연구는 과학의 발전 및 기술 적용 연구 프로그램 단계 II 아칸소 132-053-2; 오클라호마 센터에 의해 투자 되었다 그리고 농업 특수 작물의 오클라호마 부에 의해 연구 교부 금 프로그램. 우리 감사 황 홍 진 오 생물 정보학 핵심 시설 NSF (EOS-0132534)와 NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 5P20RR15564-03)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

저자는 공개 없다.

최근 몇 년 동안에서 다양 한 방법 바이러스 유사 입자 (VLP) 또는 바이러스 특정 RNA 또는 DNA2,3,44, 풍부 하 게 포함 하는 자연 환경에서 식물 바이러스 생물 다양성 연구에 고용 되어 45,46 . 이러한 메서드는 NGS와 bioinformatic 분석 뒤. 이 연구의 목표는 재배 식물에 일반적인 질병의 인과 대리인을 찾을 했다. 질병은 비 싸여 bacilliform 입자는 565 bp 조각만 복제47는 되었습니다 알 수 없는 바이러스의 결과 보고. 이 정보는 이전 연구자 가정해 가족 내에서 Caulimoviridae Badnavirus 속에 바이러스를 할당에 대 한 충분 한 했다. 이전 보고서는 칸 나 백합에 칸 나 순 질병은이 연구에서 제시 된 metagenomics 접근을 사용 하 여 단일 badnavirus의 결과 가설 하는 동안 우리는 질병 두 미정 badnavirus 종24기인 했다 결정. 따라서, 질병의 인과 대리인을 발견 하는 metagenome 접근을 사용 하 여의 힘은 우리가 지금 상황을 식별할 수 있는 하나 이상의 원인이 있을 수 있습니다.
DNA와 RNA 시퀀싱 데이터를 결합 하는 우리의 접근 철저 한 이며 또한 결과 두 가지 방법을 사용 하 여 일관 된 결과 굴복 하 고 두 개의 관련된 바이러스의 존재를 확인을 보여 줍니다. 우리 caulimoviruses의 격리에 대 한 수정된 절차를 고용 하 고는 관련 바이러스 핵 산에 대 한 풍부한 했다 고 그 바이러스 capsid 내에서 보호 된 샘플 제작. 서비스 실험실 DNA 시퀀싱을 수행 하기로 계약 했다. 드 노 보 시퀀싱에 대 한 필수 개념은 DNA 중 합 효소는 DNA 합성의 순차적 주기 동안 서식 파일 DNA 가닥으로 뉴클레오티드를 표시 하는 형광 통합 이다. contigs 조립 뒤 NGS에 의해 생산 바이러스 contigs로 확인 된 몇 가지 contigs bioinformatic로 제출 했다. 두 바이러스 게놈10,24,,4849,50 의 추가 확인 RNA-seq 데이터 ribo 고갈 RNA 준비에서 얻은 bioinformatic 분석을 통해 얻은 것입니다. 흥미로운 결과 시퀀스의 인구 DNA와 RNA 시퀀싱 되 배워야 하나 비 바이러스 및 바이러스 핵 산의 유사한 배급 제공. DNA와 RNA 시퀀싱에 대 한 시퀀스의 < 0.5% 바이러스 기원 했다. 내 바이러스 Caulimoviridae가족에 속한 시퀀스 78-82%의 인구. DNA와 RNA 시퀀싱에서 조립된 바이러스 contigs 비교 하 여 우리는 두 개의 조립된 게놈 두 데이터 집합에서 발생 한 확인 했다.
유일한 DNA 시퀀싱을 사용 하 여 새로운 바이러스 유전자를 식별 하는 관심사 badnavirus 게놈 오픈 원형 DNA 이다. 우리는 게놈에 있는 불연속을 중첩 시퀀스 contigs에서 게놈 어셈블리에 대 한 장애물을 제시 수 있습니다 추측. DNA 시퀀싱 결과의 초기 시험 두 유사한 바이러스 게놈을 공개 했다. 우리는 이러한 게놈 중 하나는 공부 하지 않은, 종의 유전적 다양성 대표 가설 또는 공동 감염 같은 대표 두 종 공장24. 따라서, 집단 bioinformatic 분석 NGS DNA와 RNA 시퀀싱 하 여 가져온 데이터 집합의 두 개의 전체 길이 genomes의 존재의 확인을 사용할 수 있습니다.
Metagenomic 연구, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV;는 caulimovirus)3에서 DNA를 복구 하는 절차에 따라 식물 homogenates에서 VLP 및 핵 산을 추출 하기 위한 다른 방법을 개발 하는 다른 보고서가입니다. 이 방법은 식별 소설 RNA 및 DNA 바이러스 시퀀스 비 재배 식물. 재배 식물의 질병의 인과 대리인 발견이 연구에 사용 된 caulimovirus 격리 절차에서 파생 된 단계 VLP을 추출 하는 자연적으로 감염 된 식물24에서 파생 된 단계와는 달리 있습니다. 두 수정된 방법의 성공 caulimovirus 격리에 대 한 프레임 워크 절차 일반적으로 식물 바이러스의 metagenomic 연구에 대 한 귀중 한 시작 지점을 있을 수 있습니다 제안 합니다.

