Name: a simple flow cytometry based assay to determine in vitro antibody dependent enhancement of dengue virus using zika virus convalescent serum
Uploaded: 2018-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
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記載されているプロジェクトは、JJM に健康科学の制服サービス大学からの資金によって支えられました。著者のプライベートなものは、意見またはアサーション記載する解釈として公式または反射防衛省、健康科学の制服サービス大学や米国の他の機関の見解ではないです。政府は。
WGV すべての実験を行いデータを分析JJM 設計し、試験を監督ニシコククジラ、JJM 紙を書いた。

ここで説明されたプロトコルを示すために使用する血清サンプルは評価・実験動物ケアの認定会で収容されたローカルの状態に従っての世話と連邦の方針であったアカゲザルから得られました。国際 (AAALAC)-施設を認定します。すべての動物実験したレビューし、機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され共有プロトコル組織のサンプルが買収されました。
1 日 1
注: 次の BSL 2 実験室での培養に使用される滅菌流バイオのキャビネットで説明すべての手順に従います。
<ol><li>室温で血清サンプルを解凍し、各血清試料 100 μ L を生殖不能の管に転送します。水浴または温度調整可能な thermomixer で 56 ° C で 30 分間熱を不活性化します。冷たい RPMI 10 (10% 牛胎児血清を RPMI) を使用して縮尺を 1:1 に至る血清サンプルの 10 倍のシリアル希薄を作る。</li>
	<li>滅菌 96 ウェル V 底プレートの各ウェルに 10 μ L の血清を希釈したサンプルを転送します。だけと、血清サンプルと RPMI 10 のみ RVPs と血清サンプルなしなし制御井戸、RPMI-10 RVPs との 2 つのセットが含まれます。各血清サンプルとトリプリケートで RPMI 10 コントロールを設定します。</li>
	<li>-80 ° C の冷凍庫と雪解けからデング熱 1、2、3、4 の RVPs を削除するそれらを 37 ° C の水浴。すぐに氷の融解の RVPs に転送します。各血清サンプルの約 170 μ L RVPs を取得 (各血清希釈用 RVPs x 3 井戸の 10 μ L (1:1、1:10, 1: 100, 1:1, 000) ごとに RVP を RPMI 10 RVPs x 3 井戸の 10 μ L は井戸を制御するだけと)。</li>
	<li>各血清サンプルを含む 96 ウェル V 底板のもと RVPs (血清ない) コントロール井戸を RPMI 10 に RVPs の 10 μ L をピペットします。RVPs RPMI 10 だけに (ない血清サンプルとない RVP) 井戸を追加しないでください。上下にピペッティングして徹底的にミックス 5-10 回。10 μ l 添加冷 (ない血清サンプルとない RVP) 制御井戸のみ各冷たい RPMI 10 に RVPs の代わりに RPMI 10。</li>
	<li>96 ウェル V 底プレートをインキュベーターに転送し、プレートを 5% CO2の存在下で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。96 ウェル V 底プレートを培養すると、一方バイオ セーフティの 70% のエタノールでキャビネットの表面をきれいにし、15 分間紫外線を実行します。</li>
	<li>インキュベーターから K562 細胞の完全に合流 T75 フラスコを削除、5 mL の滅菌ピペットを使用してセルをミックスし、セルの 5 mL を滅菌 15 mL の円錐管に転送します。 注: K562 細胞を RPMI 10 で維持し、1 x 106/mL で継代します。</li>
	<li>滅菌 15 mL の円錐管から 10 μ L のセルを削除することによって細胞の数を数えるし、10 μ L tryphan ブルー ミックスします。15 mL コニカル チューブ内のセルの合計数を決定するための診断を使用してセルをカウントします。</li>
	<li>10 分間 〜 1,200 x g で細胞と円錐形の 15 mL を遠心、上清をデカント、暖かい RPMI - 10 メディア (2.66 × 106セル/mL) の 80,000 のセル/30 μ L の濃度で細胞を再懸濁します。</li>
	<li>インキュベーター (ステップ 1.6) から 96 ウェル V 底板を削除、96 ウェル V 底プレートの各ウェルに K562 細胞の 30 μ L を転送し、上下にピペッティングして徹底的にミックス 5-10 回。96 ウェル V 底プレートをインキュベーターに転送し、プレートを 5% CO2の存在下で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>1 時間インキュベート後 5 分のインキュベーターと 〜 1,200 × g で遠心分離から 96 ウェル V 底プレートを削除します。遠心分離の後に、10% の漂白剤を含むコンテナーにプレートを逆さま回すことによって井戸からメディアをデカントします。</li>
	<li>暖かい RPMI 10 125 μ L でそれらを再各ウェルの細胞を洗い、ピペット、徹底的に混ぜて、10% 漂白剤を含むコンテナーにプレートを逆さま回すことによって ~ 1,200 x g で 5 分間デカント メディアでプレートを遠心します。この洗浄ステップを 2 回繰り返します。</li>
	<li>洗浄後、それぞれに RPMI 10、上下をピペットで移しなさい、ミックス暖かいの 100 μ L を追加し、5% CO2の存在下で 37 ° C で 48 h 用プレートを孵化させなさい。</li>
</ol>2 日目 3
<ol><li>細胞とメディア/ウェル インキュベーターから 100 μ L を含む 96 ウェル V 底板を削除し、バイオ セーフティ キャビネットに移動します。ミックス、マルチ チャンネル ピペットを使用してそれぞれの内容もセルを転送し、96 ウェル U 底面にメディア プレート済みラベル付き 5 mL ポリプロピレン チューブ。</li>
	<li>1% の 100 μ L で 96 ウェル V 底プレートの各ウェルを洗浄パラホルムアルデヒド (PFA) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) そして最終をもたらすステップ 2.1 から 96 ウェル U 底プレートまたはラベル付き 5 mL ポリプロピレン チューブにそれぞれの井戸に転送 × 1濃度 0.5 %pfa/ウェルまたは管。マルチ チャンネル ピペットを使用して徹底的にミックス、カバー プレート、アルミ箔を 30 分セルを修正するためのインキュベーター内に座らせてください。</li>
	<li>準備流れの cytometer (例えば材料のテーブルを見なさい) 無染色の K562 細胞側と前方散乱と蛍光設定のキャリブレーションを実行することによって。必要なだけ蛍光チャネルは、GFP は、細胞から放出される唯一の蛍光 FL1、です。取得 ~ 30, 000-50,000 各サンプルからの細胞します。 メモ: 単一蛍光を読み取ることができる任意の流れの cytometer は、RVPs 感染細胞が GFP の存在のために緑の蛍光を放出するのみ、他の蛍光チャネルを必要としない、データの集録に使用できます。</li>
</ol>3. データ分析
<ol><li>
流れフローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用して流れの cytometer で取得したデータを分析 (材料の表を参照してください)。
	<ol>
<li>セット最初のゲートは対 FSC H (前方散乱-高さ) を単一細胞分析12から自動蛍光ダブレットを含めたり除外する FSC A (前方散乱-エリア) に基づいています。その後、SSC A に基づいて一重項ゲート セルをゲート (側方散乱-エリア) vs される破片を除外する FSC の。</li>
