Name: a simple flow cytometry based assay to determine in vitro antibody dependent enhancement of dengue virus using zika virus convalescent serum
Uploaded: 2018-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum at JoVE.com

설명된 프로젝트 JJM에 건강 과학의 Uniformed 서비스 대학에서 기금에 의해 지원 되었다. 의견이 나 주장을 여기에 포함 된 저자의 개인 그들 고 수 해석으로 공식 또는 반영의 플레이 국방부, 건강 과학의 Uniformed 서비스 대학 또는 미국의 다른 기관 정부입니다.
WGV 모든 실험을 수행 하 고 분석 데이터; JJM 설계 하 고 감독 연구; WGW와 JJM 종이 썼다.

여기에 설명 된 프로토콜을 설명 하는 데 사용 하는 혈 청 샘플 평가 및 실험 동물 관리 인증 협회에서 지 내게 및 지역, 주에 대 한 신경 및 연방 정책 이었던 붉은 털 원숭이에서 가져온 국제 (AAALAC)-시설 인가. 모든 동물 실험 했다 검토 하 고 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 샘플 공유 프로토콜 조직을 통해 인수 했다.
1. 주 1
참고: BSL-2 실험실에서 조직 문화에 사용 되는 살 균 층 류 biosafety 캐비닛에 아래 설명 된 모든 단계를 수행 합니다.
<ol><li>혈 청 샘플 실 온에서 해 동 하 고 무 균 튜브에 각 혈 청 샘플의 100 µ L를 전송. 열 물 목욕 또는 온도 조정 가능한 thermomixer 56 ° C에서 30 분 동안 비활성화. 1:1,000 찬 RPMI-10 (10% 태아 둔감 한 혈 청와 RPMI)를 사용 하 여 1: 1에서 배열 하는 혈 청 샘플의 10 연속 희석을 확인 합니다.</li>
	<li>살 균 96 잘 V-하단 플레이트의 각 음을 순차적으로 희석된 혈 청 샘플의 10 µ L를 전송 합니다. 고 하지 않고 혈 청 견본과 RPMI-10만 RVPs와 혈 청 샘플 없이 제어 웰 스, RVPs와 RPMI-10의 두 세트를 포함 합니다. 각 혈 청 샘플 및 triplicates RPMI-10 컨트롤을 설정 합니다.</li>
	<li>-80 ° C 냉동 및 해 동에서 뎅기열 1, 2, 3, 4 RVPs를 제거 37 ° C 물 목욕에서 그들. 해 동된 RVPs 얼음을 즉시 전송 합니다. 각 혈 청 샘플 약 170 µ L RVPs를 얻기 (각 혈 청 희석에 대 한 RVPs x 3 우물의 10 µ L (1:1, 1시 10분, 1: 100, 1:1, 000) 및 10 µ L 각 RVP와 RPMI-10 RVPs x 3 우물의 우물을 제어).</li>
	<li>각 잘 96 잘 V-바닥판 혈 청 샘플을 포함 하 고 RVPs (혈 청) 제어 웰 스와 RPMI-10 RVPs의 10 µ L 플라스틱 RVPs RPMI-10만 (아무 혈 청 샘플 및 아무 RVP) 우물을 추가 하지 마십시오. 위쪽 및 아래쪽 pipetting으로 철저 하 게 혼합 5-10 시간. 10 µ L 찬 추가 RPMI-10 대신 각 냉 RPMI-10 RVPs (아무 혈 청 샘플 및 아무 RVP) 제어 우물만.</li>
	<li>인큐베이터에 96-잘 V-바닥판을 전송 하 고 5% CO2의 37 ° C에서 1 시간 동안 접시를 품 어. 96-잘 V-바닥판 잠복기 동안 biosafety 70% 에탄올과 캐비닛의 표면을 청소 하 고 15 분 동안 자외선을 실행 합니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 K562 셀의 완전 confluent T75 플라스 크를 제거 하 고 잘 사용 하 여 살 균 5 mL 피펫으로 세포를 섞어 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 세포의 5 mL을 전송. 참고: K562 셀 RPMI-10에서 유지 되며 1 x 106/mL에서 subcultured.</li>
	<li>살 균 15 mL 원뿔 튜브에서 10 µ L 세포를 제거 하 여 세포의 수를 계산 하 고 10 µ L tryphan 블루 믹스. 15 mL 원뿔 튜브에 세포의 총 수를 결정 하는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>15 mL 원뿔 세포 ~ 1200 x g에서 10 분간 원심, 상쾌한, 가만히 따르다와 미디어 (106 세포 /mL x 2.66)의 80, 000 셀/30 µ L의 농도에서 따뜻한 RPMI-10 셀 resuspend.</li>
