הפרויקט המתוארת נתמכה על ידי כספים באוניברסיטת שירותי במדים של מדעי הבריאות כדי JJM. דעתם או את הנחרצות הכלול הם אלה פרטי של המחברים ואינם להיות לפרש הרשמי או המשקף את הנופים של משרד ההגנה, באוניברסיטת שירותי במדים של מדעי הבריאות או בכל חברה אחרת של ארצות הברית הממשלה.
WGV ביצע את כל הניסויים וניתח את הנתונים; JJM עוצב והשגחת המחקר; WGW JJM כתבו בעיתון.

הדוגמאות סרום בשימוש כדי להדגים את הפרוטוקול המתואר כאן, התקבלו קופי מקוק רזוס שהיו שוכנו, בהתאם במדינת מקומיים, ושלמישהו אכפת הפדרלית מדיניות שיוך עבור הערכת ולדאוג הסמכה של מעבדה חיה הבינלאומי (AAALAC)-מוכר מתקן. כל ניסויים בבעלי חיים היו נבדקו ואושרו על-ידי אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש, דגימות נרכשו דרך רקמה שיתוף פרוטוקול.
1. יום 1
הערה: בצע את כל השלבים המתוארים להלן ב- cabinet אבטחה בעל דירוג זרימה שכבתית סטרילי המשמש תרביות רקמה במעבדה BSL-2.
<ol><li>להפשיר את הדוגמאות סרום בטמפרטורת החדר, להעביר µL 100 לכל דגימת נסיוב צינור סטרילי. חום הפוך ללא פעיל למשך 30 דקות ב 56° C באמבט מים או של thermomixer טמפרטורה מתכוונן. להפוך 10-fold דילולים טורי של דגימת נסיוב ועד 1:1 1:1,000 באמצעות RPMI קר-10 (RPMI עם 10% סרום שור עוברית).</li>
	<li>העברת µL 10 דגימת נסיוב באופן סדרתי מדולל כל טוב של צלחת V-התחתון 96-ובכן סטרילי. כוללים שתי קבוצות של שליטה וולס, RPMI-10 עם RVPs בלבד, ללא דגימת נסיוב, ו RPMI-10 רק בלי RVPs ובלי דגימת נסיוב. להגדיר כל דגימת נסיוב ופקדים RPMI-10 ב- triplicates.</li>
	<li>להסיר את קדחת דנגה-1, 2, 3 ו 4 RVPs מן המקפיא-80 ° C ו להפשיר אותם בתוך אמבט מים 37 º C. להעביר את RVPs המופשרים מיד לקרח. להשיג כ 170 µL RVPs עבור כל דגימה סרום (10 µL של בארות RVPs x 3 עבור כל בסרום (1:1, 1:10, 1: 100, 1:1, 000) 10 µL של בארות RVPs x 3 עבור כל אחד ה-RPMI-10 עם RVP רק לשלוט וולס).</li>
	<li>פיפטה 10 µL של RVPs לתוך כל טוב של צלחת V-התחתון 96-ובכן המכיל את דגימת נסיוב, כדי RPMI-10 עם RVPs (ללא סרום) שליטה וולס. אל תוסיף בארות RVPs RPMI-10 בלבד (אין דגימת נסיוב, אין RVP). לערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 – 10 פעמים. להוסיף 10 µL קר RPMI-10 במקום RVPs על כל RPMI-10 קר בלבד (אין דגימת נסיוב RVP אין) ובקרת בארות.</li>
	<li>להעביר את הצלחת התחתונה V 96-ובכן אינקובטור, תקופת דגירה לצלחת של שעה ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות CO 5%2. בעוד צלחת V-התחתון 96-ובכן הוא המקננת, לנקות את השטח של אבטחה הקבינט עם-70% אתנול ולהפעיל את אולטרא סגול למשך 15 דקות.</li>
	<li>הסר בקבוקון T75 באופן מלא confluent של תאים K562 החממה, לערבב את התאים היטב באמצעות pipet מ ל סטרילי ולאחר להעביר 5 מ של תאים צינור חרוטי סטרילי 15 מ"ל. הערה: התאים K562 הם שמרו ב- RPMI-10, subcultured-עונה 1 פרק 106/mL.</li>
	<li>לספור את מספר תאים על-ידי הסרת תאים µL 10 מהצינור חרוט סטרילי 15 מ"ל ומערבבים עם 10 כחול tryphan µL. לספור את התאים באמצעות hemocytometer כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים בצינור חרוט 15 מ"ל.</li>
	<li>Centrifuge 15 mL חרוט עם תאים ב ~ 1,200 x g למשך 10 דקות, decant את תגובת שיקוע, resuspend תאי RPMI חמים-10-ריכוז של 80,000 µL תאים/30 של מדיה (2.66 x 106 תאים /mL).</li>
	<li>הסר את לוחית V-התחתון 96-ובכן של החממה (שלב 1.6), להעביר 30 µL של תאים K562 כל טוב של צלחת V-התחתון 96-ובכן, לערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 – 10 פעמים. להעביר את הצלחת התחתונה V 96-ובכן אינקובטור, תקופת דגירה לצלחת של 1שעות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות CO 5%2.</li>
	<li>לאחר המקננת עבור 1 h, הסר את לוחית V-התחתון 96-ובכן מן החממה צנטריפוגה ב ~ 1,200 x g למשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, decant המדיה מן הבארות מאת מתהפך לגמרי את הצלחת לתוך מיכל המכיל 10% מלבין.</li>
	<li>לשטוף את התאים היטב כל מאת resuspending אותם ב- 125 µL של RPMI חמים-10, לערבב היטב עם פיפטה ולאחר centrifuge את הצלחת ב g ~ 1,200 x עבור 5 דק Decant התקשורת על-ידי הפעלת את הצלחת במהופך לתוך מיכל המכיל 10% מלבין. חזור על שלב זה לשטוף פעמיים.</li>
	<li>לאחר הרחצה, להוסיף 100 µL חמים RPMI-10 לכל אחת, לערבב למעלה ולמטה עם pipet, דגירה את הצלחת. בשביל h 48-37 מעלות צלזיוס בנוכחות CO 5%2.</li>
</ol>2. יום 3
<ol><li>הסר את לוחית V-התחתון 96-ובכן המכיל 100 µL של תאים, מדיה/טוב מן החממה והעברתו אבטחה בארון. שימוש של פיפטה רב-ערוצי, לערבב התוכן של כל אחד טוב ולהעביר את התאים ואת מדיה 96 טוב U-תחתון צלחת או כדי הנקרא מראש 5 מ ל צינורות פוליפרופילן.</li>
	<li>לשטוף כל טוב ב 96-ובכן V-תחתית לצלחת עם µL 100% 1 Paraformaldehyde (PFA) ב- 1-פוספט Buffered מלוחים (PBS) והעברת הבארות בהתאמה גם צלחת U-התחתון או צינורות פוליפרופילן שכותרתו מ ל 96 מ שלב 2.1 להניב סופית ריכוז של 0.5% מחברים/טוב או ברכבת התחתית. לערבב ביסודיות באמצעות פיפטה רב-ערוצי עם כיסוי לצלחת עם נייר אלומיניום, תן לזה לנוח בחממה במשך 30 דקות לתקן את התאים.</li>