		<li>SSC A 対 FSC A ゲート細胞を分析する SSC の対に基づく GFP の表現 GFP A.GFP 陽性細胞の周りにゲートを設定することによって各希釈血清とコントロール サンプルの GFP 陽性細胞の割合を決定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>帳票の井戸の GFP 陽性細胞の割合の合計を 3 で除して各血清サンプルの希釈やコントロール井戸の GFP 陽性細胞の割合の平均値を決定します。</li>
	<li>RVPs (血清サンプルはない) コントロール井戸を RPMI 10 の GFP 陽性細胞の割合の平均値で割った各希釈血清サンプルで GFP 陽性細胞の割合の平均値を割ることによって感染の倍充実を計算します。</li>
	<li>希釈 (x 軸)、対倍強化 (y 軸) をグラフし、多重比較のためのテューキー事後テスト続いて ANOVA を使用して統計分析を実行します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prior+exposure+to+zika+virus+significantly+enhances+peak+dengue-2+viremia+in+rhesus+macaques.">Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques.</a> Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).</li><li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity,+cross-reactivity,+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection.">Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li><li>Mattia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+reporter+virus+particles+for+measuring+neutralizing+antibodies+against+each+of+the+four+dengue+serotypes.">Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes.</a> PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).</li><li>Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via, ., F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclass+specificity+of+the+Fc+receptor+for+human+IgG+on+K562.">Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562.</a> Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).</li><li>Klein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+K562+cell+line,+derived+from+a+patient+with+chronic+myeloid+leukemia.">Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia.</a> Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).</li><li>Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+growth+in+human+monocytes+as+a+risk+factor+for+dengue+hemorrhagic+fever.">Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever.</a> Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).</li><li>Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IgG+Fc+receptor+II+mediates+antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+infection.">Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection.</a> J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).</li><li>Wang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+antibodies+to+dengue+enhanced+for+FcgammaRIIIA+binding+determine+disease+severity.">IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity.</a> Science. 355 (6323), 395-398 (2017).</li><li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans.">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li><li>Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus-induced+antibody+response+enhances+dengue+virus+serotype+2+replication+in+vitro.">Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro.</a> J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).</li><li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies.">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).</li><li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine+reactive+dyes:+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry.">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li><li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+Cell+responses+during+secondary+dengue+virus+infection+are+dominated+by+highly+cross-reactive,+memory-derived+plasmablasts.">B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts.</a> J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).</li><li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus.">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