	<li>인큐베이터 (단계 1.6)에서 96 잘 V-바닥판을 제거, 96-잘 V-하단 플레이트의 각 잘 K562 셀 30 µ L 전송 및 아래로 pipetting으로 철저 하 게 혼합 5-10 시간. 인큐베이터에 96-잘 V-바닥판을 전송 하 고 5% CO2의 37 ° C에서 1 시간에 대 한 접시를 품 어.</li>
	<li>1 시간 배양 후 5 분 동안 인큐베이터와 ~ 1200 x g에서 원심 분리기에서 96 잘 V-바닥판을 제거 합니다. 원심, 후 거꾸로 10% 표 백제를 포함 하는 컨테이너에 접시를 켜서 우물에서 미디어를 가만히 따르다.</li>
	<li>따뜻한 RPMI-10의 125 µ L에서 resuspending에 의해 각 잘에서 셀을 세척 하 고 피 펫, 철저 하 게 믹스 10% 표 백제를 포함 하는 컨테이너에 거꾸로 접시 여 ~ 1200 x g 5 분 Decant 미디어에서 격판덮개 원심. 이 세척 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>세척, 후 RPMI-10 각, 믹스를 위아래로 피펫으로, 따뜻한 100 µ L을 추가 하 고 5% CO2의 37 ° C에서 48 h에 대 한 접시를 품 어.</li>
</ol>2. 주 3
<ol><li>96-잘 V-바닥판 포함 하는 셀의와 미디어/잘 인큐베이터에서 100 µ L을 제거 하 고 biosafety 캐비닛으로 이동. 멀티 채널 피 펫, 믹스를 사용 하 여 각각의 내용을 잘 셀을 전송 하 고 96 잘 U 아래 미디어 접시 또는에 미리 5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브 표시.</li>
	<li>1%의 100 µ L 96 잘 V-하단 플레이트에 각 잘 린스 Paraformaldehyde (PFA) 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 및 단계 2.1에서에서 96 잘 U-바닥판 또는 레이블된 5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 각각 웰 스 전송 최종 수익률 x 1 0.5%의 농도 PFA/잘 또는 튜브. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 철저 하 게 믹스, 알루미늄 호 일, 플레이트 커버와 셀을 해결 하기 위해 30 분 동안 인큐베이터에 앉아 보자.</li>
	<li>교류 cytometer 준비 (예를 들어 테이블의 자료 를 참조) 흠 없는 K562 셀 측면과 앞으로 분산형 형광 설정 함께 보정을 실행 하 여. 필요한 유일한 형광 채널은 FL1, GFP는 유일한 형광 세포에서 방출. 취득 ~ 30, 000-50000 각 샘플에서 세포. 참고: 단일 형광을 읽을 수 있는 모든 교류 cytometer로 셀 RVPs 감염 것입니다만, GFP의 존재 때문에 녹색 형광을 방출 하 고 다른 형광 채널 필요 데이터를 위해 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 데이터 분석
<ol><li>
어떤 흐름 cytometry 분석 소프트웨어를 사용 하 여 교류 cytometer에서 수집한 데이터를 분석 (재료의 표 참조).
	<ol>
<li>첫 번째 문 집합 기반으로 FSC-A (앞으로 분산형-지역) vs FSC-H (앞으로 분산형-높이) 단일 세포를 포함 분석12자동 형광 남자를 제외 하. 다음, SSC에 기반 내의 문이 셀 게이트 (사이드 분산형-지역) vs FSC-A 모든 autofluorescent 파편을 제외 하.</li>
		<li>GFP의 표현 SSC A 대 대 한 SSC A vs FSC-A 문이 세포 분석 GFP-. GFP + 셀 주위는 게이트를 설정 하 여 GFP + 혈 청 및 제어 샘플의 각 희석에 대 한 셀의 비율을 결정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 triplicate 우물에 GFP + 셀의 총 비율을 분할 하 여 각 혈 청 샘플 희석 및 제어 우물 GFP + 셀의 평균 비율을 결정 합니다.</li>
	<li>감염의 배 향상 GFP + 셀 GFP + RVPs (혈 청 샘플) 제어 웰 스와 RPMI-10에서 셀의 평균 비율을 나눈 각 희석에 대 한 혈 청 샘플의 평균 비율을 나누어 계산 합니다.</li>
	<li>희석 (x 축), 대 배 향상 (y 축) 그래프와 Tukey의 다중 비교에 대 한 게시물-특별 테스트 뒤 ANOVA를 사용 하 여 통계 분석을 수행.</li>
</ol>