	<li>להכין את cytometer זרימה (ראה טבלה של חומרים לדוגמה) על-ידי הפעלת מוכתם K562 תאים כדי לכייל את הצד ופיזור קדימה יחד עם ההגדרות זריחה. הערוץ היחיד פלורסצנטיות הנדרש הוא FL1, כמו GFP היחידה ידי קרינה פלואורסצנטית הנפלט מהתאים. לרכוש ~ 30, 000 – 50,000 תאים מחלון כל דגימה. הערה: כל cytometer זרימה היכול לקרוא פלורסצנטיות יחיד יכול לשמש עבור רכישת הנתונים, כפי תאים נגועים RVPs רק פולט קרינה פלואורסצנטית ירוק בשל נוכחותם של ה-GFP, אין ערוץ פלורסצנטיות אחרים נדרשים.</li>
</ol>3. ניתוח נתונים
<ol><li>
ניתוח נתונים רכשה ב- cytometer זרימה באמצעות תוכנות ניתוח cytometry זרימה (ראה טבלה של חומרים).
	<ol>
<li>ערכת בשער הראשון מבוססת על FSC-A (קדמי פיזור – אזור) לעומת FSC-H (פיזור קדימה – גובה) כדי לכלול תאים בודדים או להשמיט אוטומטית-פלורסנט doublets ניתוח12. לאחר מכן, שער תאים ממותגת גופיה בהתבסס על האס-A (לצד פיזור – אזור) לעומת FSC-A כדי לא לכלול כל פסולת autofluorescent.</li>
		<li>לנתח האס-A לעומת תאים מגודרת FSC-A עבור הביטוי של GFP בהתבסס על האס-A vs GFP-א לקבוע את אחוז ה-GFP + תאים עבור כל דילול של הדוגמאות סרום ושליטה על-ידי הגדרת שער סביב GFP + התאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקבוע את האחוז הממוצע של GFP + תאים עבור כל דגימה בסרום שליטה בארות על-ידי חלוקת האחוז הכולל של GFP + בתאים הבארות triplicate ע י 3.</li>
	<li>לחשב קיפול-שיפור של זיהום על ידי חלוקת האחוז הממוצע של GFP + בתאים הדוגמאות סרום עבור כל דילול חלקי האחוז הממוצע של GFP + תאי ה-RPMI-10 עם RVPs (אין דוגמה סרום) שליטה וולס.</li>
	<li>גרף קיפול-שיפור (ציר y) נגד דילול (ציר x), ולבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות ANOVA ואחריו מבחן פוסט-הוק של Tukey להשוואות מרובות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prior+exposure+to+zika+virus+significantly+enhances+peak+dengue-2+viremia+in+rhesus+macaques.">Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques.</a> Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).</li><li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity,+cross-reactivity,+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection.">Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li><li>Mattia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+reporter+virus+particles+for+measuring+neutralizing+antibodies+against+each+of+the+four+dengue+serotypes.">Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes.</a> PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).</li><li>Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via, ., F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclass+specificity+of+the+Fc+receptor+for+human+IgG+on+K562.">Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562.</a> Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).</li><li>Klein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+K562+cell+line,+derived+from+a+patient+with+chronic+myeloid+leukemia.">Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia.</a> Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).</li><li>Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+growth+in+human+monocytes+as+a+risk+factor+for+dengue+hemorrhagic+fever.">Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever.</a> Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).</li><li>Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IgG+Fc+receptor+II+mediates+antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+infection.">Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection.</a> J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).</li><li>Wang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+antibodies+to+dengue+enhanced+for+FcgammaRIIIA+binding+determine+disease+severity.">IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity.</a> Science. 355 (6323), 395-398 (2017).</li><li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans.">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li><li>Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus-induced+antibody+response+enhances+dengue+virus+serotype+2+replication+in+vitro.">Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro.</a> J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).</li><li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies.">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).</li><li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine+reactive+dyes:+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry.">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li><li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+Cell+responses+during+secondary+dengue+virus+infection+are+dominated+by+highly+cross-reactive,+memory-derived+plasmablasts.">B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts.</a> J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).</li><li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus.">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