DENV や ZIKV などの発現は、両方の構造および非構造タンパク質13,14お互いと交差反応する抗体を生成する相同性の重要な証拠を共有します。これらの交差反応性抗体応答を高めるために示されている感染症の両方との in vitro異種血清または他関連発現1,2。クロスの感染を高める可能性のある?...

感染症の抗体依存強化 (ADE) は、ウイルスの血清型による部分的に交差反応性抗体がウイルス、高められたウイルスの複製とウイルス血症につながる他の血清型の取り込みを強化するというプロセスです。ADE は、広く 4 つの主要な血清型が流行しているデング熱ウイルス (DENV) 感染症に記載されています。患者のサブセット、ADE はデング出血熱 (DHF) に関連付けられています。ジカ ウイルス (ZIKV) の感染誘導 DENV ADE体外を引き起こし、DENV生体内でウイルス血症1の強化に貢献した DENV 交差反応性抗体の有意に高い値であることが最近分かった,2抗体依存強化試金、関連ウイルスの二次感染を強化とフラビ ウイルス感染症の発症機序に貴重な洞察力を提供し、通知に対する抗体の能力を評価する貴重なツール、。ワクチンの開発。
説明アッセイは、ここが感染症に通常許容 K562 細胞と一緒に DENV RVPs を使用します。RVPs が構造的にそのまま複製無能 DENV ウイルス粒子レプリケーション3の単一のラウンドの後に表示されるサブ ゲノム緑色蛍光タンパク質 (GFP) レプリコンをエンコードします。など、RVPs に感染している細胞は緑色の蛍光を発する、フローサイトメトリーや顕微鏡を使用して容易に検出することができます。この試金で使用される RVPs は、商業ソースから得られました。あってもいい、しかし、他のウイルスに対して生成され、本稿に記載されている試金で使用されます。一方、K562 細胞、抗体の Fc 領域に結合し、サブ中和抗体4、5の濃度の存在下で感染 FcγIII 受容体発現の白血病細胞株であります。
ADE の試金は体外ADE のメカニズムを記述する重症のデング熱の危険因子を調査し、研究で広く使用されている6,7,8。ここで説明した ADE アッセイ迅速かつ簡単に使える RVPs を使用して生体外で感染を強化し、フローサイトメトリー、現在、使用していずれかを必要とする他の試金と比較してプラーク形成による血清の容量を決定するにはVero 細胞や抗体の汚損の単位 (pfu) 感染細胞6,7,8,9,10、11、どちらも時間がかかり、労働集中的です。