신흥 식 물병 드라이브 올바른 인과 에이전트를 식별 하는 새로운 도구를 개발 하는 연구원. 새로운 또는 되풀이 바이러스 질병의 초기 보고서 모자이크 및 잎 정 맥 지우기, 왜소, 시 들고, 병 변, 괴 사, 기형 같은 일반적으로 발생 증상 또는 다른 증 후를 기반으로 합니다. 질병에 대 한 인과 에이전트 다른 오염 병원 체에서 그것을 분리 하는 새로운 바이러스를 보고 하기 위한 표준 적합 한 호스트에 그것을 전파 하 고 원래 호스트 종의 건강 한 식물으로 접종에 의해 질병을 재현. 이 접근에 한계는 식물 바이러스의 많은 속 곤충 또는 다른 벡터 전송 또는 다시 원래 호스트 종에 적합 한 호스트에 대 한 의존 이다. 이 경우에, 적절 한 벡터에 대 한 검색을 연장 수, 실험실 식민지는 벡터의 설정에 어려움이 있을 수 있습니다 있으며 더 노력 실험적인 전송에 대 한 프로토콜을 고안 하는 데 필요한. 성공적인 실험실 전송 연구에 대 한 조건을 얻을 수 없는 경우 다음 작업 짧은 폭포 표준 보고 새로운 바이러스 질병. 매우 낮은 titers에 그들의 자연적인 호스트에서 발생 하는 바이러스에 대 한 연구자는 연구 수행에 대 한 충분 한 전염 성 주식을 유지 하기 위해 전파에 대 한 대체 호스트를 식별 해야 합니다. 몇 가지 식물을 감염 하는 바이러스 종에 대 한이 주식 문화1성장에 걸림돌이 될 수 있습니다.
최근 몇 년 동안, 과학자는 고용 더 자주 높은 처리량 NGS와 metagenomic 접근 알려진된 질병에 관련이 있을 수 있습니다 하지만 분류학 종과 장군에 할당 될 수 있습니다 환경에 존재 하는 바이러스 시퀀스를 밝히기 2 , 3 , 4. 발견 및 고유한 환경에서 유전 물질의 분류에 같은 접근 자연에서 바이러스 다양성 또는 특정 생태계에서 그들의 존재를 설명 하는 방법을 제공 하지만 반드시 정의 하기 위한 프레임 워크를 확인 하지 않습니다 명백한 질병에 대 한 인과 대리인입니다.
Badnavirus 속 pararetroviruses의 Caulimoviridae 가족에 속한다. 이 바이러스는 약 7 ~ 9 kb의 원형 이중 가닥 DNA 게놈을 가진 모양에 있는 bacilliform. 모든 pararetroviruses RNA 중간을 통해 복제합니다. Pararetroviruses는 episomes로 존재 하 고 복제 식물 염색체 DNA5,6의 독립. 바이러스 인구의 분야 연구는 이러한 바이러스는 유전자 복잡 한 나타냅니다. 또한, 높은 처리량 연속 식물 게놈의 범위에 걸쳐 얻은 정보 위법 통합 이벤트로 식물 게놈으로 삽입 하는 badnavirus 게놈 조각의 수많은 예제를 발견 있다. 이러한 내 생 badnavirus 시퀀스 감염7,,89,,1011와 반드시 연결 되지 않습니다. 그 후, 질병의 인과 대리인으로 새로운 badnaviruses를 식별 하는 NGS의 사용 episomal 게놈의 부분 모집단 다양성 생 시퀀스12,13의 발생에 의해 복잡 합니다.
소설 pararetrovirus 유전자의 발견에 대 한 최적의 파이프라인은, 질병에 대 한 인과 대리인으로 서 이러한 바이러스를 식별 하는 두 가지 일반적인 방법 있습니다. 1 개의 방법은 감염 된 잎에서 작은 RNA 순서에 대 한 풍부 하 고 다음 이러한 시퀀스 바이러스 genome(s)14,15,,1617를 다시 구성할 것입니다. 다른 방법은 회전 원형 증폭 (RCA) 원형 DNA 바이러스 게놈18증폭입니다. RCA의 성공 잎 및 선택한 조직에 바이러스 titer의 나이에 따라 다릅니다. RCA 제품 제한 소화를 받게 되며 직접 시퀀싱19,,2021플라스 미드로 복제.
칸 나 노란색 반점 바이러스 (CaYMV)는 badnavirus 이며, 게놈의만 565 bp 파편 이전 감염된 cannas22분리 되었습니다 비록 칸 나에 노란 반점 질병의 etiological 원인으로 설명. 현대 연구에서 Alpinia purpurata (꽃 생강; CaYMV 식별 CaYMV-Ap)23. 이 연구의 목표는 감염 된 칸 나 백합에서 완전 한 badnavirus 게놈 시퀀스를 복구 했다. 우리 공장에서 오염 물질에서 바이러스를 정화 하 고이 준비에서 바이러스 성 DNA 분리에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 DNA 도서관 NGS에 사용 하기 위해 준비. 이 방법은 중간 분자 증폭 단계에 대 한 필요가 없다. 우리 또한 RNA이 NGS, 대 한 감염 된 식물에서 mRNA를 분리 RNA-seq 포함 실시 했다 각 핵 산 준비를 사용 하 여. 조립된 contigs Badnavirus taxon 도구에 대 한 생물 공학 정보 (NCBI) 기본적인 현지 줄 맞춤 검색 핵 산 (BLASTn)에 대 한 국립 센터를 사용 하 여 두 데이터 집합에 관련 된 발견 되었다. 우리는 2 개의 badnavirus 종24의 유전자 발견.