Flaviviruses כגון DENV ו- ZIKV לשתף עדויות משמעותיות של הומולוגיה בחלבונים שני שלהם מבניים שאינן מבניות המייצרים נוגדנים cross-react אחד עם השני13,14. תגובות cross-reactive נוגדנים אלה הוכחו לשפר לזיהום הן ויוו והן במבחנה עם heterologous serotype או אחרים הקשורים flaviviruses1<...

נוגדן התלויים שיפור (איד) של זיהום הוא תהליך לפיה תגובות נוגדנים cross-reactive חלקית המושרה על ידי serotype של וירוס משפר ספיגת של serotype נוספת של וירוס, המוביל שכפול ויראלי מוגברת viremia. אייד תועד בהרחבה דנגה זיהומים וירוס (DENV) שבו ארבע הגדולות אשר נגרמו מהזנים אליהם גם הם נפוצים. בקבוצת משנה של חולים, אייד משויכת קדחת דנגה מדמם (DHF). לאחרונה הראינו כי זיהום בנגיף (ZIKV) Zika המושרה רמות גבוהות באופן משמעותי של תגובות נוגדנים cross-reactive DENV גרם אייד של DENV חוץ גופית בתוך , סביר להניח תרמו שיפור DENV viremia in vivo1 , 2. מבחני שיפור התלויים נוגדנים הם כלי חשוב כדי להעריך את הקיבולת של נוגדנים כדי לשפר את זיהום משני עם וירוסים הקשורים ואת לספק תובנות לתוך בפתוגנזה של זיהומים flavivirus ליידע פיתוח חיסונים.
וזמינותו המתוארים כאן משתמש DENV RVPs יחד עם תאים K562, כי הם בדרך כלל שבידנו לזיהום. RVPs הם שכפול מבנית כשירים DENV חלקיקים נגיפיים אשר קידוד של replicon תת-גנומית חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הבאה לידי ביטוי לאחר סבב אחד של שכפול3. ככזה, תאים נדבקים בנגיף RVPs לזרוח ירוק, ניתן בקלות להבחין באמצעות cytometry זרימה או מיקרוסקופ. RVPs בשימוש assay זו התקבלו ממקורות מסחריים. הם יכולים, לעומת זאת, להיות שנוצר נגד וירוסים אחרים, המשמשים וזמינותו המתואר בכתב היד. בינתיים, תאים K562 הם FcγIII-קולטן-הבעת ' לוקמיה תא קו לאגד האזור Fc של נוגדנים, להידבק בנוכחות תת נטרול ריכוזים של נוגדן4,5.
מבחני אייד שימשו בהרחבה מחקרים חוקרת את גורמי הסיכון עבור דנגה חמור וכדי ניסחו את המנגנונים של במבחנה אייד6,7,8. וזמינותו אייד המתוארים כאן יכול בקלות ובמהירות לשמש כדי לקבוע את הקיבולת של נסיוב flow cytometry, לעומת שאר מבחני בשימוש כיום, אשר דורשים גם הקביעה של פלאק ויוצרים ולשפר במבחנה זיהום באמצעות RVPs יחידות (pfu) ורו תאים או נוגדן כתמים נגוע תאים6,7,8,9,10,11, שניהם נמצאים זמן רב ודיני אינטנסיבית.

