우리는 교수 Anders Jeppsson는 실험에 사용 된 혈관을 제공 하는 방법에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 이 연구를 융자 되었다 SSH LUA ALF 그랜트에 의해.

조직을 사용 하 고이 종이의 프로토콜 예테보리 대학교의 윤리 지침을 따릅니다.
1. 조직 준비 및 저장
<ol><li>절단 수술 집게와가 위를 사용 하 여 검색 된 saphenous 정 맥에서 주변 조직. 참고: saphenous 정 맥은 해 부의 더 낮은 다리에서 혈관 외과 의사에 의해. 이 문서에 사용 된 saphenous 정 맥 수술 후 취소 사용된 부분입니다.</li>
	<li>관류 동안 누설을 방지 하기 위하여 봉합 및 집게 그들의 끝에 모든 측 지점.</li>
	<li>포함 하는 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 40 mL 50 mL 튜브에 정 맥을 유지. 과잉 혈액을 제거 하려면 PBS 2-3 번을 변경 하 여 정 맥을 씻어. -80 ° c.에 냉동 하 여 정 맥을 저장</li>
</ol>2. Decellularization 설정 및 Recellularization 생물의 준비
주: 표 1에서 보는 바와 같이 실리콘 튜브를 잘라가 위를 사용 합니다.
<ol><li>
Decellularization 설치 1 (대 한 Triton X-100 관류 및 세척)
	<ol>
<li>2 l (플라스틱 욕조) 챔버, 튜브 A 그림 1A와 같이 모든 세 가지 테이프. 참고: 테이프 가장자리 챔버 (세제의 입구)의 하단을 접촉 한 벽에 1 개의 관 및 정 맥의 길이 따라 사이 5-10 cm의 거리와 반대 벽에 다른 2 개의 관. 이러한 튜브의 적어도 5 cm (정 맥의 입구 및 출구) 챔버의 바닥에도 녹화 한다.</li>
		<li>세제의 유입 튜브 튜브 C F 이어서 튜브 튜브 B 시리즈에서 연결 남성과 여성의 Luer 커넥터를 사용 하 여 마지막으로 정 맥 입구에. 장소는 연동의 카세트로 F 튜브 나 펌프.</li>
		<li>다른 튜브 C를가지고 가십시오을 한 정 맥의 콘센트에 연결 합니다. 챔버 (세제 콘센트) 위에 45 cm 배치 된 하단 호스 콘센트와 함께 유리 항아리에 다른 쪽 끝을 놓고 테이프를 확보 합니다. 튜브 G를가지고 가십시오 유리 항아리의 호스 콘센트에 한쪽 끝을 밀어 하 고 정 맥 챔버로 다른 쪽 끝을 장소. 참고: 전체 설치 (빨간색 화살표), 챔버, 및 흐름 방향 (흰색 화살표)의 사진은 그림 1A에 표시 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Decellularization 설치 2 (TnBP 대 한 관류)
	<ol>
<li>1 L 유리 용기 고 놓고 C 튜브의 한쪽 끝을 (세제 입구) 항아리에 튜브만 지 병의 하단.</li>
		<li>튜브 튜브 C. 장소 C 튜브의 다른 쪽 끝 항아리에 절반 깊이 (정 맥의 입구)까지 다음 F 다른 쪽 끝을 연결 합니다. 연동 펌프의 카세트로 튜브 F 장소 나.</li>
		<li>튜브 D 하 고 정 맥의 입구 (세제 콘센트)에서 45cm 높이 아래쪽 호스 절반 깊이 유리 항아리에 다른 쪽 끝까지 항아리 (정 맥의 콘센트)에 한쪽 끝을 배치. 확보 하기 위해, 세제의 입구 및 출구 관 테이프.</li>
		<li>자력에 1 L 유리 용기를 놓고 병 안에 자석을 유지 합니다.</li>
		<li>튜브 G 걸립니다 하 고 유리 항아리의 호스 콘센트에 한쪽 끝을 밀어 1 L 유리 용기에 다른 쪽 끝을 장소. 참고: 그림의 완벽 한 설치 (빨간색 화살표), 약 실 및 흐름 방향 (흰색 화살표) 그림 1B에서 표시 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Decellularization 설치 3 (대 한 DNase 관류)
	<ol>
<li>250 mL 유리 병 고 튜브 C. 장소 튜브의 중간 영역의 두 끝 다 연동 펌프 II의 카세트 합니다. 참고: 튜브의 한쪽 끝은 솔루션 입구 그리고 튜브의 다른 쪽 끝은 정 맥의 입구에 연결 된. 정 맥의 콘센트는 솔루션에서 무료로 남아 있습니다.</li>
		<li>37 ° c.에 펌프를 포함 하 여 전체 설치 장소 완전 한 설치 및 흐름 방향 그림 그림 1C에 표시 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recellularization 생물
	<ol>
<li>계속 준비 모든 부품 그림 2A와 같이.</li>
		<li>그림 2B에서 같이, 4-포트 뚜껑을 각 포트에 삽입, H (정 맥의 콘센트) 튜브, 튜브 나 (미디어 입구), 그리고 J (정 맥의 입구) 튜브. 4번째 포트 (언론 매체) 관 H의 다른 쪽 끝을 삽입 합니다. 참고: 위에서 4-포트 캡의 보기는 그림 2C에 표시 됩니다. 튜브의 쉬운 삽입에 대 한 날카로운 포인트는 시저와 가장자리를 잘라.</li>
		<li>U 모양으로 관 J의 다른 쪽 끝을 구 부하 고는 봉합과 넥타이. H 조 & 제이 튜브의 내부 끝에 줄이는 커넥터 연결</li>
		<li>250 mL 유리병에 플랫 베이스와 60 mL 튜브를 놓고 그림 2D와 같이 튜브에 위의 만든된 설치 프로그램을 배치 합니다. 그림 2E같이 튜브 K, E 및 K 시리즈에 연결 합니다. 정 맥의 입구에 1 개의 관 K와 다른 튜브 K 미디어 입구를 연결 합니다. 참고: 설치, 방향과 흐름의 회로도 그림 2 층에 표시 됩니다.</li>
		<li>압력가 마로 소독으로는 생물 반응 기를 소독.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 솔루션의 준비
<ol><li>해결 방법 1 (10 x 물): 1 L의 초순, 나트륨 아 지 드의 작품 및 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 18.6 g 2 g 추가. 소금은 녹아 때까지 휘저어입니다.</li>
	<li>해결 방법 2 (1 x 물): 솔루션 1의 100 mL 고 초순의 900 mL을 추가.</li>
	<li>해결 방법 3 (Triton X-100 x 5): 초순의 950 mL, 50 mL Triton X-100, 나트륨 아 지 드, 1 g와 EDTA의 9.3 g 추가. 해산 때까지 휘저어.</li>
	<li>해결 방법 4 (Triton X-100 x 1): 초순 물 800 mL를 추가 하 고 솔루션 3의 200 mL.</li>
	<li>해결 방법 5 (1 x TnBP): 990 솔루션 2 mL에 10 mL 피 펫과 TnBP의 10 mL를 추가.</li>
	<li>해결 방법 6 (40 Kunitz 단위/mL DNase): Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 CaCl2 및 MgCl2의 50 mL에 DNaseI의 추가 2000 Kunitz 단위. 신선 하 게 준비 하 고 즉시 사용 합니다.</li>
	<li>해결 방법 7 (PBS): 24 g의 염화 나트륨, 염화 칼륨 0.6 g, 4.32 g의 나트륨 인산 염, 및 칼륨 인산 염의 0.72 g 초순 물 3 L를 추가 합니다. 해산 때까지 휘저어. PH 7.4에 조정 합니다. PBS는 압력솥에서 1 리터를 소독 하 고 별도로 저장 합니다.</li>