<table><tbody><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich St. Louis MO</td><td>S5976</td><td>Grinding buffer for virus purification</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S0751</td><td>Grinding buffer for virus purification</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Thermo-Fisher Waltham, MA</td><td>28790</td><td>Grinding buffer for virus purification</td></tr><tr><td>urea</td><td>Thermo-Fisher</td><td>PB169-212</td><td>Homogenate extraction&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>X-100</td><td>Homogenate extraction&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cheesecloth</td><td>VWR Radnor, PA</td><td>21910-107</td><td>Filter homogenate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tris&amp;nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Pellet resuspension&amp;amp; DNA resuspension buffers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Spectrum, Gardena, CA</td><td>M1035</td><td>Pellet resuspension buffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Spectrum</td><td>E1045</td><td>Stops enzyme reactions</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25530</td><td>DNA resuspension buffer</td></tr><tr><td>phenol:chloroform:isoamylalcohol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>Dissolve virion proteins</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Degrade cellular DNA from extracts</td></tr><tr><td>95% ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6B-100</td><td>Virus DNA precipitation</td></tr><tr><td>Laboratory blender</td><td>VWR</td><td>58984-030</td><td>Grind leaf samples</td></tr><tr><td>Floor model ultracentrifuge&amp;nbsp; &amp;amp;Ti70 rotor</td><td>Beckman Coulter, Irving TX&amp;nbsp;</td><td>A94471</td><td>Separation of cellular extracts</td></tr><tr><td>Floor model centrifuge and JA-14 rotor</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>369001</td><td>Separation of cellular extracts</td></tr><tr><td>Magnetic stir plate</td><td>VWR</td><td>75876-022</td><td>Mixing urea into samples overnight</td></tr><tr><td>Rubber policeman</td><td>VWR</td><td>470104-462</td><td>Dissolve virus pellet</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;2100 bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent Genomics, Santa Clare, CA</td><td>G2939BA</td><td>Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer RNA-Picochip</td><td></td><td>5067-1513</td><td>Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip</td><td></td><td>5067-4626</td><td>Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotometer</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ND-2000</td><td>Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td></tr><tr><td>Plant total RNA isolation kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>STRN50-1KT</td><td>Isolate RNA for RNA-seq</td></tr><tr><td>RNase-free water&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>10128-514</td><td>Resuspension of DNA and RNA for NGS</td></tr><tr><td>RNA concentrator spin column</td><td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>R1013</td><td>Prepare RNA for RNA-seq</td></tr><tr><td>rRNA removal kit</td><td>Illumina, San Diego, CA</td><td>MRZPL116</td><td>Prepare RNA for RNA-seq</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>Prepare RNA for RNA-seq</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;RNA&amp;nbsp; enrichment system</td><td>Roche</td><td>7277300001</td><td>Prepare RNA for RNA-seq</td></tr><tr><td>Agarose&amp;nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>16500100</td><td>Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15585011</td><td>Agarose gel staining</td></tr><tr><td>pGEM-T +JM109 competent cells</td><td>Promega, Madison, WI</td><td>A3610</td><td>Clone genome fragments</td></tr><tr><td>pFU Taq polymerase</td><td>Promega</td><td>M7741</td><td>PCR amplify virus genome</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td>PCR amplify virus genome</td></tr><tr><td>PCR oligonucleotides</td><td>IDT, Coralvill, IA</td><td>Custom order</td><td>PCR amplify virus genome</td></tr><tr><td>Miniprep DNA purification kit</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td>Plasmid DNA purification prior to sequencing</td></tr><tr><td>PCR clean-up kit</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Prepare PCR products for cloning</td></tr><tr><td>pDRAW32 software</td><td>ACAClone</td><td></td><td>Computer analysis of circular DNA and motifs</td></tr><tr><td>MEGA6.0 software</td><td>MEGA</td><td></td><td>Molecular evolutionary genetics analysis</td></tr><tr><td>Primer 3.0</td><td>Simgene.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT&amp;trade; RiboGreen&amp;trade; RNA Assay Kit</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R11490</td><td>Fluorometric determination of RNA quantity</td></tr><tr><td>GS Junior&amp;trade; pyrosequencing System</td><td>Roche</td><td>5526337001</td><td>Sequencing platform</td></tr><tr><td>GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A)</td><td>Roche</td><td>5996520001</td><td>Reagents for emulsion PCR</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents</td><td>Roche</td><td>5996490001</td><td>Reagents for emulsion PCR</td></tr><tr><td>GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A)</td><td>Roche</td><td>5996538001</td><td>Reagents for emulsion PCR</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCR Oil &amp;amp; Breaking Kit</td><td>Roche</td><td>5996511001</td><td>Reagents for emulsion PCR</td></tr><tr><td>GS Jr Titanium Sequenicing kit*</td><td>Roche</td><td>5996554001</td><td>Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads</td></tr><tr><td>GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit</td><td>Roche</td><td>5996619001</td><td>Sequencing plate with associated reagents and gaskets</td></tr><tr><td>IKA Turrax mixer</td><td></td><td>3646000</td><td>Special mixer used with Turrax Tubes</td></tr><tr><td>IKA Turrax Tube (specialized mixer)</td><td></td><td>20003213</td><td>Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions</td></tr><tr><td>GS Nebulizers Kit</td><td>Roche</td><td>5160570001</td><td>Nucleic acid size fractionator for use during library preparations</td></tr><tr><td>GS Junior emPCR Bead Counter</td><td>Roche</td><td>05 996 635 001</td><td>Library bead counter</td></tr><tr><td>GS Junior Bead Deposition Device</td><td>Roche</td><td>05 996 473 001</td><td>Holder for Picotiter plate during centrifugation</td></tr><tr><td>Counterweight &amp;amp; Adaptor for the Bead Deposition Devices</td><td>Roche</td><td>05 889 103 001</td><td>Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation</td></tr><tr><td>GS Junior Software</td><td>Roche</td><td>05 996 643 001</td><td>Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data</td></tr><tr><td>GS Junior Sequencer Control v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td></tr><tr><td>GS Run Processor v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td></tr><tr><td>GS De Novo Assembler v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td></tr><tr><td>GS Reference Mapper v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td></tr><tr><td>GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td></tr></tbody></table>