<table><tbody><tr><td>DENV 1-4 RVP</td><td>Integral Molecular</td><td>RVP-501</td><td></td></tr><tr><td>K562 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE lifesceinces</td><td>SH 30910.03</td><td>10% FBS in RPMI-10</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>MP biomedicals</td><td>1670049</td><td>100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellegro</td><td>25-060-Cl</td><td>0.025M in RPMI-10</td></tr><tr><td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100&amp;times;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>1x in RPMI-10</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Cellegro</td><td>25-000-Cl</td><td>1mM in RPMI-10</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25005CI&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile V-bottom plates</td><td>Thomas Scientific</td><td>333-8001-01V</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>Non-sterile U-bottom plates</td><td>Falcon</td><td>Ref 353910</td><td>A high throughput alternative to FACS tubes</td></tr><tr><td>5mL, sterile, serological pipette</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>200uL sterile pipette tips</td><td>Denville</td><td>P3020 CPS</td><td></td></tr><tr><td>20uL sterile pipette tips</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>50-200uL multichannel pipette</td><td>Denville</td><td>P3975-8-B</td><td></td></tr><tr><td>5-50uL multichannel pipette</td><td>Denville</td><td>P3975-9-B</td><td></td></tr><tr><td>20% formadehyde</td><td>Tousimis</td><td>&amp;nbsp;#1008B</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>ThermoFisher</td><td>TSCOL35</td><td></td></tr><tr><td>thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>2231000387</td><td>An alternative to a waterbath for heat inactivation</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>ThermoFisher</td><td>13-998-213</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Bleach</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo 9.8</td><td>TreeStar, Inc.</td><td></td><td>Flow cytometry analysis software</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 6.1.2</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II flow cytometer</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Bleach</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple flow cytometry based assay to determine in vitro antibody dependent enhancement of dengue virus using zika virus convalescent serum

שיפור התלויים נוגדנים לזיהום הוכח לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה נגיפי קדחת דנגה. מבחני מסורתי המודדים את הקיבולת של נוגדנים או סרום כדי לשפר הידבקות שורות תאים שבידנו צריכים לסמוך על באמצעות פלט ויראלי בתקשורת ואחריו פלאק מבחני לכמת זיהום. לאחרונה, מבחני אלו בחנו דנגה זיהום בנגיף (DENV) בשורות תאים באמצעות נוגדנים fluorescently עם תוויות. שתי גישות אלה יש מגבלות שמגבילות את השימוש הנרחב של טכניקות אלה. כאן, אנו מתארים assay פשוט במבחנה באמצעות דנגה כתב ויראלי חלקיקי וירוס (RVPs) המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק ותאים K562 לבדוק נוגדנים התלויים שיפור (איד) של זיהום DENV השימוש סרום זה היה המתקבלים רזוס קופי מקוק 16 שבועות לאחר ההדבקה בנגיף Zika (ZIKV). טכניקה זו הוא אמין, כרוך מניפולציה מינימלי של תאים, אינו כרוך השימוש של וירוס המוסמכת שכפול בשידור חי, יכול להתבצע בתבנית תפוקה גבוהה כדי לקבל בדיקה כמותית באמצעות cytometry זרימה. בנוסף, וזמינותו זו ניתן להתאים בקלות לבדוק נוגדנים התלויים שיפור (איד) של זיהומים נוספים flavivirus כגון נגיף קדחת צהובה (YFV), וירוס. קדחת מוח הסוסים יפני (JEEV), וירוס הנילוס המערבי (WNV) שבו זמינות RVPs וכו. הקלות של הגדרת וזמינותו, ניתוח הנתונים, ופרשנות תוצאות הופך לבצע רוב ההגדרות מעבדה.