<ol>
	<li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prior+exposure+to+zika+virus+significantly+enhances+peak+dengue-2+viremia+in+rhesus+macaques.">Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques.</a> Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).</li><li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity,+cross-reactivity,+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection.">Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li><li>Mattia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+reporter+virus+particles+for+measuring+neutralizing+antibodies+against+each+of+the+four+dengue+serotypes.">Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes.</a> PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).</li><li>Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via, ., F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclass+specificity+of+the+Fc+receptor+for+human+IgG+on+K562.">Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562.</a> Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).</li><li>Klein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+K562+cell+line,+derived+from+a+patient+with+chronic+myeloid+leukemia.">Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia.</a> Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).</li><li>Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+growth+in+human+monocytes+as+a+risk+factor+for+dengue+hemorrhagic+fever.">Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever.</a> Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).</li><li>Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IgG+Fc+receptor+II+mediates+antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+infection.">Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection.</a> J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).</li><li>Wang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+antibodies+to+dengue+enhanced+for+FcgammaRIIIA+binding+determine+disease+severity.">IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity.</a> Science. 355 (6323), 395-398 (2017).</li><li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans.">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li><li>Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus-induced+antibody+response+enhances+dengue+virus+serotype+2+replication+in+vitro.">Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro.</a> J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).</li><li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies.">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).</li><li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine+reactive+dyes:+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry.">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li><li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+Cell+responses+during+secondary+dengue+virus+infection+are+dominated+by+highly+cross-reactive,+memory-derived+plasmablasts.">B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts.</a> J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).</li><li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus.">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

DENV 및 ZIKV 같은 Flaviviruses 상 동13,14서로와 cross-react 항 체를 생성 하는 그들의 둘 다 구조와 비 구조 단백질의 중요 한 증거를 공유 합니다. 이러한 cross-reactive 항 체 응답을 향상 시키기 위해 표시 되었습니다 감염의 vivo에서 그리고 생체 외에서 분리 serotype 또는 다른 관련 flaviviruses1,2. 교차 감염?...

감염의 항 체 의존 향상 (ADE) 그것에 의하여 부분적으로 cross-reactive 항 체 응답 바이러스의 serotype에 의해 유도 된 향상 증가 바이러스 성 복제 및 니 바이러스의 다른 serotype의 과정 이다. 에이드는 뎅기열 바이러스 (DENV) 감염 4 주요 serotypes는 유행에서 광범위 하 게 문서화 되었습니다. 환자의 하위 집합에서 ADE 뎅 그 열 출혈 성 열 (DHF)와 연결 됩니다. 우리는 최근에 Zika 바이러스 (ZIKV) 감염 에이드의 DENV 체 외 발생 가능성이 DENV 니 vivo에서1 의 향상에 기여 하는 DENV cross-reactive 항 체 응답의 상당히 높은 수준의 유도 나타났습니다. , 2. 항 체 의존 향상 분석 실험은 관련 바이러스 2 차 감염을 강화 flavivirus 감염의 병 인에 중요 한 통찰력을 제공 하 고 알려주는 항 체의 능력을 평가 하는 유용한 도구는 백신의 개발입니다.
분석 결과 설명 여기 감염을 일반적으로 허용 하지 않은 K562 셀 함께 DENV RVPs를 사용 합니다. RVPs는 구조적으로 그대로 복제 무능 한 DENV 바이러스 성 입자를 복제3의 단일 라운드 후 표현 되는 하위 게놈 녹색 형광 단백질 (GFP) replicon 인코딩. 이와 같이, RVPs에 감염 되는 세포 형광 녹색 및 cytometry 또는 현미경을 사용 하 여 쉽게 감지가 가능. 이 분석 결과에서 사용 하는 RVPs 상용 소스 로부터 얻은 했다. 그러나 그들은,, 수 다른 바이러스에 대 한 생성 하 고이 원고에서 설명 하는 분석에 사용. 한편, K562 세포는 FcγIII 수용 체 표현 하는 백혈병 세포 선 항 체의 Fc 지역에 바인딩할 하 고 하위 중화 항 체4,5의 농도 존재 감염 될 있습니다.
에이드 분석 심한 뎅기열 및 생체 외에서 ADE의 메커니즘을 나타내는 위험 요인 조사 연구에서 광범위 하 게 사용 된6,,78. 여기에 설명 된 에이드 분석 결과 신속 하 고 쉽게 사용할 수 RVPs를 사용 하 여 체 외에서 감염을 강화 하 고 flow cytometry, 현재 사용 중 하나 필요로 하는 다른 분석에 비해 플 라크 형성의 결정에 대 한 혈 청의 용량을 확인 Vero 세포 또는 항 체의 얼룩에 (pfu) 단위 세포6,7,,89,10,11, 둘 다 시간이 소요 되며 노동 감염 집중.