combining analysis of dna in a crude virion extraction with the analysis of rna from infected leaves to discover new virus genomes

Metagenome 이렇게는 원형 DNA 게놈으로 식물 바이러스 및 그들의 증명서를 식별 하는 데 사용 됩니다. 종종 식물 DNA 바이러스는 그들의 호스트에 낮은 titers에서 발생 또는 다른 호스트에 기계적으로 주사 될 수 없다는 전파 감염 물질의 더 큰 titer를 달성 하기 어렵다. 감염 된 잎은 최적의 pH와 이온 조성 대부분 bacilliform 파라 레트로 바이러스를 정화 하는 것이 좋습니다 가벼운 버퍼에 지상. 요소는 virions 함정 포함 시체를 휴식 하 고 세포질 구성 요소를 분해 하는 데 사용 됩니다. 차등 원심 분리 공장 오염 물질에서 virions의 분리를 추가 제공합니다. 다음 가수분해 K 치료는 capsids 제거합니다. 바이러스 성 DNA 이다 집중 그리고 차세대 시퀀싱 (NGS) 사용 합니다. NGS 데이터는 NCBI-BLASTn 바이러스 시퀀스 생성 된 데이터 집합의 하위 집합을 식별 하는 제출 contigs 조립 하는 데 사용 됩니다. 병렬 파이프라인에서 RNA는 감염 된 잎은 표준 열 기반 RNA 추출 방법을 사용 하 여 격리 됩니다. 다음 리보솜 고갈 mRNA 및 바이러스 성적 하위 집합에 대 한 풍부 하 게 수행 됩니다. 조립된 시퀀스 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)에서 파생 된 바이러스 시퀀스에서이 데이터 집합의 하위 집합을 식별 하기 위해 NCBI BLASTn에 제출 했다. 우리의 연구에서 우리는 두 개의 데이터 집합에서 두 개의 관련된 전체 길이 badnavirus 유전자 발견. 이 메서드는 식물 바이러스 게놈 시퀀스를 다시 구성할 작은 RNA 시퀀스의 집계 인구를 추출 하는 또 다른 일반적인 접근을 선호. 이 후자의 metagenomic 파이프라인 복구 바이러스 관련 시퀀스는 복고풍 속기 요소 식물 게놈으로 삽입 됩니다. 이를 더 적극적으로 전염 성 요원을 분별 생화학 또는 분자 분석을 결합 이다. 이 연구에서 설명 하는 접근 가능성이 표시 활성 바이러스 감염 하는 바이러스 복제의 시퀀스를 복구 합니다.