<table><tbody><tr><td>DENV 1-4 RVP</td><td>Integral Molecular</td><td>RVP-501</td><td></td></tr><tr><td>K562 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE lifesceinces</td><td>SH 30910.03</td><td>10% FBS in RPMI-10</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>MP biomedicals</td><td>1670049</td><td>100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellegro</td><td>25-060-Cl</td><td>0.025M in RPMI-10</td></tr><tr><td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100&amp;times;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>1x in RPMI-10</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Cellegro</td><td>25-000-Cl</td><td>1mM in RPMI-10</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25005CI&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile V-bottom plates</td><td>Thomas Scientific</td><td>333-8001-01V</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>Non-sterile U-bottom plates</td><td>Falcon</td><td>Ref 353910</td><td>A high throughput alternative to FACS tubes</td></tr><tr><td>5mL, sterile, serological pipette</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>200uL sterile pipette tips</td><td>Denville</td><td>P3020 CPS</td><td></td></tr><tr><td>20uL sterile pipette tips</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>50-200uL multichannel pipette</td><td>Denville</td><td>P3975-8-B</td><td></td></tr><tr><td>5-50uL multichannel pipette</td><td>Denville</td><td>P3975-9-B</td><td></td></tr><tr><td>20% formadehyde</td><td>Tousimis</td><td>&amp;nbsp;#1008B</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>ThermoFisher</td><td>TSCOL35</td><td></td></tr><tr><td>thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>2231000387</td><td>An alternative to a waterbath for heat inactivation</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>ThermoFisher</td><td>13-998-213</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Bleach</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo 9.8</td><td>TreeStar, Inc.</td><td></td><td>Flow cytometry analysis software</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 6.1.2</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II flow cytometer</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Bleach</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple flow cytometry based assay to determine in vitro antibody dependent enhancement of dengue virus using zika virus convalescent serum

感染症の抗体依存強化は、デング熱ウイルスの病因の主要な役割を果たすことに示されています。許容されない細胞の感染を強化する抗体や血清の容量を測定する伝統的なアッセイは、感染を定量化するプラクの試金に続いてメディアにウイルスの出力を使用してに頼ってきました。最近では、これらの試金は細胞を蛍光標識抗体を用いたデング ウイルス (DENV) 感染症を検討しています。これらの両方のアプローチには、これらの技術の広範な使用を制限する制限があります。ここでは、粒子を用いたデング ウイルス記者ウイルス (RVPs) 緑色蛍光蛋白質及び DENV 感染アカゲザルから得られた血清を用いた抗体依存強化 (ADE) を調べる K562 細胞を表す単純の in vitroアッセイについて述べるニホンザル ジカ (ZIKV) 感染後 16 週間。この手法は信頼性が高く、セルの最小の操作が含まれます、ライブ レプリケーション有能なウイルスの使用を含まない、フローサイトメトリーを用いた定量的な読み出しを取得する高スループット形式で実行することができます。さらに、このアッセイは、黄熱病ウイルス (YFV) 日本脳炎ウイルス (JEEV)、西ナイル ウイルス (WNV) など RVPs の利用など他のフラビ ウイルス感染症の抗体依存強化 (ADE) を調べる簡単に適合できます。アッセイのセットアップのしやすさ、データを分析し、結果の解釈になりますほとんどの実験室の設定に

4 リーサス macaques、マカク属 ZIKV 感染後収集した 16 週間をされ、その潜在的な DENV 1 を強化するテストの血清、K562 細胞における感染の 2、3、4。動物では、感染後 7 日で検出限界以下であったレベルに低下した感染後 3 日目に 〜 105枚 ZIKV RNA/mL プラズマの x 1 のピーク血を持っていた。16 週間感染後の血漿中ウイルス血症が見つかりませんでした。RVP アッセイ...