<table><tbody><tr><td>DENV 1-4 RVP</td><td>Integral Molecular</td><td>RVP-501</td><td></td></tr><tr><td>K562 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE lifesceinces</td><td>SH 30910.03</td><td>10% FBS in RPMI-10</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>MP biomedicals</td><td>1670049</td><td>100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellegro</td><td>25-060-Cl</td><td>0.025M in RPMI-10</td></tr><tr><td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100&amp;times;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>1x in RPMI-10</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Cellegro</td><td>25-000-Cl</td><td>1mM in RPMI-10</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25005CI&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile V-bottom plates</td><td>Thomas Scientific</td><td>333-8001-01V</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>Non-sterile U-bottom plates</td><td>Falcon</td><td>Ref 353910</td><td>A high throughput alternative to FACS tubes</td></tr><tr><td>5mL, sterile, serological pipette</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>200uL sterile pipette tips</td><td>Denville</td><td>P3020 CPS</td><td></td></tr><tr><td>20uL sterile pipette tips</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>50-200uL multichannel pipette</td><td>Denville</td><td>P3975-8-B</td><td></td></tr><tr><td>5-50uL multichannel pipette</td><td>Denville</td><td>P3975-9-B</td><td></td></tr><tr><td>20% formadehyde</td><td>Tousimis</td><td>&amp;nbsp;#1008B</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>ThermoFisher</td><td>TSCOL35</td><td></td></tr><tr><td>thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>2231000387</td><td>An alternative to a waterbath for heat inactivation</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>ThermoFisher</td><td>13-998-213</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Bleach</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo 9.8</td><td>TreeStar, Inc.</td><td></td><td>Flow cytometry analysis software</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 6.1.2</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II flow cytometer</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Bleach</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple flow cytometry based assay to determine in vitro antibody dependent enhancement of dengue virus using zika virus convalescent serum

감염의 항 체 의존 향상 뎅기열 바이러스 성 병 인에 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 허용 되지 않는 세포에 감염을 강화 하기 위하여 항 체 또는 혈 청의 용량을 측정 하는 전통적인 분석 패 분석 실험에 의해 다음 미디어에 바이러스 출력을 사용 하 여 감염을 계량에 의존 했습니다. 더 최근에, 이러한 분석 붙일 레이블된 항 체를 사용 하 여 셀 라인에서 뎅기열 바이러스 (DENV) 감염을 검사 있다. 이러한 두 방법 모두 이러한 기술의 광범위 한 사용을 제한 하는 제한 사항이 있습니다. 여기, 우리가 설명 하는 간단한 체 외에서 분석 결과 사용 하 여 뎅기열 바이러스 기자 바이러스 성 입자 (RVPs) 녹색 형광 성 단백질 및 항 체 의존 향상 (ADE) 붉은 털에서 얻은 혈 청을 사용 하 여 DENV 감염의 검사 K562 셀을 나타내는 원숭이 Zika 바이러스 (ZIKV) 감염 후 16 주. 이 기술은 신뢰할 수 있는, 포함 하는 셀의 최소한의 조작, 라이브 복제 유능한 바이러스의 사용을 포함 하지 않습니다 이며 cytometry 사용 하 여 양적 판독을 얻으려면 높은 처리량 형태로 수행할 수 있습니다. 또한이 분석 결과 항 체 의존 향상 (ADE) 황열병 바이러스 (YFV), 일본 말 뇌염 바이러스 (JEEV), 웨스트 나 일 바이러스 (WNV) RVPs를 사용할 수 있는 등 다른 flavivirus 감염의 검사에 쉽게 적응 될 수 있다. 분석 결과 설정의 용이성, 데이터를 분석 하 고 결과 해석 하면 높은 대부분의 실험실 설정 의무가 있습니다.