이 수정된 바이러스 정화 방법 바이러스 DNAs NGS와 생물 정보학 두 바이러스 종 식별 하는 데 유용의 농축을 제공 합니다. 후에 homogenate에서 40000 x g 2.5 h에 대 한 centrifuged는, 튜브의 하단에 녹색 펠 릿과 길이 따라 흰색 펠 릿 있었습니다. 녹색 펠 릿은 한 microcentrifuge 튜브에 resuspended 그리고 화이트 펠 릿 두 microcentrifuge 튜브 resuspended 했다. PCR 표준 CaYMV PCR 진단 뇌관을 사용 하 여 실행 되었다 고 제품 solubilized 화이트 펠 릿과 하지 녹색 펠 릿 (그림 1A)에서 발견 되었습니다. 원유 준비의 샘플 전송 전자 현미경에 의해 조사 되었다 하 고 우리가 124-133 nm 길이 (그림 1B)를 측정 하는 bacilliform 입자를 관찰. 이것은 대부분 badnaviruses의 예측된 모달 길이 이내 이다. DNA는 흰색과 녹색 알갱이에서 추출 하 고 별도로 resuspended. 그림 1C, 우리는 녹색에서 추출한 DNA의 5 µ L 로드 고 흰색 펠 렛 샘플 (녹색 부분에 대 한 DNA의 1.6 µ g)와 흰 부분을 위해 DNA의 3.1 µ g 0.8 %agarose 젤 전기 이동 법 ethidium 평범한 사람을 다음 DNA를 분석 얼룩. 녹색 부분 흰색 분수 높은 분자량 DNA, DNA (그림 1C) 낮은 분자량의 두 밴드를 생산 하는 반면 낮은 분자량 DNA를 포함. 그림 1C 에 젤 100 V에서 40 분 동안 실행 하 고 레인 3에 얼룩 젤 전압 명확 하 게 밴드를 생산 하기 위해 인하 해야 제안 합니다. 이러한 데이터 제안 화이트 펠 릿 virions에 대 한 풍부한 했다. 흰색 샘플에서 추출 된 DNA (0.6 µ g/mL) 농도, 했지만 NGS, 10의 최소 필요에 대 한 적절 한 진행에 DNA의 ng. 조각난된 DNAs는 NGS에 대 한 라이브러리를 준비 하 사용 되었다.
동시에, RNA 높은 처리량 RNA-이 대 한 감염된 칸 나 식물 (그림 1D)에서 추출 된 표준 워크플로 라이브러리 준비, NGS, contigs, 만들고 확인 하는 바이러스 성 게놈 시퀀스 (그림 1E)를 위해 수행 되었다. 재료를 시작으로 DNA와 RNA를 사용 하 여 출력 결과 비교 했다.
우리는 원유 바이러스 준비에서 고립 된 DNA를 사용 하 여 188,626 원시 DNA 읽기를 NGS 여 얻었다. 읽기 13,269 contigs로 조립 및 BLASTn 뉴클레오티드 시퀀스의 NCBI 데이터 집합을 검색 하는 데 사용 되었다 (Viridplantae TaxID를 사용 하 여: 33090 및 바이러스 TaxID: 제한 기체로 10239) (그림 1E). NCBI BLASTn 결과 계시는 데 노 보 조립 contigs의 93% 셀룰러 시퀀스, 22%, 아니었다 고 0.3% 바이러스 contigs (그림 2A). Contigs 셀룰러 시퀀스도 미토 콘 드리 아 발견 했다로 분류 또는 엽록체 DNA의 대부분. 바이러스 contigs dataset에서 바이러스 contigs의 32% (되지 않은 Badnavirus 시퀀스) Caulimoviridae 의 회원 관련 있었다와 이들 중 58% 관련이 있었다 Badnavirus. 바이러스 contigs의 29% 매우 비슷한 (e < 1 x 10-30) CaYMV 격리 V17 ORF3 유전자 (EF189148.1), 사탕수수 bacilliform 바이러스 Batavia D, 완전 한 게놈 (FJ439817.1), 격리 되었고 바나나 행진 CA 바이러스 게놈 (완료 KJ013511)입니다. 이 인구 내에서 두 개의 전체 길이 genomes 닮은 긴 contigs가 있었습니다.
높은 처리량 RNA-seq 생산 153,488 청소 개별 시퀀스 읽기 읽기 < 500 bp. Contig 어셈블리의 길이 평균 8,243 contigs이 감소. 이러한 NCBI BLASTn에 제출 했다 (TaxID Viridplantae를 사용 하 여: 33090 및 바이러스 TaxID: 제한 기체로 10239) 출력 식물 세포 시퀀스, 23%의 범주에는 contigs의 76%를 배치 했다, 그리고 0.1% 바이러스 contigs (로 분류 했다 그림 2 B). 가까이 시험 바이러스 contigs 인구의 0.1%의 인구의 68% Caulimoviridae (그림 2B)에 할당 된 결정. 이 인구 내의 3 개의 큰 contigs 높은 유사성을 발견 했다 (10-30X e < 1) CaYMV 격리 V17 ORF3 유전자 (EF189148.1), 사탕수수 bacilliform 바이러스 분리 Batavia D, 완전 한 게놈 (FJ439817.1)와 바나나 행진 CA 바이러스 완전 한 게놈 (KJ013511). 우리가 수동으로 전체 길이 바이러스 게놈을 생산 하기 위해 이러한 두 합류 3 contigs 검사.