	<li>솔루션 8 (0.1% 초 산): 살 균 솔루션 7의 50 mL, 초 산의 50 µ L 추가. 신선 하 게 준비 하 고 즉시 사용 합니다.</li>
</ol>4입니다. 내 피 매체의 준비
<ol><li>L-글루타민의 5 mL 5 mL의 방지, 인간의 AB 세럼 50 mL와 멸 균 후드 MCDB131 매체의 500 mL 소 태아 혈 청을 제외한 EGM 2 성장 인자 키트의 모든 구성 요소를 추가 합니다.</li>
</ol>5입니다. decellularization Saphenous 정 맥의
<ol><li>실 온에서-80 ° C에서 인간의 saphenous 정 맥 동 -80 ° C에 다시 고정 하 고 다시 실 온에서 해 동.</li>
	<li>잘라가 위를 사용 하 여 2 mm 길이 생 하 고 실 온에서 24-48 h에 대 한 포름알데히드에 수정. 남성과 여성의 Luer 커넥터는 봉합의 가시에 정 맥의 각 끝을 묶어.</li>
	<li>Decellularization 설치 1 정 맥을 연결 하 고 솔루션 2의 1 L를 입력 합니다. 35 mL/분에서 15 분 설정의 내용을 비어에 대 한 perfuse.</li>
	<li>솔루션 4의 1 패를 추가 하 고 35 mL/분에서 h 4는 설치 프로그램의 내용을 비어에 대 한 perfuse.</li>
	<li>솔루션 2의 500 mL를 추가 하 고 5 분 설치의 내용을 비어에 대 한 perfuse. 이 단계를 반복 합니다. 관류 설치 1에서에서 정 맥을 분리 하 고 관류 설치 2에 연결.</li>
	<li>솔루션 5의 1 패를 추가 하 고는 활동가 설정 35 mL/min에서 4 h perfuse. 참고: 솔루션 5 흐린는 활동가 대 고 관류 전역 후 보인다.</li>
	<li>관류 설정 2에서에서 정 맥을 분리 하 고 초순 5-10 분의 4 변화에 정 맥의 외부와 내부 주사기 또는 10 mL 피 펫 세척.</li>
	<li>관류 설치 3 정 맥을 연결 솔루션 6의 50 mL를 추가 하 고 37 ° C 챔버에 10 mL/min에서 perfuse 4 h. 설치의 내용을 비어 및 설정에서 정 맥을 분리.</li>
	<li>관류 설치 1 정 맥을 연결, 솔루션 2 1 리터를 하룻밤 35 mL/분 반복 단계 5.4 단계 5.9 4 회 (총 5 사이클)에서 perfuse. 5.2 단계에서 제시 된 대로 다시 생을 가져가 라. 참고: 건너뛰기 사이클 1과 3에에서 5.8 두 번째 부분을 단계.</li>
	<li>설정의 내용이 비어 있습니다. 솔루션 2의 1 L를 perfuse 35 mL/분 변경 솔루션에서 24 h에 대 한 12 헤 후 2 설치 프로그램의 내용을 비어. 1l의 초순 수를 설정의 내용을 12 h.Empty 후 24 h 35 mL/분 변화는 초순에 대 한 perfuse. 7 솔루션의 1 리터와 7 후 12 h 35 mL/분 변경 솔루션에서 24 h에 대 한 perfuse.</li>
</ol>6입니다. Decellularization의 확인
<ol><li>포 르 말린 고정 초순 15 분 과정 표준 프로토콜에 따라 조직 프로세서에 대 한 생 검을 세척 하 고 파라핀22에 포함.</li>
	<li>톰을 사용 하 여 5 µ m 섹션을 잘라 얼룩 메이어의 hematoxylin 및 0.2% 알콜 오신 (H & E)와 함께 다음 표준 프로토콜22.</li>
	<li>정상 조직에 비해 decellularized 조직에서 핵의 손실에 대 한 확인을 현미경으로 볼 수 있습니다.</li>
</ol>7입니다. recellularization
<ol><li>포함 하는 솔루션 8의 50 mL 50 mL 튜브에 그것을 배치 하 여 정 맥을 소독. 분 (rpm) 당 80 회전에서 37 ° c.에 1 시간에 대 한 셰이 커에 선동</li>
	<li>층 류 흐름 (LAF) 불 임을 유지 하기 위해 지금부터 캐비닛 아래 정 맥을 처리 합니다. 방지의 살 균 솔루션 7, 500 µ L의 50 mL를 포함 하는 새로운 50 mL 튜브를 무 균 집게를 사용 하 여 정 맥을 전송 합니다. 위의 12 h. 변경 솔루션 7 적어도 두 번 사이 대 한 교 반 하십시오.</li>
	<li>소독 집게를 사용 하 여 새로운 50 mL 튜브에 정 맥을 전송 하 고 내 피 미디어의 50 mL를 추가 합니다. 위의 11 h에 대 한 교 반 하십시오.</li>
	<li>LAF 캐비닛 아래 멸 균 글러브를 사용 하 여 생물을 조립. 생물 반응 기의 정 맥 입구 및 출구 무 균 봉합와 집게를 정 맥을 묶어.</li>
	<li>생물을 채우기 같은 매체와 정 맥을 연결 합니다. 50 IU/mL에서 헤 파 린을 추가 하 고 37 ° C에 2 mL/min에서 1 h perfuse</li>
	<li>헤 파 린 코팅 vacutainer 튜브에 기증자에서 신선한 혈액 (정 맥의 길이)에 따라 15-25 mL를 수집 하 고 1:1 스 틴 솔루션을 희석. 나중에, 내 분 비 동맥-유래 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF EG, 80 ng/mL), 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF b, 4 µ L/mL)와 아 세 틸 살리실산 (5 µ g/mL)를 추가 합니다.</li>
	<li>5% CO2 와 37 ° C 배양 기에는 생물을 이동 하 고 2 mL/min에서 48 h에 대 한 perfuse.</li>
	<li>약 후 12 h, 캐비닛, LAF는 생물 이동 혈액의 방울 고 혈액 포도 당 감시 장치를 사용 하 여 포도 당을 측정. 수준 미만 3 mmol/L 이면 추가 려 포도 당 7-9 mmol/l. 반복의 범위에이 모든 8-12 h 단계.</li>
	<li>48 h 후 LAF 캐비닛에 생물을 이동 하 고는 생물에서 혈액을 배출 합니다. 살 균 솔루션 7의 30 mL를 추가 하 고 5 분 드레인 솔루션에 대 한 perfuse. 살 균 솔루션 7의 30 mL를 추가 하 고 두 번 이나 붉은 색 손실 됩니다 때까지 5 분 반복에 대 한 perfuse. 참고: 생 검 셀 첨부 파일의 확인을 위해 취할 수 있습니다. 정 맥, 정 맥의 5mm 가장자리가 위로 잘라 고 그들을 무시. 생 검 단계 5.2에서에서 명시 된 고 생물 (선택 사항)을 다시 정 맥을 연결.</li>
	<li>내 피 매체의 30-45 mL를 추가 하 고 2 mL/min에서 인큐베이터에서 96 h에 대 한 perfuse. 참고: 추가 내 피 중간 정 맥 빠져들 때까지.</li>
	<li>LAF 캐비닛에는 생물을 이동, recellularized 정 맥을 분리가 위를 사용 하 여 정 맥의 5mm 가장자리 잘라내어 버리고. 5.2 단계에서 제시 된 대로 생 검을 가져가 라.</li>
</ol>8입니다. Recellularization의 확인
<ol><li>섹션 6에에서 지시 하 고 H & E 염색을 수행 합니다. 셀의 존재에 대 한 현미경 슬라이드를 검사 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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SSH Verigraft, 조직의 혈관 엔지니어링 기술 라이센스는 회사에서에서 주식 보유. 다른 저자는 공개 없다.