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A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

デング熱ウイルス記者ウイルス粒子を用いたジカ ウイルス回復期血清による抗体依存による感染症を測定するためのシンプルで簡単なプロトコルについて述べる。

単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデング ウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

a-simple-flow-cytometry-based-assay-to-determine-vitro-antibody

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

8.7K ビュー.  Uniformed Services University. デング熱ウイルス記者ウイルス粒子を用いたジカ ウイルス回復期血清による抗体依存による感染症を測定するためのシンプルで簡単なプロトコルについて述べる。

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Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different downstream patient-to-patient transmission potentials, and require very different patient treatments. Thus, recent Zika outbreaks make it urgent to develop tools that rapidly discriminate these viruses in patients and trapped mosquitoes, to select the correct patient treatment, and to understand and manage their epidemiology in real time.
Unfortunately, current diagnostic tests, including those receiving 2016 emergency use authorizations and fast-track status, detect viral RNA by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), which requires instrumentation, trained users, and considerable sample preparation. Thus, they must be sent to &#34;approved&#34; reference laboratories, requiring time. Indeed, in August 2016, the Center for Disease Control (CDC) was asking pregnant women who had been bitten by a mosquito and developed a Zika-indicating rash to wait an unacceptable 2 to 4 weeks before learning whether they were infected. We very much need tests that can be done on site, with few resources, and by trained but not necessarily licensed personnel.
This video demonstrates an assay that meets these specifications, working with urine or serum (for patients) or crushed mosquito carcasses (for environmental surveillance), all without much sample preparation. Mosquito carcasses are captured on paper carrying quaternary ammonium groups (Q-paper) followed by ammonia treatment to manage biohazards. These are then directly, without RNA isolation, put into assay tubes containing freeze-dried reagents that need no chain of refrigeration. A modified form of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with target-specific fluorescently tagged displaceable probes produces readout, in 30 min, as a three-color fluorescence signal. This is visualized with a handheld, battery-powered device with an orange filter. Forward contamination is prevented with sealed tubes, and the use of thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG) in the presence of dUTP in the amplification mixture.

Current multiplexed diagnostics to detect Zika, chikungunya, and dengue viruses require complex sample preparation and expensive instrumentation, and are difficult to use in low resource environments. We show a diagnostic that uses isothermal amplification with target-specific strand displaceable probes to detect and differentiate these viruses with high sensitivity and specificity.

多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

生化学

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

ジカウイルス感染細胞培養系と<em&gt;インビトロ</emインターフェロンの&gt;予防効果

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

免疫・感染学

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

ジカ特定診断エピトープの探索

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

ひと初代細胞におけるジカの抗体依存性強化の定量化

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral load. The purpose of the procedure is to quantify viral titers in peripheral and CNS areas of the mouse at different time points post infection or under different experimental conditions to identify virologic and immunological factors that regulate Zika virus infection. The organ isolation procedures demonstrated allow for both focus forming assay quantification and quantitative PCR assessment of viral titers. The rapid organ isolation techniques are designed for the preservation of virus titer. Viral titer quantification by focus forming assay allows for the rapid throughput assessment of Zika virus. The benefit of the focus forming assay is the assessment of infectious virus, the limitation of this assay is the potential for organ toxicity reducing the limit of detection. Viral titer assessment is combined with quantitative PCR, and using a recombinant RNA copy control viral genome copy number within the organ is assessed with low limit of detection. Overall these techniques provide an accurate rapid high throughput method for the analysis of Zika viral titers in the periphery and CNS of Zika virus infected animals and can be applied to the assessment of viral titers in the organs of animals infected with most pathogens, including Dengue virus.

The goal of the protocol is to demonstrate the techniques used to investigate viral disease by isolating and quantifying Zika virus, from multiple organs in a mouse following infection.

マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and potentially Guillain-Barr&#233; syndrome in adults. Research on ZIKV to understand the disease mechanisms is important to facilitate vaccine and treatment development. The method of quantifying viruses is crucial and fundamental in the field of virology. The focus forming assay (FFA) is a virus quantification assay that detects the viral antigen with antibodies and identifies the infection foci of cells using the peroxidase immunostaining technique. The current study describes the virus propagation and quantification protocol using both 24-well and 96-well (high throughput) formats. Compared with other similar studies, this protocol has further described foci size optimization, which can serve as a guide to expand the use of this assay for other viruses. Firstly, ZIKV propagation is performed in Vero cells for 3 days. The culture supernatant containing ZIKV is harvested and quantitated using the FFA. Briefly, the virus culture is inoculated onto Vero cells and incubated for 2-3 days. Foci formation is then determined after optimized staining processes, including cell fixation, permeabilization, blocking, antibody binding, and incubation with peroxidase substrate. The stained virus foci are visualized using a stereo microscope (manual counting in 24-well format) or software analyzer (automated counting in 96-well format). The FFA provides reproducible, relatively fast results (3-4 days) and is suitable to be used for different viruses, including non-plaque-forming viruses. Subsequently, this protocol is useful for the study of ZIKV infection and could be used to detect other clinically important viruses.

