolith can be adapted for specific pipette tips ranging in volume from 1.0 to 5.0 ml. The large porosity of the monolith enables viscous or complex samples to readily pass through it with minimal fluidic backpressure. Bi-directional flow maximizes residence time between the monolith and sample, and enables large sample volumes to be processed within a single TruTip. The fundamental steps, irrespective of sample volume or TruTip geometry, include cell lysis, nucleic acid binding to the inner pores of the TruTip monolith, washing away unbound sample components and lysis buffers, and eluting purified and concentrated nucleic acids into an appropriate buffer. The attributes and adaptability of TruTip are demonstrated in three automated clinical sample processing protocols using an Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR and STARplus liquid handling robots, including RNA isolation from nasopharyngeal aspirate, genomic DNA isolation from whole blood, and fetal DNA extraction and enrichment from large volumes of maternal plasma (respectively).

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. Consequently, the sample preparation format is compatible with most liquid handling instruments, and can be used for many medium to high-throughput clinical applications and sample types.

일반적인 액체 취급 로봇에 TruTip 기술을 사용하여 임상 샘플에서 DNA와 RNA의 높은 처리량, 자동 추출

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

생체공학

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

유전학

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid impingement-based air sampling devices for efficacious concentration of negatively-charged viruses from bioaerosols. Thus, the resin serves as an additional concentration step in the bioaerosol sampling workflow. Nucleic acid extraction of the viral particles is then performed directly from the anion exchange resin, with the resulting sample suitable for molecular analyses. Further, this protocol describes a custom-built bioaerosol chamber capable of generating virus-laden bioaerosols under a variety of environmental conditions and allowing for continuous monitoring of environmental variables such as temperature, humidity, wind speed, and aerosol mass concentration. The main advantage of using this protocol is increased sensitivity of viral detection, as assessed via direct comparison to an unmodified conventional liquid impinger. Other advantages include the potential to concentrate diverse negatively-charged viruses, the low cost of anion exchange resin (~$0.14 per sample), and ease of use. Disadvantages include the inability of this protocol to assess infectivity of resin-adsorbed viral particles, and potentially the need for the optimization of the liquid sampling buffer used within the impinger.

An anion exchange resin-based method, adapted to liquid impingement-based bioaerosol sampling of viruses is demonstrated. When coupled with downstream molecular detection, the method allows for facile and sensitive detection of viruses from bioaerosols.

Bioaerosols 음이온 교환 수 지를 사용 하 여 바이러스의 검출

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from clinical and biological sources. The method is unbiased and universal; it uses random primers for cDNA synthesis and requires no prior knowledge of the viral sequence content. Before library construction, selective RNase H-based digestion is used to deplete unwanted RNA &#8212; including poly(rA) carrier and ribosomal RNA &#8212; from the viral RNA sample. Selective depletion improves both the data quality and the number of unique reads in viral RNA sequencing libraries. Moreover, a transposase-based &#39;tagmentation&#39; step is used in the protocol as it reduces overall library construction time. The protocol has enabled rapid deep sequencing of over 600 Lassa and Ebola virus samples-including collections from both blood and tissue isolates-and is broadly applicable to other microbial genomics studies.

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

임상 샘플에서 RNA 바이러스의 편견 깊은 시퀀싱

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

의학

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

새로운 바이러스 게놈을 발견 감염 된 잎에서 RNA 분석 원유 Virion 추출에 DNA의 결합 분석

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food irrigation, washing, etc. The classical fecal bacteria indicator does not always check for the presence of viral pathogens so the detection of viral pathogens and viral indicators is relevant in order to adopt measures of risk mitigation, especially in humanitarian scenarios and in areas where water-borne viral outbreaks are frequent.
At present, several commercial tests allowing the quantification of fecal indicator bacteria (FIB) are available for testing at the point of use. However, such commercial tests are not available for the detection of viruses. The detection of viruses in environmental water samples requires concentrating several liters into smaller volumes. Moreover, once concentrated, the detection of viruses relies on methods such as nucleic acid extraction and molecular detection (e.g., polymerase chain reaction [PCR]-based assays) of the viral genomes.
The method described here allows the concentration of viruses from 10 L water samples, as well as the extraction of viral nucleic acids at the point of use, with simple and portable equipment. This allows the testing of water samples at the point of use for several viruses and is useful in humanitarian scenarios, as well as at any context where an equipped laboratory is not available. Alternatively, the method allows concentrating viruses present in water samples and the shipping of the concentrate to a laboratory at room temperature for further analysis.

Here we present VirWaTest, which is a simple, affordable and portable method for the concentration and detection of viruses from water samples at the point of use.

VirWaTest, 물 샘플에서 바이러스 검출을 위한 사용 시점 방법

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...