Saphenous 정 맥의 decellularization에 대 한 여기에 제시 된 기술 또한 탯 줄 고 유 방 정 맥 처럼 모든 직경이 작은 혈관에 적용 될 수 있는 쉽게, 간단 하 고 비용 효율적인 방법입니다. Decellularization 솔루션 및이 방법에 사용 되는 그들의 농도 우리의 이전 결과6,7. 비록 decellularization의 5 주기를 권장 하 고, 특정 혈관에 우리도 눈치 3 주기에서 완전 한 decellularization. 그러나, 재현 결과 5 주기를 사용 하 여 얻은 했다. 우리는 다양 한 길이의 혈관 decellularized이 프로토콜을 적용, 30 cm까지 성공적으로 (되지 않은 결과). 45 m decellularization 솔루션의 콘센트를 리프팅 정 맥 안에 33 mmHg의 압력을 만들 것입니다. 우리의 경험에서 우리 전체 맥락을 균일 하 게 decellularizing에 그리고 reproducibly 5 주기에서 주요 단계로이 나타났습니다. 선택된 압력은 정상적인 saphenous 정 맥 압력 (5-10 mmHg) 보다 3 배 높은 하지만 무능에서와 같이 혈관 (정 맥)23. 또한, 우리는이 높은 압력 정 맥 벽에 큰 힘을 만들 것입니다 하 고 따라서 효율적이 고 빠른 세포 제거에 도움이 있습니다, 사색 한다.
TnBP은 유기 용 매와 물에 불용 성, 흐린 될 때까지 세제를 감동이 중요; 그렇지 않으면, 세제에 플 로트 것입니다. 같은 이유로 TnBP 솔루션, 혼합 계속 세제의 콘센트 튜브가 두었다 호스 콘센트와 함께 유리 항아리의 상단에. 효율적인 제거 후 씻어 물에 TnBP 방울의 부재 모든 주기에 그것의 사용을 볼 수 있습니다 정 맥에서 TnBP의. 우리는 또한 decellularized 조직 생산 또한 DNase 단계를 건너뛰는 하지만 몇 가지 경우, decellularized 조직에서 비교적 높은 DNA 콘텐츠 발견 했다 나타났습니다. 높은 압력 및 높은 흐름 율 효율적인 DNase 활동에 대 한 필요 하지 않습니다, 낮은 관류 속도 (10 mL/min) 사용할 수 있습니다. 그것의 더 작은 크기는 설치의 쉬운 처리에 도움이 됩니다 다른 연동 펌프 사용 했다. 이후 우리는 주기 2에에서 decellularization 결과 중 대부분의 세포의 손상을 발견, 건너뛰는 DNase 1 고 3 (게시 되지 않은 결과) 주기 동안 치료 하는 것이 좋습니다. 특성화 및 정량화의 세포 외 기질 단백질이이 원고 수행 했다, 비록 유사한 decellularization 프로토콜 우리의 이전 경험이 했다 biomechanical 속성의 보존 세포 외 기질 단백질 및 구조7. 비록 이러한 혈관 우리의 예비 정량화 실험 (미 발표) 비슷한 결과 생산, 우리의 이미 게시 된 결과이 신뢰를 강화 것입니다.
Recellularization 혈액을 사용 하 여 하나 긴 셀 확장 시간, 환자에 대 한 확장 된 셀, 외과 침략, 및 불편에 자발적인 돌연변이 피할 수 있다 확장 하는 골 수 세포를 통해 편리 하 고 쉬운 프로세스입니다. 이후 endothelialization도 Epc 순환에서 발생할 수 있습니다, 우리는 혈액 내 피 매체 관류 뒤 그 관류 가설 알려져 있다 recellularization에 대 한 충분 한 될 것입니다. 이러한 두 개의 혈관 여분 간 문맥 방해7자식으로 이식 했다 때 비슷한 메서드를 사용 하 여 설계 하는 정 맥 조직의 안전 이식의 성공적인 결과에서 볼 수 있다. 우리는 decellularized 세포 외 기질에 성장 요인 혈액24에서 Epc를 순환의 첨부 파일을 허용할 것 이다을 추측 한다. 유사한 프로토콜에 따라 혈관의 recellularization 셀 VEGF 수용 체-2와 차별화 (CD) 14 CD45 표현 셀 adventitia7에서 보인 동안 루멘에의 클러스터에 대 한 긍정적인 했다. 우리는 또한 그 지속적인 내 피 층 하지 관찰 수 있습니다 모든 경우에 이러한 개인 조상 세포25순환 수가 감소 알려진 대로 이전 하 고 병에 걸린 환자에서 혈액을 사용 하는 경우에 특히 상상. 그러나 우리는 관류와 받는 사람의 자신의 가정 혈액 항 원 decellularization 때문에 노출 되 고 따라서 불리 한 염증 반응 때 반대만 이식 이식의 기회를 줄일 수 있습니다의 많은 마스크 수 있습니다 decellularized 혈관입니다. 또한, 혈액 관류 루멘에 조상 세포 vivo에서recellularization의 빠른 과정에 인 순환의 증가 숫자를 모집 수 있습니다 adventitia에 성장 요인의 증가 수준을 입금 수 있습니다.
이 연구에 사용 된 생물 반응 기 디자인의 장점은 완전 한 압력가 마로 소독, 쉬운 조립, 비용 효율성, 쉬운 취급 및 손상의 적어도 가능성입니다. 우리의 경험에서는, 현재 디자인, 정 맥 길이 10 cm까지 했다 recellularized를 사용 하 여. 비록 최대 정 맥 길이 25cm는 생물 안에 "U" 모양 정 맥을 유지 하 여 recellularized도 수, 유효성을 검사 해야 합니다. 생물 반응 기 디자인 정 맥에서 흐름의 방향은 중력에 대 한 설계 되었습니다 같은 때문에 인 간에 있는 이러한 혈관에 대 한 흐름의 수직 방향을 보여줍니다. 내 피 중간 단계의 12 h 관류 혈관 precondition 들어오는 Epc의 첨부 파일에 대 한 선호도 증가입니다. 추가 추가 헤 파 린 및 1 시간에 대 한 관류의 혈액 관류 동안 튜브에 혈전 형성의 위험을 낮출 것 이다.
필요한 혈액의 양을 정 맥의 길이에 따라 달라 집니다. 우리 혈액 볼륨에 따라 기본 원리는 정 맥 혈액에 빠져들 수 한다입니다. 45 mL 보다 큰 혈액 볼륨을 처리 하는 동안 가끔 혼합 세포는 생물의 하단에 축적을 방지 하기 위해 요구 수 있습니다. 우리 혈액의 단백질 조직 장기 이식26,27동안 건강 한 유지 하는 데 필요한 높은 금액을 포함 하기 때문에 Steen의 솔루션 추가. 그들은 강력한 신생 성장 인자28 및 마이그레이션, 확산, 및 Epc29,,3031,32의 차별화를 유도 하는 그들의 존재로 VEGF와 b-FGF의 추가 도움이 됩니다. . VEGF 추가 금액은 Epc의 확산 80 ng/mL에서 목격 된 우리의 이전 되지 않은 결과 기반으로 합니다. 아스피린의 혈소판33 내 피 층에 그들의 부착의 기회 감소의 활성화를 억제. 지속적인 모니터링 및 포도의 추가 세포 증식 및 적혈구의 용 혈을 방지 도움이 됩니다.
간단한 혈액 샘플만 받는 이기 때문에, 보다 적게 기술 전문 간단 하 고 가능한 절차로 여겨질 수 있다. 비록, 완료부터 여기 표시 된 모든 절차는 20 일 소요, 저장으로 decellularized 혈관은 선반에서 제품 환자에 대 한 일 절차 단축 됩니다. Decellularized 혈관의 스토리지 기술적으로 미치지 않습니다 recellularization 효율성, 비록 평가 되어야 합니다. 조직 설계 혈관 생성이 절차에 따라 병원에 바이패스 수술, 방해 혈관, 면역 억제를 위한 필요 없이 정을 선도 하 고 따라서 더 나은 품질을 제공 하는 정 맥 불충분을 대체 사용할 수 있습니다. 환자를 위한 생활입니다.