우리는 두 개의 전체 길이 바이러스 게놈의 존재를 확인 상호 발판으로 DNA와 RNA 시퀀싱 제작한 바이러스 게놈 길이 contigs 비교. 6,966의 1 개의 전체 길이 바이러스 게놈 bp 가칭 칸 나 노란색 반점 관련 바이러스 1 (CaYMAV-1) (그림 3A) 지명 되었다. 두 번째 게놈 이었다 7,385 bp와 CaYMV Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (그림 3A) 감염의 변종.
마지막으로, 각 바이러스의 복제 ~ 1000 bp 파편 설계 되었다 PCR 뇌관 차동 9 상업 종류를 나타내는 227 칸 나 식물의 인구에 있는 두 유전자를 감지 사용 되었다. 많은 경우에 개별 공장 두 바이러스에 감염 되었습니다. 12 식물에서 CaYMAV-1 및 CaYMV Ap01 RT-PCR 탐지의 예를 제공합니다. 3 다음 긍정적인 CaYMV Ap01 대해서만 되었고 9 두 바이러스 (그림 3B)에 대 한 긍정적인 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg"> 그림 1 : 바이러스 핵 산 준비 및 NGS 워크플로. (1.0%) (A) Agarose 젤 전기 이동 법 CaYMV 유전자의 565 bp PCR 파편의. 두 개의 PCR 제품 녹색 펠 렛 샘플 (3 차선)에 흰색 펠 릿 (차선 1, 2)에서 준비 하는 샘플만 발견 했다. 긍정적인 컨트롤 (+)은 감염 된 공장 표준 상자성 셀 입자를 포함 하는 자동화 된 방법을 사용 하 여 격리 된 DNA에서에서 증폭 PCR 제품을 나타냅니다. 레인 L 샘플 레인에 선형 DNA 밴드의 크기를 측정 하기 위한 표준으로 사용 하는 DNA 사다리를 포함 합니다. 감염 된 칸 나 잎의 원유 분류 되는 백색 펠 릿에 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 전망 하는 바이러스 입자의 (B) 예. (C) Agarose (0.8%) 녹색 (1 레인)에서 복구 된 DNA의 전기 영동 젤과 화이트 (2 레인) 패널 A. PCR에 의해 시험 된 긍정적인 그 펠 릿 레인 2 옆 빨간색과 노란색 점 두 높은 분자량 DNA 밴드 흰색 부분에서 발생 하는 식별 합니다. (D) Agarose (1%) 되는 RNA 정화 열 기반 총 RNA의 전기 이동 법 젤. 레인 L 샘플 레인에 선형 밴드의 크기를 측정 하기 위한 표준으로 사용 하는 DNA 사다리를 포함 합니다. 레인 1-6 ribo-고갈 및 핵 산 격리, 도서관 준비, 시퀀싱, contig 어셈블리 및 바이러스 게놈 RNA-이 (E) 도식 파이프라인에 대 한 단일 샘플에는 풀링된 했다 감염 된 칸 나 잎에서 분리 된 RNA를 포함 발견입니다. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg"> 그림 2 : 크로나 차트 시각화 contigs의 분류학 종류. (A) 풍요로 움과 contigs의 분류학 배포 원유 바이러스 준비에서 조립 왼쪽된 쇼에 차트. 오른쪽 차트 Caulimoviridae 가족, Badnavirus 속, 및 3 개의 밀접 한 관련이 종와 관련 된 바이러스 contigs의 비율을 보여 줍니다. (B) 왼쪽에 있는 패널 contigs RNA-seq에서 파생 된의 풍부한 그들의 분류학 분포에 따라 보여 줍니다. 오른쪽에 Caulimoviridae 가족, Badnavirus 속, 및 3 개의 밀접 한 관련이 종와 관련 된 바이러스 contigs의 인구 내의 contigs의 풍요를 묘사 하는 그래프입니다. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg"> 그림 3 . CaYMAV-1 및 CaYMV Ap01 유전자의 특성. (A) 도표 표현의 칸 나 노란색 반점 연결 바이러스 1 (CaYMAV) 및 칸 나 노란색 반점 바이러스 게놈에서 절연 비슷한 Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). 뉴클레오티드 위치 1-10 게놈의 시작으로 식별 되 고 tRNA만난 anticodon 사이트가 대부분 badnavirus 유전자의 전형. 열려있는 독서 프레임 (ORF) 1과 2의 번역에 대 한 중지 및 시작 위치는 인접 한. 이 단백질에는 알 수 없는 함수. ORF3 아연 손가락 (ZnF), 프로 테아 제 (프로), 역전사 (RT), RNAse H 도메인을 포함 하는 polyprotein입니다. 3' 많은 신호 순서는 두 바이러스 게놈에 대 한 보존입니다. (B) RT-PCR 분석 RNA 바이러스에 감염 된 잎 및 CaYMAV 및 CaYMV Ap01 검출 뇌관에서 격리를 사용 하 여 실시 되었다. 12 식물의 동일한 인구, 3 감염 되었습니다 CaYMV Ap01만, 반면 CaYMAV와 CaYMV Ap01 감염 된 나머지. (+) 나타냅니다 긍정적인 제어 (-) 부정적인 제어를 나타냅니다. 이 수치는 Wijayasekara 그 외 여러분 에서 재현/수정 24 동의입니다. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