4 붉은 털 원숭이 ZIKV 감염 후 수집 된 16 주 및 DENV-1을 향상 시키기 위해 그들의 잠재력에 대 한 테스트에서 세라, K562 셀에 2, 3, 4 감염. 동물 감염 후 7 일에 의해 탐지의 제한 된 수준에 거부 하는 감염 후 3 일 ~ 105 부 ZIKV 플라즈마의 RNA/mL의 x 1의 피크 니를 했다. 아니 니 16 주 후 감염에서 플라즈마에서 발견 되었다. 그리고, RVP 분석 결과 수행 위의 프로토콜에 설명 ...

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A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

우리는 Zika 바이러스 미리 혈 청 뎅기열 바이러스 기자 바이러스 성 입자를 사용 하 여 감염의 항 체 의존 향상을 측정 하기 위한 간단 하 고 쉬운 프로토콜을 설명 합니다.

간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

a-simple-flow-cytometry-based-assay-to-determine-vitro-antibody

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

8.7K 조회수.  Uniformed Services University. 우리는 Zika 바이러스 미리 혈 청 뎅기열 바이러스 기자 바이러스 성 입자를 사용 하 여 감염의 항 체 의존 향상을 측정 하기 위한 간단 하 고 쉬운 프로토콜을 설명 합니다.

비디오: A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different downstream patient-to-patient transmission potentials, and require very different patient treatments. Thus, recent Zika outbreaks make it urgent to develop tools that rapidly discriminate these viruses in patients and trapped mosquitoes, to select the correct patient treatment, and to understand and manage their epidemiology in real time.
Unfortunately, current diagnostic tests, including those receiving 2016 emergency use authorizations and fast-track status, detect viral RNA by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), which requires instrumentation, trained users, and considerable sample preparation. Thus, they must be sent to &#34;approved&#34; reference laboratories, requiring time. Indeed, in August 2016, the Center for Disease Control (CDC) was asking pregnant women who had been bitten by a mosquito and developed a Zika-indicating rash to wait an unacceptable 2 to 4 weeks before learning whether they were infected. We very much need tests that can be done on site, with few resources, and by trained but not necessarily licensed personnel.
This video demonstrates an assay that meets these specifications, working with urine or serum (for patients) or crushed mosquito carcasses (for environmental surveillance), all without much sample preparation. Mosquito carcasses are captured on paper carrying quaternary ammonium groups (Q-paper) followed by ammonia treatment to manage biohazards. These are then directly, without RNA isolation, put into assay tubes containing freeze-dried reagents that need no chain of refrigeration. A modified form of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with target-specific fluorescently tagged displaceable probes produces readout, in 30 min, as a three-color fluorescence signal. This is visualized with a handheld, battery-powered device with an orange filter. Forward contamination is prevented with sealed tubes, and the use of thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG) in the presence of dUTP in the amplification mixture.

Current multiplexed diagnostics to detect Zika, chikungunya, and dengue viruses require complex sample preparation and expensive instrumentation, and are difficult to use in low resource environments. We show a diagnostic that uses isothermal amplification with target-specific strand displaceable probes to detect and differentiate these viruses with high sensitivity and specificity.

멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

연구

생화학

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과<em&gt; 체외</em인터페론의&gt; 예방 효과

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

면역학 및 감염병학

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

Zika 바이러스 특정 진단 Epitope 발견

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

감염 된 Ifnar1/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

기본 인간 세포에서 Zika 바이러스의 항 체 의존 향상의 정량화

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral load. The purpose of the procedure is to quantify viral titers in peripheral and CNS areas of the mouse at different time points post infection or under different experimental conditions to identify virologic and immunological factors that regulate Zika virus infection. The organ isolation procedures demonstrated allow for both focus forming assay quantification and quantitative PCR assessment of viral titers. The rapid organ isolation techniques are designed for the preservation of virus titer. Viral titer quantification by focus forming assay allows for the rapid throughput assessment of Zika virus. The benefit of the focus forming assay is the assessment of infectious virus, the limitation of this assay is the potential for organ toxicity reducing the limit of detection. Viral titer assessment is combined with quantitative PCR, and using a recombinant RNA copy control viral genome copy number within the organ is assessed with low limit of detection. Overall these techniques provide an accurate rapid high throughput method for the analysis of Zika viral titers in the periphery and CNS of Zika virus infected animals and can be applied to the assessment of viral titers in the organs of animals infected with most pathogens, including Dengue virus.