혈관 도관이 동맥 류, 경 동맥 협 착 증 및 심한 혈관 문제로 이어지는 동맥 경화 같은 여러 임상 조건에 대 한 필요 합니다. 외과 "헌, 수용자 또는 합성 혈관 도관"을 사용 하 여 복원 기능 혈액 공급. 만 헌 혈관의 사용은 여전히 이상적인 접근, 환자에서 가용성 majorly 제한 됩니다. 수용자 또는 합성 이식 등 대안 면역 치료와 가난한 patency reoperation1,2, 국가 경제 부담 주요 건강 결과로 이어지는 깊은 문제가 있다. 혈관의 조직 공학 자연 상 동 및 autologous 세포 이식 제공 하는 것을 목표로. 따라서, 받는 사람 면역 시스템 자체도 이식된 이식 인식 하 고 이러한 이식 자연 단백질 및 원래 구성에 있는 셀에 포함 되어 있는, 그것은 현재 대안에 비해 더 나은 작동 수도 있습니다. 3방광, 요도4, 기관5및 정 맥6,7, 성공적으로 사용 되었습니다 병원에서와 같은 조직 기관, 설계.
조직 공학 생산 맞춤된 이식 decellularization 및 recellularization 기증자 로부터 이식을 필요 합니다. Decellularization 조직 및 장기8,,910에서 세포를 제거 하는 유망한 기술 이다. Decellularization 특정 물리적, 화학적 및 효소 방법11 또는 그들을 결합 하 여 수행할 수 있습니다. 이러한 방법의 최적 사용에 decellularized 조직 기질 비슷한 기본 조직에에서 유사한 구조상과 기능적인 단백질을 가질 수 있습니다. 이러한 장기 첨부 파일, 마이그레이션, 확산, 그리고 들어오는 줄기 세포의 분화를 향상 시키기 위해 본질적인 능력 소유.
Recellularization 세포는 이식에 뿌리기의 동적 프로세스 이며 받는 사람 줄기 세포 임상 이식에 사용할 수 있습니다. 현재 이러한 목적을 위해 사용 하는 줄기 세포 골 수, 간 엽 등 장기 거주자3,,56. 동물 및 연구 지향적인 연구 태아 및 유도 만능12,,1314엽 기원에서 줄기 세포를 이용 했다. 이 프로세스에서는 생물 반응 기 (정 맥을 보유 하 고 온도, 가스, pH, 압력과 같은 필요 조건을 제공 하는 챔버), 세포 및 문화 미디어. Recellularization에도 전에 세포의 특정 유형 및 셀 전체 조직 또는 기관에 도달할 수는 시드 전략의 필요한 수를 얻을 것입니다. 비록 완전 한 조직 또는 기관 구조적 및 기능적으로 생성 되었으며 지금까지 평가, 필드와 초기 결과에 여러 발전 미래의 가능성15를 표시 합니다. 정 맥의 핵심 기능 조직 및 수축에 도움이 되 고 또한 혈압16를 힘을 제공 한다 중간 매끄러운 근육 층으로 선 동적인 세포의 침투를 제어 luminal endothelium에 놓여 있습니다. 연구는 손상, 동안 endothelialization 발생 또는 순환 혈액17,,1819에 내 피 조상 세포 (Epc)에서 문 합에서 설명 했다. 혈관의 recellularization에 대 한 우리의 전략 Epc 혈액 순환에 의존 합니다.
정 맥과 동맥의 조직 공학 다른 decellularization 및 recellularization 전략20,21다음 여러 그룹에 의해 수행 되었다. 우리의 그룹은 또한 수행 하 고 장 골과 유 정 맥6,7decellularization 및 recellularization 전략을 개발. Decellularization은 트라이 톤 X-100, 트라이-n-부 틸 인산 (TnBP), 그리고 효소 deoxyribonuclease (DNase)에서 정 맥의 동요에 의해 수행 되었다. recellularization 파생 하는 골 수 내 피와 부드러운 근육 세포6 또는 주변 혈액7를 사용 하 여 수행 되었다. 혈관 중 프로토콜 추가 간 문맥 방해6,7소아 환자 이식에 기능 혈액 공급을 제공 하 임상 약속을 보여주었다 recellularized.
우리는 현재 직경이 작은 혈관의 decellularization, recellularization 및 생물 처리의 향상 된 쉽고 성능에 대 한 동일한 프로토콜의 수정된 된 버전을 개발 했습니다. 현재 decellularization 프로토콜 세제와 동요 대신 압력을 사용 하 여 정 맥을 통해 세제의 관류가 필요 합니다. Recellularization 프로토콜의 늘어진 세포 접착 및 세포 접착, 생존 및 확산 개선을 위한 혈액 순환에 성장 요인의 개선에 대 한 추가 단계를 포함 한다. 우리는 또한 상업적으로 사용할 수 있는 제품을 사용 하 여 생물 반응 기의 디자인을 개량 했다. 이 논문에서는, decellularization와 인간의 saphenous 정 맥의 recellularization를 수행 하기 위한 수정 된 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 선물이.