The present protocol describes the propagation of Zika virus (ZIKV) in Vero African green monkey kidney cells and the quantification of ZIKV using cell-based colorimetric immunodetection methods in 24-well and 96-well (high throughput) formats.

ウイルス増殖と細胞ベースの比色定量

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

Cell-Based Electrical Impedance Platform to Evaluate Zika Virus Inhibitors in Real Time

Cell-based electrical impedance (CEI)&#160;technology measures changes in impedance caused by a growing or manipulated adherent cell monolayer on culture plate wells embedded with electrodes. The technology can be used to monitor the consequences of Zika virus (ZIKV) infection and adherent cell replication in real time, as this virus is highly cytopathogenic. It is a straightforward assay that does not require the use of labels or invasive methods and has the benefit of providing real-time data. The kinetics of ZIKV infection are highly dependent on the employed cell line, virus strain, and multiplicity of infection (MOI), which cannot be easily studied with conventional endpoint assays. Furthermore, the CEI assay can also be used for the evaluation and characterization of antiviral compounds, which can also have dynamic inhibitory properties over the course of infection. This methods article gives a detailed explanation of the practical execution of the CEI assay and its potential applications in ZIKV research and antiviral research in general.

Here, we demonstrate the use of cell-based electrical impedance (CEI) as a very easy and straightforward method to study Zika virus infection and replication in human cells in real time. Furthermore, the CEI assay is useful for the evaluation of antiviral compounds.

ジカウイルス阻害剤をリアルタイムで評価するための細胞ベースの電気インピーダンスプラットフォーム

Cell-based electrical impedance (CEI)&#160;technology measures changes in impedance caused by a growing or manipulated adherent cell monolayer on culture ...

An In Vitro Assay for Screening Interferons as Potent Inhibitors of Zika Virus Growth

Source: Contreras, D. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54767">Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The video demonstrates an in vitro assay for screening interferons with antiviral activity against the Zika virus, a human pathogen. Within the host cell, the Zika virus undergoes multiplication upon internalization, infecting neighboring cells and creating distinct zones or viral plaques. Type I interferon, acting as an antiviral agent, hinders virus multiplication, thereby preventing the formation of viral plaques in the host cell monolayer.

ジカウイルス増殖の強力な阻害剤としてのインターフェロンをスクリーニングするためのIn vitroアッセイ

1. Screening Cytokine Library against Zika Virus Infection

	Seed naive Vero cells at 1 x 105 cells per well using a 12-well plate. Once the cells are ...

単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデングウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法

要約

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この動画の章

多重等温増幅ベースジカ、チクングニアウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

ジカウイルス感染細胞培養系と

ジカ特定診断エピトープの探索

ジカウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1^-/-マウスの T 細胞応答の評価

ひと初代細胞におけるジカの抗体依存性強化の定量化

マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊のベクターコンピテンス分析

ウイルス増殖と細胞ベースの比色定量

ジカウイルス阻害剤をリアルタイムで評価するための細胞ベースの電気インピーダンスプラットフォーム

ジカウイルス増殖の強力な阻害剤としてのインターフェロンをスクリーニングするためのIn vitroアッセイ

単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデング ウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法

要約

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多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

ジカウイルス感染細胞培養系と

ジカ特定診断エピトープの探索

ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

ひと初代細胞におけるジカの抗体依存性強化の定量化

マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

ウイルス増殖と細胞ベースの比色定量

ジカウイルス阻害剤をリアルタイムで評価するための細胞ベースの電気インピーダンスプラットフォーム

ジカウイルス増殖の強力な阻害剤としてのインターフェロンをスクリーニングするためのIn vitroアッセイ

単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデングウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法

多重等温増幅ベースジカ、チクングニアウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

ジカウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1^-/-マウスの T 細胞応答の評価

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊のベクターコンピテンス分析