새로운 바이러스 게놈을 발견 감염 된 잎에서 RNA 분석 원유 Virion 추출에 DNA의 결합 분석

여기 우리는 이중 가닥 DNA 게놈으로 식물 바이러스를 식별 하는 새로운 접근 방식을 제시. 감염 된 잎에서 DNA와 RNA를 추출 하 고 다음-세대 시퀀싱을 수행 표준 방법을 사용 합니다. Bioinformatic 도구 contigs로 시퀀스를 조립 하 고 contigs 바이러스 게놈을 나타내는 식별 분류학 그룹에 게놈을 할당 합니다.

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

combining-analysis-dna-crude-virion-extraction-with-analysis-rna-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K 조회수.  Texas A&M Agrilife Center at Dallas. 여기 우리는 이중 가닥 DNA 게놈으로 식물 바이러스를 식별 하는 새로운 접근 방식을 제시. 감염 된 잎에서 DNA와 RNA를 추출 하 고 다음-세대 시퀀싱을 수행 표준 방법을 사용 합니다. Bioinformatic 도구 contigs로 시퀀스를 조립 하 고 contigs 바이러스 게놈을 나타내는 식별 분류학 그룹에 게놈을 할당 합니다.

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Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

전자 레인지 전송 전자 현미경으로 식물 바이러스 질병의 신속한 진단을 도와

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

연구

면역학 및 감염병학

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal phase during establishment of infection in a given host. Consequently, study of encapsidation deciphers the information regarding the know-how of the mechanism regulating virus assembly to form infectious virions. Such information is vital in formulating novel methods of curbing virus spread and disease control. Virus encapsidation can be studied in vivo and in vitro. Genome encapsidation in vivo is a highly regulated selective process involving macromolecular interactions and subcellular compartmentalization. Therefore, study leading to dissect events encompassing virus encapsidation in vivo would provide basic knowledge to understand how viruses proliferate and assemble. Recently in vitro encapsidation has been exploited for the research in the area of biomedical imaging and therapeutic applications. Non-enveloped plant viruses stand far ahead in the venture of in vitro encapsidation of the negatively charged foreign material. Brome mosaic virus (BMV), a non-enveloped multicomponent RNA virus pathogenic to plants, has been used as a model system for studying genome packaging in vivo and in vitro. For encapsidation assays in Nicotiana benthamiana plants, Agrobacterium -mediated transient expression, refer to as agroinfiltration, is an efficient and robust technique for the synchronized delivery and expression of multiple components to the same cell. In this approach, a suspension of Agrobacterium tumefaciens cells carrying binary plasmid vectors carrying cDNAs of desiredviral mRNAs is infiltrated into the intercellular space withina leaf using nothing more sophisticated than a 1 ml disposable syringe (without needle). This process results in the transfer of DNA insert into plant cells; the T-DNA insert remains transiently in the nucleus and is then transcribed by the host polymerase II, leading to the transient expression. The resulting mRNA transcript (capped and polyadenylated) is then exported to the cytoplasm for translation. After approximately 24 to 48 hours of incubation,sections of infiltrated leaves can be sampled for microscopyor biochemical analyses. Agroinfiltration permits large numbers (hundreds to thousands) of cells to be transfected simultaneously. For in vitro encapsidation, purified virions of BMV are dissociated into capsid protein by dialyzing against dissociation buffer containing calcium chloride followed by removal of RNA and un-dissociated virions by centrifugation. Genome depleted capsid protein subunits are then reassembled with desired viral genome components or non-viral components such as indocyanine dye.

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

A simple, efficient and robust way to synchronize the delivery of multiple viral components to plant cells via Agrobacterium-mediated transient expression is described. This approach is amenable for studying replication, encapsidation followed by in vitro reassembly of non-viral components into genome depleted optical viral ghosts suitable for biomedical applications.

간편하고 강력한 생체내에서과 체외에서</em바이러스 조립 유학을위한> 접근법

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

&#39;단일 바이러스 게놈&#39;을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

코튼 면화씨 벌레의 Densovirus의 호스트 피트니스에 호스트 조직 배포, 전송 모드 및 효과 조사를위한 프로토콜

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from clinical and biological sources. The method is unbiased and universal; it uses random primers for cDNA synthesis and requires no prior knowledge of the viral sequence content. Before library construction, selective RNase H-based digestion is used to deplete unwanted RNA &#8212; including poly(rA) carrier and ribosomal RNA &#8212; from the viral RNA sample. Selective depletion improves both the data quality and the number of unique reads in viral RNA sequencing libraries. Moreover, a transposase-based &#39;tagmentation&#39; step is used in the protocol as it reduces overall library construction time. The protocol has enabled rapid deep sequencing of over 600 Lassa and Ebola virus samples-including collections from both blood and tissue isolates-and is broadly applicable to other microbial genomics studies.

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

임상 샘플에서 RNA 바이러스의 편견 깊은 시퀀싱

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

의학

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

바이러스 성 감염 및 초파리 Melanogaster 상호 작용 호스트-바이러스의 분석의 설립

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries implemented strategies based on direct human testing, face covering, and surface disinfection. Under the assumption that the main route of transmission includes aerosols and respiratory droplets, efforts to detect SARS-CoV-2 in fomites have focused on locations suspected of high prevalence (e.g., hospital wards, cruise ships, and mass transportation systems). To investigate the presence of SARS-CoV-2 on surfaces in the urban environment that are rarely cleaned and&#160;seldomly disinfected, 350 citizens were enlisted from the greater San Diego County. In total, these citizen scientists collected 4,080 samples. An online platform was developed to monitor sampling kit delivery and pickup, as well as to collect sample data. The sampling kits were mostly built from supplies available in pandemic-stressed stores. Samples were processed using reagents that were easy to access despite the recurrent supply shortage. The methods used were highly sensitive and resistant to inhibitors that are commonly present in environmental samples. The proposed experimental design and processing methods were successful at engaging numerous citizen scientists who effectively gathered samples from diverse surface areas. The workflow and methods described here are relevant to survey the urban environment for other viruses, which are of public health concern and pose a threat for&#160;future pandemics.