<table><tbody><tr><td>4-Port Cap</td><td>CPLabSafety</td><td>WF-GL45-4Kit</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl salicylic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5376</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Lonza</td><td>cc-4113B</td><td></td></tr><tr><td>Blood Glucose monitoring system - Free style Lite</td><td>Abbott</td><td>70808-70</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Worthington</td><td>LS0020007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS with CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt dihydrate</td><td>AlfaAesar</td><td>A15161.OB</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Growth Factors Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EG-VEGF</td><td>Peprotech</td><td>100-44</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottle 250ml</td><td>VWR</td><td>2151593</td><td>Any bottle with GL45 cap can be used</td></tr><tr><td>Glass bottle 1L</td><td>VWR</td><td>2151595</td><td>Any bottle with GL45 cap can be used</td></tr><tr><td>Glass jar 500ml with bottom hose outlet</td><td>Kimble Chase Life Science</td><td>14607</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Leo</td><td>387107</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Coated Vacutainer Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>Human AB Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3667</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Luer Female with 1/8&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LF-2PP-QC</td><td>For 3X5mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Female with 3/32&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LF-1.5PP-QC</td><td>For 2X4mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Male with 3/32&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-1.5PP-QC</td><td>For 2X4mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Male with 1/8&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-2PP-QC</td><td>For 3X5mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Male with 5/32&quot; ID Barb</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45518-06</td><td>For 5X8mm silicon tube</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologies</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Per acetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>433241</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump I</td><td>Masterflex</td><td>7524-45</td><td>For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75</td></tr><tr><td>Peristaltic pump II</td><td>Ismatec</td><td>ISM941</td><td>For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor.</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydrogen phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Reducing Connector 1.5mmX2.5mm</td><td>Biotech</td><td>ISM569A</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Ika</td><td>KS4000 i&amp;nbsp; control</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen phosphate</td><td>Merck</td><td>71640-M</td><td></td></tr><tr><td>Steen solution</td><td>Xvivo</td><td>19004</td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Agnthos</td><td>14817</td><td></td></tr><tr><td>Tri-n-butyl Phosphate</td><td>AlfaAesar</td><td>A16084.AU</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>AlfaAesar</td><td>A16046.OF</td><td></td></tr><tr><td>Tube 60ml with flat base</td><td>Sarstedt</td><td>60596</td><td></td></tr><tr><td>Tube A</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td></tr><tr><td>Tube B</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube C</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3</td></tr><tr><td>Tube D</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2</td></tr><tr><td>Tube E</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube F</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td></tr><tr><td>Tube G</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td></tr><tr><td>Tube H</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube I</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube J</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube K</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr></tbody></table>