שרה מ 4 רזוס קופי מקוק היו שנאספו 16 שבועות לאחר ההדבקה עם ZIKV ונבדק את הפוטנציאל שלהם לשפר את DENV-1, 2, 3 ו 4 זיהום בתאים K562. החיות היו נגיפי ~ 1 x 105 עותקים של RNA ZIKV/mL של פלסמה ביום 3 לאחר זיהום ירדו לרמות שהיו מתחת לגבול של זיהוי על ידי 7 ימים לאחר ההדבקה. Viremia לא זוהה הפלזמה-16 שבו...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum at JoVE.com

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

אנו מתארים פרוטוקול פשוט וקל למדידת שיפור התלויים נוגדנים לזיהום על ידי Zika וירוס הבראה בנסיוב באמצעות וירוס דנגה כתב נגיפים.

Cytometry זרימה פשוטים מבוסס Assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה Zika וירוס

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

a-simple-flow-cytometry-based-assay-to-determine-vitro-antibody

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

8.7K Views.  Uniformed Services University. אנו מתארים פרוטוקול פשוט וקל למדידת שיפור התלויים נוגדנים לזיהום על ידי Zika וירוס הבראה בנסיוב באמצעות וירוס דנגה כתב נגיפים.

Video: A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different downstream patient-to-patient transmission potentials, and require very different patient treatments. Thus, recent Zika outbreaks make it urgent to develop tools that rapidly discriminate these viruses in patients and trapped mosquitoes, to select the correct patient treatment, and to understand and manage their epidemiology in real time.
Unfortunately, current diagnostic tests, including those receiving 2016 emergency use authorizations and fast-track status, detect viral RNA by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), which requires instrumentation, trained users, and considerable sample preparation. Thus, they must be sent to &#34;approved&#34; reference laboratories, requiring time. Indeed, in August 2016, the Center for Disease Control (CDC) was asking pregnant women who had been bitten by a mosquito and developed a Zika-indicating rash to wait an unacceptable 2 to 4 weeks before learning whether they were infected. We very much need tests that can be done on site, with few resources, and by trained but not necessarily licensed personnel.
This video demonstrates an assay that meets these specifications, working with urine or serum (for patients) or crushed mosquito carcasses (for environmental surveillance), all without much sample preparation. Mosquito carcasses are captured on paper carrying quaternary ammonium groups (Q-paper) followed by ammonia treatment to manage biohazards. These are then directly, without RNA isolation, put into assay tubes containing freeze-dried reagents that need no chain of refrigeration. A modified form of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with target-specific fluorescently tagged displaceable probes produces readout, in 30 min, as a three-color fluorescence signal. This is visualized with a handheld, battery-powered device with an orange filter. Forward contamination is prevented with sealed tubes, and the use of thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG) in the presence of dUTP in the amplification mixture.

Current multiplexed diagnostics to detect Zika, chikungunya, and dengue viruses require complex sample preparation and expensive instrumentation, and are difficult to use in low resource environments. We show a diagnostic that uses isothermal amplification with target-specific strand displaceable probes to detect and differentiate these viruses with high sensitivity and specificity.

הגברה איזותרמי מרובבת מבוסס פלטפורמת אבחון לאיתור Zika Chikungunya, קדחת דנגה 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

Biochemistry

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

גילוי ספציפי וירוס Zika Epitope אבחון

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1- / -

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

כימות של נוגדנים תלויי שיפור של הנגיף Zika בתאי אדם ראשי

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral load. The purpose of the procedure is to quantify viral titers in peripheral and CNS areas of the mouse at different time points post infection or under different experimental conditions to identify virologic and immunological factors that regulate Zika virus infection. The organ isolation procedures demonstrated allow for both focus forming assay quantification and quantitative PCR assessment of viral titers. The rapid organ isolation techniques are designed for the preservation of virus titer. Viral titer quantification by focus forming assay allows for the rapid throughput assessment of Zika virus. The benefit of the focus forming assay is the assessment of infectious virus, the limitation of this assay is the potential for organ toxicity reducing the limit of detection. Viral titer assessment is combined with quantitative PCR, and using a recombinant RNA copy control viral genome copy number within the organ is assessed with low limit of detection. Overall these techniques provide an accurate rapid high throughput method for the analysis of Zika viral titers in the periphery and CNS of Zika virus infected animals and can be applied to the assessment of viral titers in the organs of animals infected with most pathogens, including Dengue virus.