The goal of the protocol is to demonstrate the techniques used to investigate viral disease by isolating and quantifying Zika virus, from multiple organs in a mouse following infection.

마우스의 여러 장기에서 Zika 바이러스의 격리 및 정량화

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

지카 바이러스를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 벡터 역량 분석

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and potentially Guillain-Barr&#233; syndrome in adults. Research on ZIKV to understand the disease mechanisms is important to facilitate vaccine and treatment development. The method of quantifying viruses is crucial and fundamental in the field of virology. The focus forming assay (FFA) is a virus quantification assay that detects the viral antigen with antibodies and identifies the infection foci of cells using the peroxidase immunostaining technique. The current study describes the virus propagation and quantification protocol using both 24-well and 96-well (high throughput) formats. Compared with other similar studies, this protocol has further described foci size optimization, which can serve as a guide to expand the use of this assay for other viruses. Firstly, ZIKV propagation is performed in Vero cells for 3 days. The culture supernatant containing ZIKV is harvested and quantitated using the FFA. Briefly, the virus culture is inoculated onto Vero cells and incubated for 2-3 days. Foci formation is then determined after optimized staining processes, including cell fixation, permeabilization, blocking, antibody binding, and incubation with peroxidase substrate. The stained virus foci are visualized using a stereo microscope (manual counting in 24-well format) or software analyzer (automated counting in 96-well format). The FFA provides reproducible, relatively fast results (3-4 days) and is suitable to be used for different viruses, including non-plaque-forming viruses. Subsequently, this protocol is useful for the study of ZIKV infection and could be used to detect other clinically important viruses.

The present protocol describes the propagation of Zika virus (ZIKV) in Vero African green monkey kidney cells and the quantification of ZIKV using cell-based colorimetric immunodetection methods in 24-well and 96-well (high throughput) formats.

바이러스 전파 및 세포 기반 비색 정량화

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

Cell-Based Electrical Impedance Platform to Evaluate Zika Virus Inhibitors in Real Time

Cell-based electrical impedance (CEI)&#160;technology measures changes in impedance caused by a growing or manipulated adherent cell monolayer on culture plate wells embedded with electrodes. The technology can be used to monitor the consequences of Zika virus (ZIKV) infection and adherent cell replication in real time, as this virus is highly cytopathogenic. It is a straightforward assay that does not require the use of labels or invasive methods and has the benefit of providing real-time data. The kinetics of ZIKV infection are highly dependent on the employed cell line, virus strain, and multiplicity of infection (MOI), which cannot be easily studied with conventional endpoint assays. Furthermore, the CEI assay can also be used for the evaluation and characterization of antiviral compounds, which can also have dynamic inhibitory properties over the course of infection. This methods article gives a detailed explanation of the practical execution of the CEI assay and its potential applications in ZIKV research and antiviral research in general.

Here, we demonstrate the use of cell-based electrical impedance (CEI) as a very easy and straightforward method to study Zika virus infection and replication in human cells in real time. Furthermore, the CEI assay is useful for the evaluation of antiviral compounds.

지카 바이러스 억제제를 실시간으로 평가하기 위한 세포 기반 전기 임피던스 플랫폼

Cell-based electrical impedance (CEI)&#160;technology measures changes in impedance caused by a growing or manipulated adherent cell monolayer on culture ...

An In Vitro Assay for Screening Interferons as Potent Inhibitors of Zika Virus Growth

Source: Contreras, D. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54767">Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The video demonstrates an in vitro assay for screening interferons with antiviral activity against the Zika virus, a human pathogen. Within the host cell, the Zika virus undergoes multiplication upon internalization, infecting neighboring cells and creating distinct zones or viral plaques. Type I interferon, acting as an antiviral agent, hinders virus multiplication, thereby preventing the formation of viral plaques in the host cell monolayer.

지카 바이러스 성장의 강력한 억제제로서 인터페론을 스크리닝하기 위한 체외 분석

1. Screening Cytokine Library against Zika Virus Infection

	Seed naive Vero cells at 1 x 105 cells per well using a 12-well plate. Once the cells are ...

간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로

요약

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