decellularization and recellularization methodology for human saphenous veins

혈관 도관 대부분 혈관 수술 하는 동안 사용 되는 종종 면역 억제와 가난한 patency로 인 한 합병증으로 이어질 수용자 또는 합성 이식입니다. 조직 공학 decellularization 및 recellularization 메서드를 사용 하 여 받는 사람의 세포를 포함 하는 자연적인 기질과 개인된 이식 생성 하 새로운 솔루션을 제공 합니다. 우리 주변 혈액의 재 관류에 의해 인간의 saphenous 정 맥 및 recellularization의 decellularization를 수행 하기 위한 자세한 방법을 보여줍니다. Perfusing 1%에서 정 맥 decellularized 했다 트라이 톤 X-100, 1% 트라이-n-부 틸-인산 염 (TnBP) 및 deoxyribonuclease (DNase)의 2000 Kunitz 단위. 트라이 톤 X-100 및 TnBP DNase 4 h 37 ° C에서 10 mL/min에 끼얹는다는 하는 동안 4 h 35 mL/min에 끼얹는다 했다. 정 맥 초순와 PBS로 세척 되었고 0.1% 초 산에 멸 균. 그것은 다시 PBS로 세척 되었고 preconditioned 내 피 중간에. 정 맥은 생물에 연결 되었고 끼얹는다 50 IU/mL를 포함 하는 내 피 매체 1 h. Recellularization에 대 한 헤 파 린 신선한 혈액으로 생물, Steen 솔루션, 희석된 1: 1을 작성 하 고 내 분 비 동맥에서 파생 된 추가 의해 수행 됐다 혈관 내 피 성장 인자 (80 ng/mL), 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (4 µ L/mL), 및 아 세 틸 살리실산 (5 µ g/mL). 생물에 인큐베이터에 이동 했다 그리고 3-9 mmol/l. 사이 포도 당을 유지 하면서 2 mL/min에서 48 h에 끼얹는다 나중에, 정 맥 PBS로 세척, 내 피 매체 가득 이었고 인큐베이터에서 96 h 끼얹는다. 트라이 톤 X-100, TnBP와 DNase 치료 5 사이클에서 saphenous 정 맥 decellularized. Decellularized 정 맥 백색 정상 및 recellularized 정 맥 (라이트 레드) 달리 보였다. 되며 & 오신 (H & E) 얼룩만 정상 decellularized 정 맥에만 핵의 존재를 보여주었다. Recellularized 정에서 H & E 염색는 정 맥의 luminal 표면에 세포의 존재를 보여주었다.

정상적인 정 맥의 심한 형태는 빛 빨강 (그림 3A). 붉은 색 진보적인 decellularization 주기에서 분실 된다 (주기 2, 그림 3B; 3, 주기 그림 3C) 5번째 사이클에 의해 그것은 창백 하 고 흰색 (그림 3D) 보입니다. Recellularized 정 맥 혈액 관류 (그림 3E)와 내 피 미디어 관류 (그림 3 층) 후 색상에 밝은 빨강을 보인다. Decellularization 치료의 5 주기 성공적으로 제거 세포는 정 맥에서 아니 블루 핵은 H & E 염색 (그림 4B)에서 본 했다. 반면, 여러 핵 정상 정 맥 (그림 4A)에서 볼 수 있었다. Luminal 측에 연결 된 세포의 존재는 혈액 관류 96 h (그림 3D, 검은 화살표)에 대 한 내 피 매체와 전후 48 h (그림 4C, 검은 화살표)에 대 한 recellularized 정 맥에 H & E 염색에 표시 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig1.jpg"> 그림 1 : Decellularization에 대 한 설정을 관류의 조립. A) 그림 Triton X-100 조립된 decellularization 설치 1 표시 및 세척. 흰색 화살표 표시 솔루션에 대 한 흐름 경로 이며 빨간색 화살표 후미와 정 맥 및 솔루션에 대 한 콘센트. B) TnBP 관류에 대 한 조립된 decellularization 설치 2를 보여주는 그림. 마찬가지로, decellularization 설치 1에서 흰색 화살표 솔루션에 대 한 흐름 경로 나타내고 빨간색 화살표 표시 후미 및 정 맥 및 솔루션에 대 한 합니다. C) deoxyribonuclease 관류에 대 한 조립된 decellularization 설치 프로그램 3을 보여주는 그림. 와 흰색 화살표 표시 솔루션에 대 한 흐름 경로 빨간색 화살표 표시 정 맥 및 솔루션에 대 한 후미. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57803/57803fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig2.jpg"> 그림 2 : 준비 및 recellularization에 대 한 생물의 조립. A) 그림을 보여주는 자료는 생물을 조립 하는 데 필요한. B) 정 맥 입구 및 출구 (흰색 화살표) 및 튜브 H, I 및 제이의 배열에 연결할 커넥터 (빨간색 화살표), 감소의 배치를 보여주는 4-포트 캡의 안쪽의 사진 포인트 튜브 H의 무료 끝 반환 미디어 생물에 배치 됩니다. C) 와 외출 각각 튜브 4 포트 캡의 상단 측면에서 볼 수 있습니다. D) 조립된 생물을 보여주는 그림. E) 연동 펌프 전체 생물 설치를 보여주는 그림. K 튜브 연동 펌프에는 생물 반응 기에서 연결을 확장합니다. F) 전체 생물 관류 시스템의 도식 대표. 주황색 화살표는 흐름의 방향을 나타냅니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57803/57803fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig3.jpg"> 그림 3 : Decellularization 및 recellularization 중 혈관의 형태를 총. A) 정상 정 맥의 심한 형태 컬러로 밝은 빨간색을 보인다. 색상은 decellularization 사이클의 수를 증가 함께 손실 B) 2 주기 및 C) 3 주기. D) 5 주기, 정 맥 보이는 창백한, 흰색. E와 함께 perfusing 후 정 맥) 48 h와 F에 대 한 혈액) 96 h에 대 한 내 피 중간 컬러로 다시 한번 밝은 빨간색 보인다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57803/57803fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig4.jpg"> 그림 4 : Decellularized와 recellularized 혈관의. 되며 고 오신 얼룩의 이미지 A) 정상 정 맥 포함 많은 블루 핵 하지만 그들은 결 석 하다에서 B) decellularized 정 맥. 정 맥으로 recellularized에서 C) 혈액 48 h에 대 한 D) 96 h, 루멘에 셀 (검은 화살표)의 첨부 파일에 대 한 내 피 매체 발견 했다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57803/57803fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization 및 Recellularization 방법론을 인간의 Saphenous 정 맥에 대 한