The goal of the protocol is to demonstrate the techniques used to investigate viral disease by isolating and quantifying Zika virus, from multiple organs in a mouse following infection.

בידוד וקוונפיקציה של וירוס Zika ממספר איברים בעכבר

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and potentially Guillain-Barr&#233; syndrome in adults. Research on ZIKV to understand the disease mechanisms is important to facilitate vaccine and treatment development. The method of quantifying viruses is crucial and fundamental in the field of virology. The focus forming assay (FFA) is a virus quantification assay that detects the viral antigen with antibodies and identifies the infection foci of cells using the peroxidase immunostaining technique. The current study describes the virus propagation and quantification protocol using both 24-well and 96-well (high throughput) formats. Compared with other similar studies, this protocol has further described foci size optimization, which can serve as a guide to expand the use of this assay for other viruses. Firstly, ZIKV propagation is performed in Vero cells for 3 days. The culture supernatant containing ZIKV is harvested and quantitated using the FFA. Briefly, the virus culture is inoculated onto Vero cells and incubated for 2-3 days. Foci formation is then determined after optimized staining processes, including cell fixation, permeabilization, blocking, antibody binding, and incubation with peroxidase substrate. The stained virus foci are visualized using a stereo microscope (manual counting in 24-well format) or software analyzer (automated counting in 96-well format). The FFA provides reproducible, relatively fast results (3-4 days) and is suitable to be used for different viruses, including non-plaque-forming viruses. Subsequently, this protocol is useful for the study of ZIKV infection and could be used to detect other clinically important viruses.

The present protocol describes the propagation of Zika virus (ZIKV) in Vero African green monkey kidney cells and the quantification of ZIKV using cell-based colorimetric immunodetection methods in 24-well and 96-well (high throughput) formats.

התפשטות וירוסים וכימות קולורימטרי מבוסס תאים

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

Cell-Based Electrical Impedance Platform to Evaluate Zika Virus Inhibitors in Real Time

Cell-based electrical impedance (CEI)&#160;technology measures changes in impedance caused by a growing or manipulated adherent cell monolayer on culture plate wells embedded with electrodes. The technology can be used to monitor the consequences of Zika virus (ZIKV) infection and adherent cell replication in real time, as this virus is highly cytopathogenic. It is a straightforward assay that does not require the use of labels or invasive methods and has the benefit of providing real-time data. The kinetics of ZIKV infection are highly dependent on the employed cell line, virus strain, and multiplicity of infection (MOI), which cannot be easily studied with conventional endpoint assays. Furthermore, the CEI assay can also be used for the evaluation and characterization of antiviral compounds, which can also have dynamic inhibitory properties over the course of infection. This methods article gives a detailed explanation of the practical execution of the CEI assay and its potential applications in ZIKV research and antiviral research in general.

Here, we demonstrate the use of cell-based electrical impedance (CEI) as a very easy and straightforward method to study Zika virus infection and replication in human cells in real time. Furthermore, the CEI assay is useful for the evaluation of antiviral compounds.

פלטפורמת עכבה חשמלית מבוססת תאים להערכת מעכבי נגיף זיקה בזמן אמת

Cell-based electrical impedance (CEI)&#160;technology measures changes in impedance caused by a growing or manipulated adherent cell monolayer on culture ...

An In Vitro Assay for Screening Interferons as Potent Inhibitors of Zika Virus Growth

Source: Contreras, D. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54767">Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The video demonstrates an in vitro assay for screening interferons with antiviral activity against the Zika virus, a human pathogen. Within the host cell, the Zika virus undergoes multiplication upon internalization, infecting neighboring cells and creating distinct zones or viral plaques. Type I interferon, acting as an antiviral agent, hinders virus multiplication, thereby preventing the formation of viral plaques in the host cell monolayer.

בדיקת מבחנה לבדיקת אינטרפרונים כמעכבים חזקים של צמיחת נגיף זיקה

1. Screening Cytokine Library against Zika Virus Infection

	Seed naive Vero cells at 1 x 105 cells per well using a 12-well plate. Once the cells are ...

Cytometry זרימה פשוטים מבוסס Assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה Zika וירוס

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video