A citizen science project was designed to recruit San Diego residents to collect environmental samples for SARS-CoV-2. A multilingual web-based platform was created for data submission using a user-friendly mobile device interface. A laboratory information management system facilitated the collection of thousands of geographically diverse samples with real-time outcome tracking.

도시 환경 면봉 - 환경 저수지에서 SARS-CoV-2의 샘플링 및 검출을 위한 파이프라인

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

생물학

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran insects that have piercing-sucking mouthparts. During viral transmission, the insect saliva bridges the virus-vector-host because the saliva vectors viruses, and the insect proteins, trigger or suppress the immune response of plants from insects into plant hosts. The identification and functional analyses of salivary proteins are becoming a new area of focus in the research field of arbovirus-host interactions. This protocol provides a system to detect proteins in the saliva of leafhoppers using the plant host. The leafhopper vector Nephotettix cincticeps infected with rice dwarf virus (RDV) serves as an example. The vitellogenin and major outer capsid protein P8 of RDV vectored by the saliva of N. cincticeps can be detected simultaneously in the rice plant that N. cincticeps feeds on. This method is applicable for testing the salivary proteins that are transiently retained in the plant host after insect feeding. It is believed that this system of detection will benefit the study of hemipteran-virus-plant or hemipteran-plant interactions.

This protocol demonstrates how to use the plant host to detect salivary proteins of leafhopper and plant viral proteins released by leafhopper vectors.

식물 숙주에서 딱정벌레 벡터의 바이러스 및 타액 단백질 검출

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two main categories of these new mosquito-associated viruses are &#34;mosquito-borne viruses (MBVs)&#34; and &#34;mosquito-specific viruses (MSVs)&#34;. These novel viruses might be pathogenic to both vertebrates and mosquitoes, or they could just be symbiotic with mosquitoes. Entity viruses are essential to confirm the biological characters of these viruses. Thus, a detailed protocol has been described here for virus isolation and amplification from field-collected mosquitoes. First, the mosquito samples were prepared as supernatants of mosquito homogenates. After centrifugation twice, the supernatants were then inoculated into either mosquito cell line C6/36 or vertebrate cell line BHK-21 for virus amplification. After 7 days, the supernatants were collected as the P1 supernatants and stored at -80 &#176;C. Next, P1 supernatants were passaged twice more in C6/36 or BHK-21 cells while the cell status was being checked daily. When cytopathogenic effect (CPE) on the cells was discovered, these supernatants were collected and used to identify viruses. This protocol serves as the foundation for future research on mosquito-associated viruses, including MBVs and MSVs.

Numerous novel virus-like sequences have been found in mosquitoes due to the extensive use of sequencing technologies. We provide an effective procedure for isolating and amplifying viruses using vertebrate and mosquito cell lines, which might serve as the basis for future studies on mosquito-associated viruses, including mosquito-borne and mosquito-specific viruses.

현장에서 채취한 모기로부터 모기 관련 바이러스 분리

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

DNA Virus Detection System Based on RPA-CRISPR/Cas12a-SPM and Deep Learning

We report a fast, easy-to-implement, highly sensitive, sequence-specific, and point-of-care (POC) DNA virus detection system, which combines recombinase polymerase amplification (RPA) and CRISPR/Cas12a system for trace detection of DNA viruses. Target DNA is amplified and recognized by RPA and CRISPR/Cas12a separately, which triggers the collateral cleavage activity of Cas12a that cleaves a fluorophore-quencher labeled DNA reporter and generalizes fluorescence. For POC detection, portable smartphone microscopy is built to take fluorescent images. Besides, deep learning models for binary classification of positive or negative samples, achieving high accuracy, are deployed within the system. Frog virus 3 (FV3, genera Ranavirus, family Iridoviridae) was tested as an example for this DNA virus POC detection system, and the limits of detection (LoD) can achieve 10 aM within 40 min. Without skilled operators and bulky instruments, the portable and miniature RPA-CRISPR/Cas12a-SPM with artificial intelligence (AI) assisted classification shows great potential for POC DNA virus detection and can help prevent the spread of such viruses.

We present a protocol that combines recombinase polymerase amplification with a CRISPR/Cas12a system for trace detection of DNA viruses and builds portable smartphone microscopy with an artificial intelligence-assisted classification for point-of-care DNA virus detection.

RPA-CRISPR/Cas12a-SPM 및 딥러닝 기반의 DNA 바이러스 검출 시스템

We report a fast, easy-to-implement, highly sensitive, sequence-specific, and point-of-care (POC) DNA virus detection system, which combines recombinase ...

새로운 바이러스 게놈을 발견 감염 된 잎에서 RNA 분석 원유 Virion 추출에 DNA의 결합 분석

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