여기, 우리 주변 혈액과 내 피 매체의 관류 하 여 세제 및 recellularization를 사용 하 여 saphenous 정 맥 decellularization에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

decellularization-recellularization-methodology-for-human-saphenous

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.1K 조회수.  University of Gothenburg. 여기, 우리 주변 혈액과 내 피 매체의 관류 하 여 세제 및 recellularization를 사용 하 여 saphenous 정 맥 decellularization에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

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Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

전체 간은의 Decellularization 및 Recellularization

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

연구

생체공학

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk of thromboemboli formation1,2,3. We have developed a method to line the inside surface of Ti tubes with autologous blood-derived human or porcine endothelial progenitor cells (EPCs)4. By implanting Ti tubes containing a confluent layer of porcine EPCs in the inferior vena cava (IVC) of pigs, we tested the improved biocompatibility of the cell-seeded surface in the prothrombotic environment of a large animal model and compared it to unmodified bare metal surfaces5,6,7 (Figure 1). This method can be used to endothelialize devices within minutes of implantation and test their antithrombotic function in vivo. 
Peripheral blood was obtained from 50 kg Yorkshire swine and its mononuclear cell fraction cultured to isolate EPCs4,8. Ti tubes (9.4 mm ID) were pre-cut into three 4.5 cm longitudinal sections and reassembled with heat-shrink tubing. A seeding device was built, which allows for slow rotation of the Ti tubes. 
We performed a laparotomy on the pigs and externalized the intestine and urinary bladder. Sharp and blunt dissection was used to skeletonize the IVC from its bifurcation distal to the right renal artery proximal. The Ti tubes were then filled with fluorescently-labeled autologous EPC suspension and rotated at 10 RPH x 30 min to achieve uniform cell-coating9. After administration of 100 USP/ kg heparin, both ends of the IVC and a lumbar vein were clamped. A 4 cm veinotomy was performed and the device inserted and filled with phosphate-buffered saline. As the veinotomy was closed with a 4-0 Prolene running suture, one clamp was removed to de-air the IVC. At the end of the procedure, the fascia was approximated with 0-PDS (polydioxanone suture), the subcutaneous space closed with 2-0 Vicryl and the skin stapled closed. 
After 3 - 21 days, pigs were euthanized, the device explanted en-block and fixed. The Ti tubes were disassembled and the inner surfaces imaged with a fluorescent microscope.
We found that the bare metal Ti tubes fully occluded whereas the EPC-seeded tubes remained patent. Further, we were able to demonstrate a confluent layer of EPCs on the inside blood-contacting surface.
Concluding, our technology can be used to endothelialize Ti tubes within minutes of implantation with autologous EPCs to prevent thrombosis of the device. Our surgical method allows for testing the improved biocompatibility of such modified devices with minimal blood loss and EPC-seeded surface disruption.

A method for seeding titanium blood-contacting biomaterials with autologous cells and testing biocompatibility is described. This method uses endothelial progenitor cells and titanium tubes, seeded within minutes of surgical implantation into porcine venae cavae. This technique is adaptable to many other implantable biomedical devices.

Autologous 내피 전구 세포 - 심는 기술 및 대형 동물 모델에서 순환기 장치에 대한 Biocompatibility 테스트

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

인간의 3 차원의 조직 공학<em&gt; 시험관</em&gt; 종양 테스트 시스템

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

마우스 모델에서 조직 공학 혈관의 생성 및 손톱 확장

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

인간 복재 정맥 절차<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 관류 및 외부 보강

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

의학

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

맞춤형 관류 생물 반응기에서 돼지 혈관 플랩의 조달 및 관류-탈세포화

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an evolving reconstructive avenue for transferring multiple tissues as a composite subunit. Despite the promising nature of VCA, the long-term immunosuppressive requirements are a significant limitation due to the increased risk of malignancies, end-organ toxicity, and opportunistic infections. Tissue engineering of acellular composite scaffolds is a potential alternative in reducing the need for immunosuppression. Herein, the procurement of a rat hindlimb and its subsequent decellularization using sodium dodecyl sulfate (SDS) is described. The procurement strategy presented is based upon the common femoral artery. A machine perfusion-based bioreactor system was constructed and used for ex vivo decellularization of the hindlimb. Successful perfusion decellularization was performed, resulting in a white translucent-like appearance of the hindlimb. An intact, perfusable, vascular network throughout the hindlimb was observed. Histological analyses showed the removal of nuclear contents and the preservation of tissue architecture across all tissue compartments.

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

We describe the surgical technique and decellularization process for composite rat hindlimbs. Decellularization is conducted using low-concentration sodium dodecyl sulfate through an ex vivo machine perfusion system.

혈관화된 복합 동종 이식을 위한 생체 내 관류 기반 생물반응기를 사용한 쥐 뒷다리의 조달 및 탈세포화

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

Synergizing Antegrade Endoscopic with Bridging Vein Harvesting for Improvement of Great Saphenous Vein Graft Quality from the Lower Leg

Antegrade endoscopic harvesting of autografts for bypass grafting may be an optimal strategy addressing excellent graft quality and reduced post-operative wound complications. This standardized protocol for antegrade endoscopic vein harvesting (EVH) from the lower leg has the potential to be introduced to routine coronary artery bypass grafting (CABG). Patients undergoing CABG surgery are positioned on a surgical table with two additional foam rollers below the extended legs, enabling antegrade EVH from the lower leg. Following minimally invasive surgical access through a bridging vein harvest technique, an endoscopic optical dissector is inserted antegrade into the wound. The main vessel and side branches are dissected under continuous optical control of vein quality status and the working channel. After, an endoscopic optical retractor is inserted with an internal bipolar electrocoagulation device for precise, safe, and tissue-protective interruption of side branches. After release of the vein, the vessel is cut off at the proximal and distal ends under optical control, retrieved from the wound, then cannulated and flushed with heparinized saline. Finally, all side branches of the vein graft are double-clipped. Vascular histology is analyzed in a randomized selection of vein samples. After applying this standardized EVH protocol, the learning curve was shown to be steep, and graft quality was sufficient for coronary artery bypass grafting in every case. There was no conversion to surgical harvesting and low risks for tissue damage and bleeding. Leg positioning and synergizing EVH with bridging vein harvesting improved procedural success and vein graft quality. In our hands, antegrade EVH from the lower leg was feasible, demonstrating straightforward graft dissection as well as adequate macroscopic and microscopic graft quality with preserved endothelial integrity. In conclusion, the introduced technique is safe, shows excellent vein autograft quality, and illustrates feasibility for elective and urgent isolated CABG and combined CABG scenarios.

Presented here is a protocol for antegrade endoscopic vein harvesting from the lower leg, which can safely be introduced in routine coronary artery bypass grafting. Vein grafts present excellent graft quality following this standardized protocol with positioning of the legs, minimally invasive access to the vein, and antegrade endoscopic vein harvesting.

하부 다리에서 훌륭한 사페누스 정맥 이식 품질의 개선을 위한 브리징 정맥 수확과 영양 내시경 시너지 효과

Antegrade endoscopic harvesting of autografts for bypass grafting may be an optimal strategy addressing excellent graft quality and reduced post-operative ...

A Training and Testing System for Performing Vascular Reconstruction In Vitro

Manual vascular reconstruction training is essential for a beginner surgeon. However, an optimal training system for vascular reconstruction in vitro has yet to be developed. In this study, we introduce an in vitro training and testing system using a magnetic anchoring technique with which a trainee can practice manual vascular reconstruction individually. Additionally, this system can also be used to test the quality of the reconstruction. The described system includes a vascular reconstruction training machine, magnetic tractors, and a magnetic suture puller. In this manuscript, we detail an end-to-end vein anastomosis using porcine right and left iliac veins. To identify the potential damage caused by a magnetic suture puller on the suture, we created three groups with six segments of 4-0 polypropylene sutures each: a control group with no intervention on the polypropylene suture, a group in which the polypropylene suture is manually pulled with sterile gloves 20x, and a magnetic puller group in which the magnetic puller pulled the polypropylene suture 20x. These groups were tested by light microscopy and breaking strength tests, and the effect of reconstruction was assessed. In the light microscopy test, the control group was less likely to be damaged (p &#60; 0.05) and the number of damaged points of the manual group and magnetic puller group were similar (p &#62; 0.05). The results of the breaking strength test were compared across groups and no significant difference was observed (p &#62; 0.05). The end-to-end anastomosis of the porcine iliac veins was successfully performed using this training system, and the reconstructed veins could undergo 2.0 kPa perfusion pressure. Using this training and testing system the trainee can practice manual vascular reconstruction in vitro individually with the aid of magnetic tractors and a magnetic suture puller, and the quality of the reconstruction can be tested.

Here we present a training and testing system where a trainee can complete manual vascular reconstruction in vitro individually using a magnetic anchoring technique. The system can also be used to test the quality of reconstruction.

체외에서 혈관 재건을 수행하기 위한 교육 및 테스트 시스템

Manual vascular reconstruction training is essential for a beginner surgeon. However, an optimal training system for vascular reconstruction in vitro has ...

Occlusion of the Great and Small Saphenous Vein Using Copolymeric Glue Based on N-Butyl Cyanoacrylate and Methacryloxy Sulfolane

We present the preliminary results of a longitudinal observational study aimed at evaluating the effectiveness and safety at different short- and long-term follow-ups of vascular occlusion of the great saphenous vein (GSV) and small saphenous vein (SSV) affected by severe pathological reflux, using an innovative modified cyanoacrylate surgical glue composed of N-butyl cyanoacrylate and methacryloxy sulfolane (NBCA+MS). Ninety patients, prospectively recruited for 1 year, underwent the study with EcoColor-Doppler (ECD) to evaluate the maximum diameters of the GSV and SSV in the orthostatic position and the reflux time (RT). An RT greater than 0.5 s was considered pathologic. Clinical, etiology, anatomy, and pathophysiology (CEAP) assessment was used for the complete evaluation of each patient in the study. All the patients were treated by NBCA+MS glue to obtain vein occlusion and observed before treatment (baseline; T0), within 6 h after treatment (T1), 1 month after treatment (T2), 3 months after treatment (T3), 6 months after treatment (T4), and 1 year after treatment (T5). Chi-square (&#967;) analysis was performed to evaluate the effectiveness and safety of the treatment. All the patients participated in the entire duration of the study. Complete occlusion was maintained in 100% of patients at T1, 98.9% at T2 and T3, and 97.8% at T4 and T5 (p &lt; 0.001). None of the patients suffered from post-surgical thrombosis. No blue hyperpigmentation, or paresthesia was observed during the entire observation period. Immediately after treatment, 7.7% of patients needed painkillers; 1 week after treatment, 100% of patients returned to normal life. Vascular occlusion of the great or small saphenous vein using NBCA+MS glue is a safe procedure with persistent benefits after a 1 year follow-up. This procedure can be performed with local anesthesia, allowing a quick return to normal life. Thanks to its low invasiveness, the treatment is not painful.

Here, we present a protocol to treat the great saphenous vein (GSV) and the small saphenous vein (SSV) affected by severe pathological reflux, using an original sclerosing and embolizing cyanoacrylate-based glue composed of N-butyl cyanoacrylate and methacryloxy sulfolane (NBCA+MS).

Decellularization 및 Recellularization 방법론을 인간의 Saphenous 정 맥에 대 한

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